目的:通过对环形泰勒虫裂殖体转化单个核细胞（PBMCs）和非感染牛外周血单个核细胞的五个内参基因进行相对实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,q PCR）测定、分析,从而筛选在两种细胞系中稳定表达内参基因,为进步对环形泰勒虫转化宿主细胞信号通路进行real-time PCR分析提供理论依据。方法:以环形泰勒虫裂殖体转化单个核细胞（PBMCs）和非感染牛外周血单个核细胞为实验材料,提取总RNA,反转录合成c DNA,再分别将此模板进行10倍（10-1-10-6）系列稀释,然后以此12份样品为模板分别对18S r RNA（Ribosomal RNA）,GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）,ACTB（β-actin）,PRKG1（protein kinase c GMP-dependent,type I）和TBP（TATA box binding protein）等五个牛内参基因进行real-time PCR分析,从而获得相应的Ct值和溶解曲线;然后对五个内参基因的表达丰度、引物特异性、标准曲线、扩增效率以及利用ge Norm、Norm Finder程序进行了综合性评价。结果:通过分析,五个内参基因引物扩增效率介于81.2%20.1%,特异性均较好;18S r RNA的表达丰度最高,TBP最低;18S r RNA和GAPDH均具有良好的线性扩增;Ge Norm和Normfinder分析结果均发现18S r RNA为最稳定内参基因,且18S r RNA和GAPDH是最好的组合。结论:在进行环形泰勒虫转化宿主细胞信号通路的real-time PCR分析时,我们推荐18S作为最稳定内参基,18S和GAPDH可以作为最好内参组合。
目的:半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族由一类广泛存在于生物体的半胱氨酸蛋白酶抑制剂组成,分为stefins,cystatins and kininogens三个亚家族。研究报道线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂在寄生虫逃避宿主免疫应答、适应寄生生活中发挥着重要作用。本...
详细信息
目的:半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族由一类广泛存在于生物体的半胱氨酸蛋白酶抑制剂组成,分为stefins,cystatins and kininogens三个亚家族。研究报道线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂在寄生虫逃避宿主免疫应答、适应寄生生活中发挥着重要作用。本研究旨在鉴定绦虫的半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因家族。方法:首先,利用生物学软件在基因组数据库寻找公布的各种绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因并对其进行结构分析;其次对猪带绦虫、牛带绦虫及亚洲带绦虫样品分别进行RT-PCR验证;通过构建系统发育树对鉴定的半胱氨酸蛋白酶抑制剂进行分类。结果:研究发现,绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族由两个亚家族stefins和cystatins组成,同时通过克隆猪带绦虫、牛带绦虫及亚洲带绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂的成员验证了基因序列。除了亚洲带绦虫stefins亚家族具有两个成员(Tastefin1和Tastefin2)外,其它绦虫的stefins和cystatins家族均有一个成员组成。Tastefin2基因比其它绦虫的stefins基因在N端多出22个氨基酸,分析显示这22个氨基酸不具有信号肽的特点。所有其它绦虫的stefins基因长度和保守结构域符合典型的半胱氨酸蛋白酶抑制剂特性,不含二硫键和糖基化位点。对绦虫的cystatins序列分析发现,它们具有典型半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatins的信号肽序列、保守结构域序列(Q、QVVAG、PW)和两个保守的二硫键。但是值得关注的是带科绦虫的cystatins基因没有两个保守的二硫键,存在一个串联的重复区,而重复区没有保守的结构域。这种结构在其它物种未见报道。系统发育分析显示带科绦虫cystatins形成了一个独立的分支,说明与其它物种存在很大分子差异。通过与已解析的人stefin和鸡cystatin三级结构比较分析,发现绦虫stefins与人stefin模型具有相同的空间结构。尽管带科绦虫cystatins不具有保守的二硫键,在鸡cystatin形成第一个二硫键位置处,它们空间结构与鸡cystatin相同。在鸡cystatin形成第二个二硫键位置处,带科绦虫cystatins与鸡cystatin结构不同。通过结构分析初步推测鉴定的绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂stefins和cystatins与人的stefin、鸡的cystatin一样,具有抑制半胱氨酸蛋白酶的功能。另外根据带科绦虫cystatins的特殊结构推测可能还存在其它功能。结论:本研究鉴定了绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族成员,并对其在分类、进化和功能变异方面进行了初步探讨,以上结果为下一步研究其生物学功能奠定了基础。
暂无评论