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- 62 篇 生物学
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- 41 篇 药学(可授医学、理...
- 32 篇 中西医结合
- 16 篇 公共卫生与预防医...
- 15 篇 基础医学(可授医学...
- 14 篇 中药学(可授医学、...
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- 6 篇 管理科学与工程(可...
3 篇 经济学
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1 篇 艺术学

主题

10 篇 含量测定
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8 篇 毛细管电泳
7 篇 转录组
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6 篇 定量分析
6 篇 蛋白质
6 篇 突变体
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5 篇 凡纳滨对虾
5 篇 基因克隆
5 篇 克隆
5 篇 生物学特性
5 篇 微生物
5 篇 微生物群落
5 篇 肠道微生物
5 篇 化学发光
5 篇 序列分析
5 篇 生长

机构

18 篇 福州大学
16 篇 华南农业大学
15 篇 广西大学
13 篇 华中农业大学
10 篇 南京农业大学
10 篇 贵州大学
9 篇 郑州大学
9 篇 山东农业大学
8 篇 中国地质大学
8 篇 吉林大学
8 篇 合肥工业大学
7 篇 中国科学院成都生...
7 篇 北京师范大学
6 篇 安徽农业大学
6 篇 湖南农业大学
6 篇 农业微生物学国家...
6 篇 中国农业大学
6 篇 厦门大学
6 篇 南开大学
6 篇 中国科学技术大学

作者

13 篇 陈国南
10 篇 袁倬斌
9 篇 丁延芹
9 篇 杜秉海
8 篇 赵德刚
8 篇 刘波
8 篇 姚良同
8 篇 庄惠生
7 篇 谢孟峡
7 篇 王琼娥
7 篇 张洪斌
6 篇 吴新杰
6 篇 张书胜
6 篇 刘红霞
6 篇 李俊
6 篇 沈德龙
5 篇 付艳苹
5 篇 张桂敏
5 篇 胡雪芹
5 篇 姜昕

语言

568 篇 中文

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铜绿假单胞菌碱性纤维素酶对蔗渣纤维素降解作用的研究

铜绿假单胞菌碱性纤维素酶对蔗渣纤维素降解作用的研究

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第十一届中国酶工程学术研讨会

作者：芦志龙陆琦陈英吴仁智黄俊陈小玲陈东黄日波广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室广西大学生命科学与技术学院广西科学院国家非粮生物质能源研究工程中心

碱性纤维素酶(β-1,4-葡聚糖苷酶)通常仅存在于细菌中。为从产碱性纤维素酶的铜绿假单胞菌PKC中分离其碱性纤维素酶基因,采用常见纤维素酶催化结构域保守序列,使用本地化的BLAST2.0对其全基因组序列进行PBLASTN查询,得到与Cellulase M... 详细信息

碱性纤维素酶(β-1,4-葡聚糖苷酶)通常仅存在于细菌中。为从产碱性纤维素酶的铜绿假单胞菌PKC中分离其碱性纤维素酶基因,采用常见纤维素酶催化结构域保守序列,使用本地化的BLAST2.0对其全基因组序列进行PBLASTN查询,得到与Cellulase M结构域氨基酸序列相似度达到70%的序列,并以此设计引物扩增得到碱性纤维素酶基因(图1-A,B)。序列分析发现这是一个编码序列为1077bp、具有典型的信号肽的碱性纤维素酶基因(图2)。将此基因连入pET22b表达载体,转化大肠杆菌BL21并用0.01M IPTG诱导表达(图1-C,D)。粗酶活力最高可达11.2U/mL粗酶液(pH=8.5)(图1-E)。通过对2%的稀碱高压120℃蒸煮2h处理的蔗渣样品开展碱性纤维素酶单一酶糖化实验,发现糖化后固相比重由52.0%降低到26.5%。液相中游离态纤维素占全部纤维素38.2%,游离态半纤维素占全部半纤维素84.0%。测得还原糖转化率为29.02%,戊糖率转化几乎不可检。残渣中半纤维素含量由18.9%减少到13.5%,而纤维素和木质素含量分别提高11.53%和1.9%。残渣吸附的还原糖和戊糖分别上升1.5%和0.14%(表1)。通过对残渣进行采用BT-2001型激光粒度分布仪(湿法)进行测定,发现酶切组中位粒径63.04μm,比对照组和前处理组分别降低了60.89μm和12.95μm,体积平均径74.83μm,比对照组和前处理组分别降低了79.77μm和10.95μm,呈现出明显的降解作用(图2)。可见,铜绿假单胞菌碱性纤维素酶的作用主要在于纤维素晶体结构破坏,促使非晶体态纤维素释放到溶剂中,同时随着纤维素-半纤维素-木质素交联结构的疏松,半纤维素和木质素随之释放,其中半纤维素的降解程度最为剧烈。液相中被释放的纤维素和半纤维素只有少量被降解为单糖,可见其主要作用于晶体态纤维素,而非游离纤维素。综上,碱性纤维素酶有助于提高碱性环境下蔗渣纤维的糖化水平。

