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排序：

大环内酯类耐药对猪链球菌的适应性代价研究

大环内酯类耐药对猪链球菌的适应性代价研究

引用

中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会

作者：商可心黄金虎王丽平南京农业大学动物医学院

(目的)研究大环内酯类耐药对猪链球菌的适应性代价。（方法）本试验挑选4株不同来源的大环内酯类敏感猪链球菌作为研究对象,用红霉素、阿奇霉素及泰乐菌素分别对受试敏感菌株进行体外诱导耐药;然后对获得的高水平耐药菌株的耐药表型和... 详细信息

(目的)研究大环内酯类耐药对猪链球菌的适应性代价。（方法）本试验挑选4株不同来源的大环内酯类敏感猪链球菌作为研究对象,用红霉素、阿奇霉素及泰乐菌素分别对受试敏感菌株进行体外诱导耐药;然后对获得的高水平耐药菌株的耐药表型和基因突变型进行检测;最后通过配对竞争试验评价高水平耐药菌相对亲本株的适应性。（结果）结果发现:诱导所得的所有高水平耐药菌的23S rRNA都存在位点突变,主要突变为A2059G、A2058T、G2057A、A2062C和C2611A,部分菌株存在L4(Q67R;R72G、IuS7SQ;A73T、InS8WPQK)及L22的位点突变(G95D、A97V、DelPTL、K87Q)。对所有的亲本株和耐药菌株进行体内及体外适应性分析发现,发生突变的高水平耐药菌的适应性与其亲本株相比大多数出现适应性下降,仅H12、H14、A12三株突变菌株体内适应性显著上升,而这三株菌均在23S rRNA基因的A2059处发生突变,其中ZY05721诱导得到的两株耐药突变菌株体内适应性升高,其余突变菌株体内及体外适应性均显著下降。（结论）上述结果提示在23SrRNA基因的各突变位点中,A2059位点突变未对ZY05721菌株产生适应性代价,且会提高突变菌株的在机体内的适应性;而G2057、A2062位点的突变会对宿主菌产生高适应性代价。

关键词：猪链球菌大环内酯类耐药靶位基因突变适应性代价

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纳米银诱发细胞毒性的作用机制

纳米银诱发细胞毒性的作用机制

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中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会

作者：郭大伟王丽平南京农业大学动物医学院兽医药理学与毒理学研究室

纳米银由于良好的抗菌性能成为商业化程度最高的纳米材料,广泛应用于纺织品、食品包装材料、日化用品、牙菌斑和创伤感染治疗等领域。在兽医领域也具有广泛的应用潜力,研究显示纳米银对奶牛乳房炎、奶牛子宫内膜炎、鸡球虫、猪传染性胃... 详细信息

纳米银由于良好的抗菌性能成为商业化程度最高的纳米材料,广泛应用于纺织品、食品包装材料、日化用品、牙菌斑和创伤感染治疗等领域。在兽医领域也具有广泛的应用潜力,研究显示纳米银对奶牛乳房炎、奶牛子宫内膜炎、鸡球虫、猪传染性胃肠炎病毒、新城疫病毒、流感病毒H1N1等也具有良好的疗效。然而其细胞毒性较强,极大的限制了其临床应用。因此,深入研究纳米银细胞毒性机制是纳米银研究领域的焦点。我们的前期研究证实聚乙烯吡咯烷酮（PVP）包覆的纳米银对多药耐药大肠杆菌具有良好的抗菌疗效,也能有效抑制髓系白血病细胞的增殖,与芬维A胺联用可以协同杀伤白血病细胞。但其对正常细胞的毒性及作用机制尚不清楚。我们研究发现纳米银可以诱导细胞凋亡、引起DNA损伤,进一步研究显示活性氧（ROS）的产生和银离子（Ag）的释放共同介导了纳米银对正常细胞的毒性作用。最新研究发现自噬参与纳米银细胞毒性的调控,但其确切的作用和机制尚无定论。我们进一步发现纳米银能够诱导正常细胞产生自噬且发挥毒性作用,通过3-甲基腺嘌呤（3-MA）抑制自噬可以降低纳米银诱导的细胞凋亡和DNA损伤。本研究深化了对纳米银细胞毒性机制的认知,为降低纳米银毒性以更好地应用该材料提供了一种新策略。

