[目的]随着农业结构的调整和产业化的推进,畜牧业养殖规模向着集约化和规模化高速发展。但养殖水平提高的同时,畜禽生产过程排放大量废弃物极度消耗了环境对污染物的处理能力。在集约饲养中,为了治疗畜禽和促进畜禽生长,抗生素作为饲料添加剂或预防性的兽药,广泛地应用于畜禽的疾病防治、农业生产、畜牧及水产养殖等畜牧领域。但大多数药物通常以原形态或者具备活性的次级产物,随着粪便或者尿液排出禽畜体外（Yao et al.,2017）。除了环境中残留抗生素对耐药基因有直接选择作用,重金属也能够协同选择耐药基因（Seiler et al.,2012）,导致微生物群落中多重抗性菌的产生。厌氧发酵作为一种被广泛使用的废水污物处理方式,有良好的有机成分消解和有毒有害成分去除作用,能比较明显的降低耐药基因的相对丰度。但在一些实验中发现,某些特定的耐药基因会在厌氧发酵过程末期发生丰度的回升（Bengtsson-Palme et al.,2016）。本实验构建实验室发酵模型,检测在厌氧发酵过程中外源铜的添加对抗性基因丰度和细菌群落的影响,探究铜在发酵过程中产生的协同选择耐药基因的可能机制以及贡献程度。[方法]为了探究铜对厌氧发酵过程中抗性基因的影响,本实验在实验室厌氧发酵小型体系中添加不同浓度的铜,设置了空白、低浓度（Cu:1.1mg/kg）、中浓度（Cu:11mg/kg）、高浓度（Cu:110mg/kg）。在加入CuCl溶液后第5h和第6d、第12d、第18d、第25d、第31d、第37d、第46d和第52dd采样。对发酵体系中抗生素耐药基因、整合子基因和重金属抗性基因进行定量,并运用高通量测序分析群落结构多样性,检测发酵后期体系中耐铜菌携带片段情况。[结果]本实验中共检测了11种基因的相对丰度,其中相对丰度最高为tetO,qnrS相对丰度最低。除了pcoD、tetO和tetT,其他基因之间都存在显著相关性。PcoD和tetT的相对丰度在不同浓度组之间有显著差异,tetA、tetB、tetO、qnrS、ermA和ermB的相对丰度在不同浓度组之间没有显著差异。上诉8种基因相对丰度在发酵后期回升,相对丰度回升幅度在高浓度组中最高。在实验过程中,在门水平上样品中占比从高到低依次是厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形菌门（Proteobacteria）。厚壁菌门在第18d达到最低占比,变形菌门在第25d达到最高占比,拟杆菌门在第18d达到最高占比。属水平上占比最多为厌氧芽孢杆菌（Clostridiumensutricto）,占比第二为土孢杆菌属（Terrisporobacter）,两种菌属在第18d达到最低占比。占比第三和第四的属种,Proteiniclasticum和Petrimonas,在第18d达到最高占比。发酵初期,体系中微生物多样性随着时间显著提高,第18d体系中物种丰富度最高,随后趋于稳定,物种多样性随着时间缓慢减少。发酵初期不同时间的样品间物种多样性差异显著,在第31d后样品间物种多样性差异不显著。棒杆菌属（Corynebacterium）和链球菌属（Streptococcus）同tcrB、intl1、intl2、ermA、ermB、tetA和tetB存在显著正相关（R>0,p<0.05）。Clostridiumensutricto、土孢杆属（Terrisporobacter）和Turicibacter同tetT存在显著正相关（R>0.3,p<0.05）。从空白组、中浓度组和高浓度组第25d、31d和47d样品中筛选出90株铜抗性菌。在这些菌中,intl1检出率最高,intl2、tetT和tetO检出率为0%,单菌株携带片段种数随时间增多,多片段同时携带的组合中都存在着intl1、ermA和ermB。这三类基因相对丰度同棒杆菌属和链球菌属存在极显著近线性相关。[结论]或许可以认为,本实验中一类整合子上携带的抗生素耐药基因种类逐渐增多,其中固定携带着ermA和ermB的整合子能够使得宿主菌在发酵后期存活。棒杆菌属和链球菌属作为这类整合子的主要宿主,其生命活动导致后期相对丰度回升。Intl1的高检出率预示着在细菌间强烈的基因转移过程,可能是外界环境压力导致细菌分泌胞外DNA的增加加快了耐药基因的传播。不同耐药基因有不同的主要宿主菌,因此不同基因丰度上升的原因不能只归咎于某一个因素的变化。
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