关键词：木质素碱性纤维素酶纤维素降解铜绿假单胞菌

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菌糠固态发酵培养基的制备及其杀蚊活性分析

菌糠固态发酵培养基的制备及其杀蚊活性分析

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第六届全国农业微生物研究及产业化研讨会、第十五届全国杀虫微生物学术研讨会、第十一届全国虫生真菌学术研讨会

作者：戴晓艺兰艳娇黄冬梅张小娟陈忍吴松青张灵玲关雄福建农林大学植物保护学院福建福州350002 福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室福建福州350002 福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室福建福州350002 福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室福建福州350002 福建农林大学林学院福建福州350002

固态发酵对设备要求相对简单且生产过程基本不产生废水，具有投资少、污染小和能耗低等优点。为了探讨以菌糠为原料，通过固态发酵，培养高效廉价的Bti 杀蚊制剂的可行性。本研究对菌糠的总碳、总有机碳、氨基氮等营养成分进行了分析，... 详细信息

固态发酵对设备要求相对简单且生产过程基本不产生废水，具有投资少、污染小和能耗低等优点。为了探讨以菌糠为原料，通过固态发酵，培养高效廉价的Bti 杀蚊制剂的可行性。本研究对菌糠的总碳、总有机碳、氨基氮等营养成分进行了分析，根据分析结果设计了T1-T4 四种培养基，用于补充适量的氮源和无机盐离子，以满足Bti 生长所需的营养。对四种培养基发酵前后的相关指标进行检测，如总糖、还原糖、毒力效价、芽孢数、菌体数等，筛选出最优培养基并对其固态发酵条件进行优化。进而将菌株LLP29 按照最适培养基以及生长条件进行固态浅盘发酵，测定其效价和持效性。研究结果不仅可以通过几丁质等增效因子提高Bti 制剂的杀虫活性并降低Bti 的生产成本，还可以为Bti 工业发酵的绿色生产提供理论依据。

关键词：固态发酵菌糠 Bti

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白僵菌非核糖体多肽合成酶(NRPS)基因的聚类分析

白僵菌非核糖体多肽合成酶(NRPS)基因的聚类分析

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第六届全国农业微生物研究及产业化研讨会、第十五届全国杀虫微生物学术研讨会、第十一届全国虫生真菌学术研讨会

作者：张礼文刘航谢李楠徐玉泉中国农业科学院生物技术研究所北京100081

昆虫寄生真菌球孢白僵菌(Beauveria bassiana)能够侵染数百种昆虫,是一种环境友好的杀虫菌剂,也是研究真菌-昆虫相互作用的模式生物.非核糖体多肽(nonribosomal peptide,NRP)是一种具有多种生物活性的天然产物,在真菌侵染宿主过程中可... 详细信息