关键词：纳米银细胞毒性凋亡 DNA损伤自噬

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香菇多糖介导的纳米银合成、表征及抗菌作用研究

香菇多糖介导的纳米银合成、表征及抗菌作用研究

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中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会

作者：郭大伟江善祥南京农业大学动物医学院兽医药理学与毒理学研究室

随着纳米技术的迅速发展和纳米银越来越广泛的应用,纳米银的制备方法也有了很大的发展。目前,纳米银的制各方法大致可分为物理法、化学法和生物法。随着纳米银在生物医学领域的应用,其生物相容性越来越受到人们的关注,因此绿色合成法越... 详细信息

随着纳米技术的迅速发展和纳米银越来越广泛的应用,纳米银的制备方法也有了很大的发展。目前,纳米银的制各方法大致可分为物理法、化学法和生物法。随着纳米银在生物医学领域的应用,其生物相容性越来越受到人们的关注,因此绿色合成法越来越受到人们的重视。评价绿色合成法必须满足以下三个方面:选择可溶解的介质;选择环境友好型的还原剂:选择无毒物质作为纳米银的稳定剂。香菇多糖具有抗肿瘤、抗病毒和免疫增强等作用,在医学、食品工业和兽医学等领域具有良好的应用前景。本研究以香菇多糖作为还原剂和稳定剂于70℃水浴中加热进行纳米银的绿色制备。合成的纳米银的UV-vis光谱的最大吸收峰是430 nm,表明纳米银的形成;进一步通过透射电子显微镜表征显示其呈球形,尺寸分布3～12 nm,平均粒径为7.09nm;DLS表征结果显示其水动力尺寸为21.35nm,zeta电位为-9.01 mV。牛津杯抗菌试验结果显示,香菇多糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均无抗菌活性,合成的纳米银对两种细菌均表现出剂量依赖性抑制,且其对革兰氏阴性大肠杆菌表现出更强的抗菌作用,电镜图片显示纳米银处理的大肠杆菌细胞膜和细胞浆分离,甚至发生胞浆泄漏。总来的说,我们使用香菇多糖合成了粒径小、分布窄、形貌均一、稳定的纳米银,且具有良好的抗菌应用价值。

关键词：纳米银香菇多糖抗菌

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比较基因组学鉴定猪链球菌新型多重耐药基因嵌合元件

比较基因组学鉴定猪链球菌新型多重耐药基因嵌合元件

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中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会

作者：黄金虎梁园王丽平南京农业大学动物医学院

(目的)本研究旨在分析猪链球菌的基本遗传特征,鉴定介导多重耐药猪链球菌的可转移遗传元件,为研究其水平转移规律和进化路径提供参考。(方法)通过对临床分离的猪链球菌进行全基因组测序,采用比较基因组学方法,分析其基因组成,鉴定基因... 详细信息

