生物催化作为一种绿色高效的催化方法,在制药,工业和农业化学品及其中间体的合成方面受到了极大的关注。目前,已经有一些酶催化的迈克尔加成反应被报导,例如水解酶催化的C-C,C-N,C-S键的生成。但是关于其机理,却很少有人报道。我们使用南极假丝酵母脂肪酶B（lipase B from Candida antaractica,CALB）为催化剂,以环己烯酮与乙酰丙酮的迈克尔加成为模板反应,利用分子建模对该反应的机理进行了研究。结果表明,当反应溶剂为2,4-二氧六环时,CALB活性中心会形成氢键①和②,氢键③逐渐增强（图1）,这些氢键的形成阻碍了底物与酶活性中心的结合。实验数据也有效证明了这一点:当2,4-二氧六环为溶剂时,反应不会发生。当溶剂为乙腈,THF,甲醇,水,叔戊醇时,氢键①②③会有不同程度的形成,都会阻碍反应的发生,实验产率较低。而以DMSO为溶剂时,氢键①②程度较弱,使His224的N原子没有质子供体,底物进入后能够快速发生质子的转移,进而完成Michael加成反应。实验也表明,以DMSO为溶剂时,产率大大提高。在此基础上,我们对底物与酶的结合进行了模拟,并对对接结果进行动力学分析（均在DMSO溶剂中进行）。结果表明该反应有两种可能的反应途径:1乙酰丙酮先与活性中心结合2环己烯酮先与活性中心结合。但是具体的反应机理还有待进一步考证和研究。
普鲁兰酶是在普鲁兰糖和淀粉中水解α-1,6-糖苷键的脱支酶。目前淀粉工业中使用的α-淀粉酶,淀粉葡萄糖苷酶水解支链淀粉的效率不高,在糖化反应中添加的普鲁兰酶一般来源于嗜热菌,催化反应温度高于60℃。目前冷淀粉水解日益受到重视,因此开发具有高催化效率的冷适应普鲁兰酶具有重要意义。本研究从中温碱性芽孢杆菌中克隆到一个新的普鲁兰酶基因,其编码蛋白Pul703和已经报道的普鲁兰酶具有60%的氨基酸一致性。异源表达纯化蛋白进行表征分析发现Pul703最适作用温度为45℃,在25-35℃的温度下孵育360分钟后残余活性超过85%,具有良好的低温稳定性。底物特异性分析确认该酶为Ⅰ型普鲁兰酶,对普鲁兰糖的比酶活为270 U/mg,水解效率高于所有报道的I型普鲁兰酶。Pul703酶最适作用pH为7.0-8.0,在5.5-9.5的宽pH范围内具有高活性和稳定性,孵育12小时后均有80%以上的残余活性。Pul703酶具有较强EDTA和表面活性剂耐受性,在10 mM EDTA,10%Triton-X100和Tween20存在下,相对活性分别为100%,99%和114.8%。在1%和10%的尿素存在下,其活性分别提高4倍和1.3倍。总之,Pul703的这种低温特性、宽泛的pH作用范围和耐受性,耐螯合剂,耐表面活性剂和变性剂的综合特性,使其在低温淀粉水解工业上具有应用的潜力。
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