昆虫寄生真菌球孢白僵菌(Beauveria bassiana)能够侵染数百种昆虫,是一种环境友好的杀虫菌剂,也是研究真菌-昆虫相互作用的模式生物.非核糖体多肽(nonribosomal peptide,NRP)是一种具有多种生物活性的天然产物,在真菌侵染宿主过程中可作为毒素或者毒力因子,如白僵菌素(beauvericin)和类白僵菌素(bassianolide).然而,目前白僵菌中大多数编码非核糖体多肽的基因和它们的功能尚不清楚.为了研究非核糖体多肽在致病过程中的作用,我们用*** ARSEF 2860 中预测的非核糖体多肽合成酶(NRPS)的腺苷酰化结构域(A domain)构建系统发育树,将预测的21 个NRPS 按功能分成3 类：基础代谢类(7 个)、致病相关类(12 个)和功能未知类(2 个).通过侵染小菜蛾实验和转录水平分析,发现7 个致病相关类的NRPS 可能参与侵染过程.为了验证以上分析结果,我们选取了一个基础代谢类NRPS 基因和两个致病相关类NRPS 基因进行基因敲除和侵染小菜蛾实验,发现突变株均不同程度地降低了白僵菌的致病性.本研究为进一步阐明白僵菌NRPS 的生物功能及发现新型杀虫天然产物奠定了基础.

关键词：球孢白僵菌非核糖体多肽合成酶昆虫寄生真菌生物菌剂

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运用表面活性剂增强乳化的液相微萃取技术分析饮用水和蜂蜜中有机磷农药残留

运用表面活性剂增强乳化的液相微萃取技术分析饮用水和蜂蜜中有机...

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第十一届全国青年植保科技创新学术研讨会

作者：熊亚兵赵越杨中华华中农业大学植物科学技术学院湖北武汉430070

建立了一个新型、快速、有效的手动振荡-超声辅助-表面活性剂增强乳化的液相微萃取技术(M-UASEME),并结合气相色谱火焰光度检测器(GC-FPD)的检测方法,检测了饮用水及蜂蜜当中的8种有机磷农药残留(灭线磷、马拉硫磷、毒死蜱、水胺硫磷、... 详细信息

建立了一个新型、快速、有效的手动振荡-超声辅助-表面活性剂增强乳化的液相微萃取技术(M-UASEME),并结合气相色谱火焰光度检测器(GC-FPD)的检测方法,检测了饮用水及蜂蜜当中的8种有机磷农药残留(灭线磷、马拉硫磷、毒死蜱、水胺硫磷、杀扑磷、苯线磷、丙溴磷、三唑磷).对可能影响萃取效率的因素本试验进行优化，结果表明：此方法检测饮用水及蜂蜜中有机磷农药残留结果较满意。

关键词：饮用水蜂蜜农药残留液相微萃取

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碱性果胶酶PEL168的分子改造和在生物煮练中的应用

碱性果胶酶PEL168的分子改造和在生物煮练中的应用

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第十一届中国酶工程学术研讨会

作者：望潇文卢争辉 Jonathan Nimal Selvaraj 蒋思婧易犁张桂敏生物催化技术湖北省工程实验室湖北大学

碱性果胶酶可用于苎麻脱胶和棉织物前处理的精练工艺,与传统的高温碱煮方法相比,具有保护纤维、降低能耗、水耗等优势。碱性果胶酶PEL168的比酶活为353 U/mg,在50℃时的半衰期为2 h,该蛋白的晶体结构已经被解析。本研究基于对PEL168的... 详细信息