(目的)本研究旨在分析猪链球菌的基本遗传特征,鉴定介导多重耐药猪链球菌的可转移遗传元件,为研究其水平转移规律和进化路径提供参考。(方法)通过对临床分离的猪链球菌进行全基因组测序,采用比较基因组学方法,分析其基因组成,鉴定基因组上的可转移遗传元件,分析其与耐药基因水平传播的关系。(结果)猪链球菌临床败血症病猪分离株YY060816基因组草图由73个contig组成,大小为2,088,157 bp,GC含量为41.1%。在2,097个预测的基因中,2,055个预测编码蛋白;其中1,500个(71.53%)可进行COG功能分类;在356个(17%)移动基因中,绝大部分来源于质粒(69.7%)和原噬菌体(27.5%),基因组合有一个由tet(O)-carrying ICESsu05ZYH33(89K)-like ICE和mef(A)-carryingΦm46.1-like prophage组成的嵌合基因组岛,该基因组岛整合入rum的3'端特异性整合位点CACATAGAAGTTGT;比较菌株SC070731和YY060816的127K表明,该基因组岛可能是由89K-like ICEs部分整合入原噬菌体部分的左侧或右侧的att位点嵌合合成,并可能保持其环化和切除能力;MIC结果显示127K基因组岛介导了包括四环素类和大环内酯类在内的多重耐药。(结论)猪链球菌YY060816基因组中17%的基因为移动基因,提示基因的转移在该类细菌中极为常见;127K是由tet(O)-carrying ICESsu05ZYH33(89K)-like ICE和mef(A)-carryingΦm46.l-like prophage嵌合而成的新型多药耐药嵌合元件,介导了猪链球菌对包括四环素类和大环内酯类在内的药物的多重耐药性。

关键词：猪链球菌多重耐药比较基因组学嵌合元件 ICEs 原噬菌体

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PmrA/PmrB介导大肠杆菌对多粘菌素E的耐药机制

PmrA/PmrB介导大肠杆菌对多粘菌素E的耐药机制

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中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会

作者：葛琳何方王丽平南京农业大学动物医学院

【目的】已报道PmrA/PmrB二元调控系统在革兰氏阴性菌对多粘菌素B耐药过程中起重要作用,基于此认识,本试验拟探讨PmrA/PmrB二元调控系统介导大肠杆菌对多粘菌素E耐药的可能性,从而更好地理解细菌耐药性的发生机制和传播规律。[方法]首... 详细信息

【目的】已报道PmrA/PmrB二元调控系统在革兰氏阴性菌对多粘菌素B耐药过程中起重要作用,基于此认识,本试验拟探讨PmrA/PmrB二元调控系统介导大肠杆菌对多粘菌素E耐药的可能性,从而更好地理解细菌耐药性的发生机制和传播规律。[方法]首先对临床分离的52株禽致病性大肠杆菌对多黏菌素E的敏感性进行检测,然后采用step-wise方法对多黏菌素敏感菌株进行耐药性诱导,通过PCR扩增PmrA/PmrB后采用Mega软件进行突变位点分析,最后采用real time RT-PCR技术检测其mRNA表达水平的变化,拟阐明PmrA/PmrB二元调控系统对禽致病性大肠杆菌耐药性产生的贡献。【结果】MIC结果显示,52株大肠杆菌中,88.46%(44/52)对多粘菌素E敏感,中介及耐药菌株均为5.8%(3/52)。突变位点分析表明诱导成功的5株耐药菌(9R、36R、53R、91R,107R)pmrA未发生突变,而PmrB均有不同程度的突变。其中9R,36R和53R各在G56A(R19Q),T500C(L167P),T265A(Y89N)发生点突变,91R,107R在239位和478位各插入长为30 bp和128 bp的序列,除36R外,其余耐药菌株突变位点均未见报道。RT-PCR结果显示发生点突变的三株耐药菌PmrA/PmrB表达量均极显著(P<0.01)或显著(P<0.05)上升;发生插入突变的两株耐药菌PmrA/PmrB表达量虽有上升趋势,但变化不显著(P>0.05)。【结论】pmrA和pmrB在大肠杆菌对多粘菌素E的耐药中起重要作用,其中pmrB的点突变伴随pmrA/pmrB的高表达以及pmrB的插入突变是导致禽致病性大肠杆菌对多粘菌素E高度耐药的主要原因。

关键词：多粘菌素E 大肠杆菌 PmrA/PmrB 突变 real time RT-PCR

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头孢喹肟对副猪嗜血杆菌的体外药动药效(PK/PD)同步模型研究及基于PK/PD的折点制定

头孢喹肟对副猪嗜血杆菌的体外药动药效(PK/PD)同步模型研究及基...