碱性果胶酶可用于苎麻脱胶和棉织物前处理的精练工艺,与传统的高温碱煮方法相比,具有保护纤维、降低能耗、水耗等优势。碱性果胶酶PEL168的比酶活为353 U/mg,在50℃时的半衰期为2 h,该蛋白的晶体结构已经被解析。本研究基于对PEL168的结构分析,分别从增加盐桥,增加二硫键、增加局部结构的柔韧性等方面进行理性设计提高PEL168的比酶活和稳定性,但是大部分设计都造成了酶活的降低或者完全失活,只得到了一个比酶活提高1.32倍,pH稳定性提高的突变体V132F。因此采用随机突变进行改造,利用error-prone P℃R建立突变体文库,通过果胶底物平板初筛和96孔板复筛得到一个比酶活提高1.81倍的突变体K47E(640U/mg),在50℃时的半衰期也延长至4.5h。鉴于有利突变的累积效应,将突变位点V132F和K47E进行组合,得到双突变体K47EN132F,其比酶活提高至873 U/mg。由于第47号位点的突变是随机得到的,暗示该位点对PEL168的比酶活有着重要的影响,随后以双突变体K47EN132F为模板对47号位点进行定点饱和突变,筛选到比酶活提高至1388 U/mg的突变体K47D/V132F。最后根据文献报道的嗜热果胶酶或者最适温度较高的碱性果胶酶与PEL168进行同源序列比对,在活性中心附近确定了突变位点R272W/Y,最后获得突变体K47D/V132F/R272W,相对于野生型,其比酶活提高了4.37倍(1544 U/mg),在50℃时的半衰期延长至5.6 h,动力学参数测定发现其催化效率也明显提高。结构分析发现K47D/V132F/R272W催化三联体的空间距离增加,使得底物更加容易与活性中心结合,且非共价键的增加使得催化三联体的结构也变得更加稳定,从而突变体的比酶活提高;47号位点氨基酸残基处的氢键增加,整个突变体的折叠自由能降低,使蛋白结构变得更加稳定可能是热稳定性增加的原因。为了测试该碱性果胶酶生物精练的效果,用胚布进行了酶法煮练的小试,发现用突变体酶K47D/V132F/R272W处理胚布后,胚布的润湿性明显增强,润湿圈面积为14.13 cm2,布料也变得更加柔软,而未经酶处理的布润湿性很差,润湿圈面积只有2.00 cm2。扫描电子显微镜(SEM)观察也发现经过酶处理后的纤维表面更加光滑。

关键词：比酶活 PEL168 突变体碱性果胶酶突变位点生物煮练分子改造

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褐飞虱核受体nuclear receptors基因的克隆和功能分析

褐飞虱核受体nuclear receptors基因的克隆和功能分析

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第十一届全国青年植保科技创新学术研讨会

作者：徐鹿韩召军李永丰顾中言江苏省农业科学院植物保护研究所江苏南京210014 南京农业大学植物保护学院农作物生物灾害综合治理教育部重点实验室江苏南京210095

为了研究核受体基因(NlNR)在褐飞虱代谢杀虫剂过程中的作用,对其核受体基因进行克隆、测定暴露在杀虫剂下的转录表达和RNA干扰分析.基于褐飞虱转录组和基因组数据,同源寻找核受体基因转录本序列.利用RT-PCR和RACE技术验证和克隆NlNR转... 详细信息

为了研究核受体基因(NlNR)在褐飞虱代谢杀虫剂过程中的作用,对其核受体基因进行克隆、测定暴露在杀虫剂下的转录表达和RNA干扰分析.基于褐飞虱转录组和基因组数据,同源寻找核受体基因转录本序列.利用RT-PCR和RACE技术验证和克隆NlNR转录本的开放阅读框,通过qPCR研究其暴露在氟啶虫胺腈下不同时间和不同组织的表达情况.

关键词：褐飞虱代谢杀虫剂核受体基因基因克隆基因功能

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从皮肤微生态角度分析化妆品中的防腐、抑菌成分对皮肤健康的影响

从皮肤微生态角度分析化妆品中的防腐、抑菌成分对皮肤健康的影响

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第十一届中国化妆品学术研讨会

作者：李和伟刘星王文婷董玲常州伟博海泰生物科技有限公司北京中医药大学

多项研究表明皮肤微生态群落的种群平衡与皮肤的健康密切相关。通过对皮肤微生态原理以及生理活动影响研究,概述了化妆品中的防腐、抑菌成分对皮肤微生态所产生的积极或负面扰动影响,通过影响皮肤微生态及其生理活动影响皮肤健康。以此... 详细信息

多项研究表明皮肤微生态群落的种群平衡与皮肤的健康密切相关。通过对皮肤微生态原理以及生理活动影响研究,概述了化妆品中的防腐、抑菌成分对皮肤微生态所产生的积极或负面扰动影响,通过影响皮肤微生态及其生理活动影响皮肤健康。以此作为化妆品配方体系和制剂形态开发的一种新视角,并为化妆品配方安全评估提供新的研究切入点。

关键词：皮肤微生态防腐和抑菌成分扰动皮肤健康

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右旋糖酐蔗糖酶截短突变及其转糖基功能研究

右旋糖酐蔗糖酶截短突变及其转糖基功能研究

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第十一届中国酶工程学术研讨会

作者：张洪斌王超李秋萍胡雪芹杨静文合肥工业大学生物与医学工程学院

右旋糖酐蔗糖酶以蔗糖为底物通过水解转移葡萄糖基合成高分子葡聚糖,本文通过对右旋糖酐蔗糖酶基因dex-YG进行系列分子截短,分析不同片段的右旋糖酐截短突变酶的特性,以探究右旋糖酐蔗糖酶结构区域与催化功能的关系,揭示其催化机制;构... 详细信息

右旋糖酐蔗糖酶以蔗糖为底物通过水解转移葡萄糖基合成高分子葡聚糖,本文通过对右旋糖酐蔗糖酶基因dex-YG进行系列分子截短,分析不同片段的右旋糖酐截短突变酶的特性,以探究右旋糖酐蔗糖酶结构区域与催化功能的关系,揭示其催化机制;构建筛选得到具较高活性的突出转糖基的DSR突变酶,揭示其转糖基功能的关键区域;并对该突变酶的性质进行研究,同时利用突变后的转糖基酶对不同糖类受体和维生素C(Vc)进行糖基化,与原始酶进行分析比较,获得该突变酶对受体糖基化的催化规律。1、以右旋糖酐蔗糖酶基因序列dex-YG为基础,通过生物信息学的比对分析,对其二级结构以及三级结构进行预测分析,对其C端序列进行一系列的截短,分析其结构功能的关系。通过片段截短的方法对其糖链延伸的控制区,寡聚糖合成区域,以及完全保守区域进行了研究分析,探讨右旋糖酐蔗糖酶结构区域与催化功能的关系。结果表明:对其末端重复序列进行删除,会极大的破坏右旋糖酐蔗糖酶合成葡聚糖的能力。随截短片段长度增加,其合成高分子葡聚糖的能力急剧下降,在蛋白367aa个氨基酸的截短后,其右旋糖酐的合成能力完全丧失,相对应的其受体反应的催化功能会明显增强,从而导致寡聚糖的合成能力显著提升。随着更进一步的片段截短直至其保守序列motifⅠ,其受体反应的催化性能也极具下降,其酶活力几乎完全丧失。2、通过分子截短获得的突变右旋糖蔗糖酶DSR-S1-AA,并对突变酶的表达条件进行优化。酶学性质研究发现:该酶最适pH均为5.4,pH稳定性均为4.4-7;最适温度均为25℃;DSR-S1-AA酶在没有受体情况下,酶活完全丧失;受体存在时,DSR-S1-AA酶活是原始酶酶活的71.4%,其中糖基转移活性是水解活性的5.3倍,DSR-S1-AA耐热性比原始酶有所下降,在30℃保藏1h酶活力只有20.8%。以麦芽糖为受体研究表明,受体浓度为200mM时酶活最高,供体蔗糖对DSR-S1-AA酶的影响较大,酶活随着蔗糖浓度提高而不断增加。结果显示DSR-S1-AA主要活性为转糖基功能,多糖聚合能力低,从而明确了DSR的转糖基功能区域。3、通过对麦芽糖、纤维二糖、棉子糖和水苏糖等不同糖类受体的转糖基研究,结果表明:麦芽糖是该酶转糖基反应的最佳受体,同时对纤维二糖、棉子三糖和水苏糖都有活性,但转糖基依次减弱;不同天然低聚糖的转糖基反应都趋向于生成低分子量的糖,转移1-2个葡萄糖基到受体分子,并且受体分子量越小越易进行转糖基作用,α键连接糖类化合物比β键连接糖类化合物更易进行转糖基反应;说明改造后的酶能利用更少的麦芽糖合成更多的低聚糖。综上,本文通过对右旋糖酐蔗糖酶基因的分子截短突变,探讨了右旋糖酐蔗糖酶结构区域与催化功能的关系,明确了右旋糖酐蔗糖酶转糖基功能的分子区域,有助于进一步认识右旋糖酐蔗糖酶的催化机制;同时对于功能低聚糖的制备和天然产物的糖基化研究具有重要意义。