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中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会

作者：肖霞刘雅红华南农业大学兽医学院江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）是猪上呼吸道的一种常在菌或条件致病菌,该菌感染猪后可引发多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎。近年来,由副猪嗜血杆菌所引起的革拉瑟氏病已成为影响养猪业发展的一种重要细菌性疾病。发病后及时... 详细信息

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）是猪上呼吸道的一种常在菌或条件致病菌,该菌感染猪后可引发多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎。近年来,由副猪嗜血杆菌所引起的革拉瑟氏病已成为影响养猪业发展的一种重要细菌性疾病。发病后及时采用抗生素进行治疗可显著降低动物死亡率,但随着大量抗菌药特别是广谱抗菌药在养猪业中的广泛使用,细菌对抗菌药物的耐药性问题日趋突出。第四代头孢菌素类抗菌药,头孢喹肟,为动物专用抗菌药,已批准用于猪的细菌性感染。但有关其对副猪嗜血杆菌的药动药效学特征及折点的研究还较少。本实验从华南地区分离213株副猪嗜血杆菌,利用琼脂二倍稀释法测定头孢喹肟对其的最小抑菌浓度（MIC）。在体外动态模型中设计12种不同的给药剂量使得药动药效（PK/PD）学参数%T>MIC的值分别为0、2、5、15、35、45、50、60、70、80,模拟单次静脉注射头孢喹肟,分别在0,4,8,12,24 h采集样品测定细菌数量以研究头孢喹肟不同给药剂量对副猪嗜血杆菌的抗菌效果。采用Sigmoid E模型拟合PK/PD指数与抗菌效果(△LogCFU)之间的相关性。将已发表的头孢喹肟在猪中的药动学参数值及其变异范围、头孢喹肟对副猪嗜血杆菌的MIC分布比例、本实验得出的达到杀灭细菌效果时头孢喹肟对副猪嗜血杆菌的PK/PD指数值,利用水晶球软件进行一个5000次的蒙特卡罗模拟,最后推导出头孢喹肟对副猪嗜血杆菌基于PK/PD的折点值及达到治愈率90%以上的给药方案。头孢喹肟对副猪嗜血杆菌的MIC和MIC分别为0.125和8 mg/L。当头孢喹肟对副猪嗜血杆菌的%T>MIC参数值为61和71时,可达到使细菌减少3个Log和4个Log的效果。通过蒙特卡罗分析得出头孢喹肟对副猪嗜血杆菌的药动药效学折点为0.06 mg/L。而对于华南地区副猪嗜血杆菌感染推荐的头孢喹肟剂量为4mg/kg体重,一天给药两次。该结果为头孢喹肟在华南地区的临床应用以及头孢喹肟对副猪嗜血杆菌折点的制定提供了依据。

关键词：头孢喹肟辅助嗜血杆菌药动药效同步模型折点

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沃尼妙林对鸡毒支原体的体内药动药效同步模型研究

沃尼妙林对鸡毒支原体的体内药动药效同步模型研究

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中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会

作者：肖霞方茜刘雅红华南农业大学兽医学院江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心

沃尼妙林为新型截短侧耳素类药物,对鸡毒支原体极其敏感,同时在鸡体内具有优良的药动学特征,是未来治疗鸡毒支原体感染较为理想的药物。但目前有关沃尼妙林对鸡毒支原体的研究较匮乏,无法为临床使用该药提供足够的科学用药依据。本文拟... 详细信息

沃尼妙林为新型截短侧耳素类药物,对鸡毒支原体极其敏感,同时在鸡体内具有优良的药动学特征,是未来治疗鸡毒支原体感染较为理想的药物。但目前有关沃尼妙林对鸡毒支原体的研究较匮乏,无法为临床使用该药提供足够的科学用药依据。本文拟通过体内药动药效（PK/PD）同步模型来研究沃尼妙林对鸡毒支原体的药效作用特征。为消除动物自身免疫对药物作用的影响,对3日龄无鸡毒支原体感染雏鸡,大腿肌肉注射60 mg/kg环磷酰胺,连续注射三天,建立中性粒细胞减少模型。对免疫系统破坏了的雏鸡进行气管灌注鸡毒支原体0.2mL约10～8CCU鸡毒支原体,连续攻毒三天,建立鸡毒支原体感染雏鸡模型。对感染雏鸡进行肌肉注射1、10、20 mg/kg b.w.沃尼妙林考察其药动学特征。选取50只感染雏鸡,随机选取5只分离气囊、肺、气管,其余45只随机分为9组,分别肌注生理盐、1、2、4、6、8、10、15、20 mg/kg沃尼妙林三天。最后一次给药24 h以后处死雏鸡,分离每只鸡的气囊,肺,气管作为一个样品。样品保存于-80℃,利用DNA提取试剂盒进行细菌DNA提取。采用荧光定量PCR建立定量测定菌液及组织样品中鸡毒支原体拷贝数的方法,鸡毒支原体拷贝数的对数值与荧光定量PCR的Ct值在3×10～2CCU/mL×10～8 CCU/mL范围内成线性关系,相关系数R为0.9976,即可通过荧光定量PCR检测雏鸡给药前后鸡毒支原体的载菌量。利用Sigmoid E模型将参数AUC/MIC与给药前后鸡毒支原体细菌数量的改变进行拟合,得出最优的PK/PD参数及达到不同作用效果的参数值。最后利用Toutain推荐的方法进行给药剂量的计算。雏鸡经环磷酰胺处理后粒细胞数量小于1000/mm并且可持续8天。粒细胞减少的雏鸡通过气管灌注鸡毒支原体后,95%的雏鸡的精神萎靡,闭眼,解剖发现气囊有奶酪样物质,气管有血丝。将气囊,气管,肺组织分离进行DNA提取测定鸡毒支原体DNA得出雏鸡细菌载菌量基本稳定在0.3×10～6CCU。发病率为95%,死亡率为17%。而对照组的雏鸡无临床症状,分离组织测DNA亦未测出。在1 mg/kg0 mg/kg b.w.剂量范围内药动学参数AUC、C与给药剂量成线性关系,由此可推算出任何介于1 mg/kg0 mg/kg b.w.给药剂量下的药动学参数AUC、C。经拟合发现AUC/MIC与沃尼妙林对鸡毒支原体在体内的抗菌作用存在显著的相关性（R=0.9669）。预测当AUC/MIC值为28,820、38,030和56,256时可达到抑制鸡毒支原体生长（0Log10 CCU/mL）,减少1 LogCCU/mL,减少2.5 LogCCU/mL的作用效果。对于MIC为0.0014μg/mL或者更小的鸡毒支原体感染,为达到使鸡毒支原体减少2.5 LogCCU/mL的效果推荐的给药剂量为6.5mg/kg,一天一次,一共给药三天,为临床合理用药提供理论依据。

关键词：鸡毒支原体沃尼妙林药动药效同步模型

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基于猪CCR1和CCR5受体高通量细胞筛选模型的构建及其条件优化

基于猪CCR1和CCR5受体高通量细胞筛选模型的构建及其条件优化

引用

中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会

作者：柴继田王志强扬州大学兽医学院江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心

为构建猪趋化因子受体1（CCR1）、趋化因子受体5（CCR5）真核表达载体并分析其信号通路,在细胞水平上初步探究了CC型趋化因子（RANTES）与CCR1和CCR5之间的关系,并建立CCR1和CCR5细胞模型并优化筛选条件,为筛选基于受体CCR1和CCR5的先... 详细信息