关键词：右旋糖酐蔗糖酶、截短突变、转糖基反应低聚糖

来源：评论

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右旋糖酐蔗糖酶的分子改造及其枝化度与热稳定性研究

右旋糖酐蔗糖酶的分子改造及其枝化度与热稳定性研究

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第十一届中国酶工程学术研讨会

作者：李梦绮张洪斌合肥工业大学生物与医学工程学院制药系

来源于肠膜状明串株菌0326的右旋糖酐蔗糖酶(DSR,EC2.4.5.1)是葡聚糖蔗糖酶的一种,能够催化蔗糖产生右旋糖酐(Dextran),因其具有安全、无毒、生物相容性等多种优点,被广泛应用于食品和医药等行业中。本研究拟通过插入氨基酸以改变产物... 详细信息

来源于肠膜状明串株菌0326的右旋糖酐蔗糖酶(DSR,EC2.4.5.1)是葡聚糖蔗糖酶的一种,能够催化蔗糖产生右旋糖酐(Dextran),因其具有安全、无毒、生物相容性等多种优点,被广泛应用于食品和医药等行业中。本研究拟通过插入氨基酸以改变产物键型提高枝化度,定点突变及引入二硫键提高该酶的热稳定性。本实验室前期己成功构建出右旋糖酐蔗糖酶基因(dexYG)与载体pET-28a连接的重组质粒,并在*** 21中成功表达。在前期研究的基础上,以构建的重组质粒为模板,通过对活性口袋结构及受体相互作用的分析,选择了距离受体分子较近的553位和662位氨基酸,并采用同源重组法对氨基酸进行插入,成功构建17个活性突变体。通过核磁手段(NMR)分析产物键型,出现了新的α(1-4)键,且比例由0变化为11.2%,最高甚至达到了53.6%,说明产物的枝化度提高。同时通过定点突变引入丝氨酸(Ser)、赖氨酸(Thr)以提高该酶的热稳定性,在该酶的不同结构域上共选择了Pro-473,Pro-678,Pro-856,Lys-378,Lys-725,Lys-955六个单点,通过双、三点突变共构建了14个突变体,P473S/P856S酶活性与野生型相比提高了2.86倍。考察了其最适反应温度、35℃及45℃下的热保留活性及对热稳定性的贡献,当野生型己完全失活时,该突变酶仍保有一定的活性,一定程度上提高了重组右旋糖酐蔗糖酶的热稳定性。空间结构模拟分析发现分子间氢键的作用是引起热稳定性改变的一个重要因素。二硫键是由两个半胱氨酸(Cys)之间形成的共价键,它的形成对于稳定蛋白质的空间结构和保持其活性功能具有极其重要的影响。在此基础上,通过Disulfide by DesignTM分析得到潜在的98对二硫键,以P473S/P856S为模板定点突变初步引入二硫键,二次PCR反应后分别构建六对二硫键。在EColiBL 21中成功表达并考察其酶活性,只有D739C-F932C具有一定酶活,研究其热稳定性发现并没有提高反而有所降低,其产物糖苷键比例反生了明显的变化(α(1-4)键由0增加到15.8%),说明突变酶催化活性被改变,二硫键可能并没有正确的形成而只是突变正确。可能因为该酶的序列较长,没有解析的晶体结构,因此引入二硫键有一定难度。本研究对提高右旋糖酐枝化度及重组右旋糖酐蔗糖酶的热稳定性提供了方法与基础。通过随机突变可发现目前酶三维结构中未被发现的热点区域,也是获得耐热性和低水解酶的有效方法。通过理性设计及结构指导合成特定的α-葡聚糖,新型右旋糖酐将被更好应用于食品与医药产业。

关键词：右旋糖酐蔗糖酶分子改造定点突变枝化度热稳定性二硫键

来源：评论

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与半乳糖激酶基因高度同源的新型葡萄糖激酶的克隆表达和特性研究