为构建猪趋化因子受体1（CCR1）、趋化因子受体5（CCR5）真核表达载体并分析其信号通路,在细胞水平上初步探究了CC型趋化因子（RANTES）与CCR1和CCR5之间的关系,并建立CCR1和CCR5细胞模型并优化筛选条件,为筛选基于受体CCR1和CCR5的先导化合物防控相关猪病奠定基础。本文利用PCR技术从猪的肌肉组织中扩增出1062bp的CCR1基因片段和1059bp的CCR5基因片段。将猪CCR1和CCR5基因连接到真核表达载体pcDNA3.1（+）并获得重组质粒pcDNA3.1（+）-myc/CCR1和pcDNA3.1（+）-myc/CCR5。将重组质粒转染到HEK293T细胞中,通过RT-PCR技术和Western blotting技术鉴定目的基因的转录和翻译。将重组质粒分别与pGL4.29[1uc2P/CRE/Hygro]或pGL4.33[luc2P/SRE/Hygro]和pGL4.74[hRluc/TK]共转染到HEK293T细胞中,通过双荧光素酶报告基因法,使用微孔板多功能荧光素酶检测仪检测RANTES作用后荧光素酶的表达量。分别转染pcDNA3.1（+）-myc/CCR1与pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro],pcDNA3.1（+）-myc/CCR5与pGL4.33[luc2P/SR E/Hygro]重组质粒到CHO-K1细胞中,使用G418和潮霉素B加压筛选,通过有限稀释法和单荧光素酶报告系统检测荧光素酶荧光值的变化情况,筛选出稳定表达的CCR1/CRE-CHO-K1和CCR5/SRE-CHO-K1的单克隆细胞。然后对以该细胞株为模型的高通量筛选条件中涉及的化合物的作用时间、作用浓度、溶剂DMSO的浓度进行了优化,优化的结果以Z'因子进行评价。构建的pcDNA3.1（+）-CCR1和pcDNA3.1（+）-CCR5基因序列正确,猪CCR1和CCR5受体蛋白可正常表达,且具有良好的生物活性。RANTES作用于猪CCR1能够降低由Forskolin升高的cAMP水平,对CRE元件表现出抑制效应,而对SRE有激活作用;RANTES作用于猪CCR5能够激活CRE和SRE反应元件。获得了稳定表达目的基因的细胞模型CCR1/CRE-CHO-K1和CCR5/SRE-CHO-K1,优化后的高通量筛选的条件为:药物作用时间为9h,药物作用浓度10M,Forskolin作用浓度为2μM,作用时间为1-2h,溶剂DMSO浓度小于2%,此时猪CCR1/CRE-CHO-K1细胞株Z'因子为0.59,CC5/SRE-CHO-K1细胞株Z'因子为0.60,说明筛选方法适合高通量筛选。本试验构建出pcDNA3.1（+）-CCR1和pcDNA3.1（+）-CCR5真核表达载体,初步阐明了RANTES与猪CCR1和CCR5作用后细胞内信号活动情况,为进一步研究猪CCR1和CCR5在猪病中的生物功能奠定基础。构建的细胞模型CCR1/CRE-CHO-K1和CCR5/SRE-CHO-K1可以用于活性化合物的筛选,为防治该通路参与的相关猪病奠定基础。

关键词：猪趋化因子受体1 趋化因子受体5 真核表达载体细胞模型

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鸡黑素皮质素4受体cAMP/PKA信号通路特点及其细胞筛选模型的建立

鸡黑素皮质素4受体cAMP/PKA信号通路特点及其细胞筛选模型的建立

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中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会

作者：周家华王志强扬州大学兽医学院江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心

本文旨在研究三种黑素皮质素4受体（MC4R）激动剂和拮抗剂对鸡MC4R（cMC4R）WT及4个突变体（Q18H、G21R、S76L和L299P）cAMP/PKA信号通路的影响,建立了基于cMC4R信号通路以cMC4R为靶点的细胞筛选模型。将cMC4RWT及4个突变体的真核表达... 详细信息

本文旨在研究三种黑素皮质素4受体（MC4R）激动剂和拮抗剂对鸡MC4R（cMC4R）WT及4个突变体（Q18H、G21R、S76L和L299P）cAMP/PKA信号通路的影响,建立了基于cMC4R信号通路以cMC4R为靶点的细胞筛选模型。将cMC4RWT及4个突变体的真核表达质粒与萤火虫荧光素酶报告基因质粒pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro]、海肾荧光素酶内参质粒pRL-TK共转染入HEK293T细胞,应用双报告基因法检测受体在无配体作用时荧光素酶的表达水平;检测受体在激动剂（α-MSH、β-MSH、NDP-MSH）的作用下荧光素酶的表达量;将cMC4RWT真核表达质粒与报告基因质粒、内参质粒共转染HEK293T细胞,检测受体在拮抗剂SHU9119和激动剂（α-MSH、β-MSH、NDP-MSH）的共同作用下荧光素酶的表达量。将cMC4R WT真核表达质粒与报告基因质粒按1:5的比例共转染到CHO-K1细胞,经G418（800μg/ml）和潮霉素B（400μg/ml）抗性筛选后,利用有限稀释法获得稳定表达目的基因的单克隆细胞株,利用RT-PCR从转录水平验证了目的基因的表达;排查cMC4R阳性细胞株内源性干扰,构建稳定表达cMC4R和萤火虫荧光素酶的细胞系;优化细胞筛选模型中配体浓度、作用时间以及二甲基亚砜（DMSO）溶剂的用量;采用Z'因子评估系统的稳定性和可靠性。结果显示,Q18H的基础活性极显著高于WT（P<0.01）,L299P的基础活性极显著低于WT（P<0.01）,G21R和S76L的基础活性与WT的相比差异不显著（P>0.05）。对于cMC4R WT及4个突变体,三种激动剂的内在活性为:NDP-MSH>α-MSH=β-MSH。4个突变体中cMC4R L299P的cAMP水平极显著低于cMC4RWT（P<0.01）,说明该突变对cMC4R结构和功能的影响较大,使cMC4R几乎失去了与激动剂的结合能力。无论何种激动剂与cMC4R WT作用,高浓度和中浓度的SHU9119都能够显著抑制激动剂的激动作用,低浓度的SHU9119抑制作用不明显。经有限稀释法获得了萤火虫荧光素酶的相对表达量最高的单克隆阳性细胞株A2;RT-PCR在预期位置扩增出两条目的条带;对细胞筛选模型进行优化显示,当激动剂NDP-MSH终浓度为10mol/L,NDP-MSH孵育时间为8h,溶剂DMSO终浓度小于2%时,筛选模型Z'因子为0.82,说明建立的筛选方法可靠、稳定,可以用于cMC4R激动剂和反向激动剂的筛选。本实验证实了cMC4R WT及4个突变体（Q18H、G21R、S76L、L299P）真核表达质粒能在体外细胞中表达,且具有生物学活性。成功建立了以cMC4R为靶点的细胞筛选模型,为筛选出cMC4R激动剂和反向激动剂奠定了基础。

关键词：鸡黑素皮质素4受体突变体信号通路细胞筛选模型

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浅谈我省农作物种子药剂处理现状与推进建议

浅谈我省农作物种子药剂处理现状与推进建议

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江苏省昆虫学会第十三次会员代表大会暨学术研讨会

作者：杨荣明朱先敏朱凤江苏省植物保护站

文章介绍了农作物种子药剂处理在控制病虫危害、促进壮苗齐苗和推进种业产业化发展中的作用,分析了我省种子药剂处理的现状与不足,提出了加快推进种子药剂处理应用的四点建议。

关键词：农作物种子药剂处理应用现状推进建议

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