与半乳糖激酶基因高度同源的新型葡萄糖激酶的克隆表达和特性研究

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第十一届中国酶工程学术研讨会

作者：李倩刘方方 Louis Patrick Conway Josef Voglmeir Glycomics and Glycan Bioengineering Research Center 南京农业大学

半乳糖（Galactose）是一种六碳单糖,它常以D-半乳糖苷的形式存在于动物的脑组织和神经组织中。半乳糖基修饰了一系列具有生物活性的聚糖,如黏蛋白、红细胞系列的糖鞘脂等,要将半乳糖基转移到糖链上,首先需要通过半乳糖激酶对半乳糖进... 详细信息

半乳糖（Galactose）是一种六碳单糖,它常以D-半乳糖苷的形式存在于动物的脑组织和神经组织中。半乳糖基修饰了一系列具有生物活性的聚糖,如黏蛋白、红细胞系列的糖鞘脂等,要将半乳糖基转移到糖链上,首先需要通过半乳糖激酶对半乳糖进行磷酸化。半乳糖激酶（GalK）能够将半乳糖磷酸化生成半乳糖-1-磷酸,在过去的研究中,GalK由于其在糖代谢中的重要作用而引起了重大的研究关注,除了体内的生物学功能外,GalK还具有广泛的底物范围,可用于体外制备多种特殊的糖-1-磷酸或者衍生物。本研究以细菌属Shewanellawoodyi源半乳糖激酶-Sw3773、Sw2155和Sw0678作为研究对象,以包括单糖、单糖衍生物或二糖在内的47种糖为底物检测酶的底物特异性,结果显示（附图1-3）三种激酶都对半乳糖没有活性,反而都能作用于葡萄糖。然而目前报道过的半乳糖激酶都对半乳糖有活性,且相比其他底物,活性最高。为了确定激酶催化产物的磷酸化位置,我们通过核磁共振波谱法（NMR）对产物进行结构分析。将纯化后样品的NMR谱图分别与商业化葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖-6-磷酸标准品的谱图进行对比（附图4）,发现纯化产物为葡萄糖-6-磷酸。我们己知,半乳糖激酶对底物的C-1位进行磷酸化,而葡萄糖激酶对底物的C-6位上进行磷酸化,因此我们猜测三种***源拟半乳糖激酶实际上为葡萄糖激酶。对三种激酶的氨基酸序列进行分析,发现序列中一处具有高度保守性的甘氨酸,在Sw3773和Sw2155中被丝氨酸取代,在Sw0678中被谷氨酰胺取代（附图5中甘氨酸被红色方框标记,丝氨酸和谷氨酸被蓝色方框标记）。Hoffmeister等[1]曾经报道过,大肠杆菌半乳糖激酶中单个酪氨酸（Tyr371）的突变,导致该酶的底物特异性发生很大变化,使其对D-半乳糖醛酸、D-塔洛糖、L-阿卓糖,甚至L-葡萄糖都有活性。因此,初步猜测可能是由于该甘氨酸的突变,导致***源半乳糖激酶的功能发生了改变。以葡萄糖为底物,利用已经建立的生物酶标仪检测法,对三种新型葡萄糖激酶的生化特性进行探究,结果表明:三种激酶的最适反应pH都为7.5;Sw3773的最适反应温度为37℃,其他两个酶都为42℃;三种葡萄糖激酶的活性都依赖于金属离子,Mg对三种酶的促进作用最强;Sw3773、Sw2155和Sw0678对底物葡萄糖的Km值分别为1.9 mM、0.9 mM和3.9 mM;Vmax分别为5.9μM/min、15.2μM/min和6.6μM/min;在对葡萄糖激酶的磷酸供体依赖性进行测定时,发现ATP是四种被测核苷三磷酸中唯一的磷酸基供体,CTP、UTP和GTP都不能被GalK利用。三种激酶对ATP的高度专一性可用于核苷三磷酸的分离或鉴定,温和的反应条件也有利于今后进一步的实验与应用。

关键词：半乳糖激酶磷酸化底物特异性特性研究

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