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中国毒理学会兽医毒理学委员会与中国畜牧兽医学会兽医食品卫生学分会联合学术研讨会暨中国毒理学会兽医毒理学委员会第5次全国会员代表大会

作者：蓝玮璇江礼捷肖霞王志强扬州大学兽医学院兽医药理毒理研究室

【目的】研究氟苯尼考对多杀性巴氏杆菌感染鸭的体外和体内抗菌活性。【方法】测定氟苯尼考对12株禽源多杀性巴氏杆菌的最小抑菌浓度（MIC）,最小杀菌浓度（MBC）;测定氟苯尼考对C、0825Y、0901J1的体外静态杀菌曲线。从细菌学层面研究... 详细信息

【目的】研究氟苯尼考对多杀性巴氏杆菌感染鸭的体外和体内抗菌活性。【方法】测定氟苯尼考对12株禽源多杀性巴氏杆菌的最小抑菌浓度（MIC）,最小杀菌浓度（MBC）;测定氟苯尼考对C、0825Y、0901J1的体外静态杀菌曲线。从细菌学层面研究肉鸭中氟苯尼考对多杀性巴氏杆菌的体内药效学作用。选用50只六周龄健康高邮肉鸭,每只体重约0.5kg,通过气管灌注02CFU/mL的禽源多杀性巴氏杆菌0825Y1,建立禽源多杀性巴氏杆菌肺炎感染模型,肉鸭感染多杀性巴氏杆菌12h后,出现精神沉郁、体温升高、畏冷扎堆、张口呼吸、咳嗽等临床症状,解剖后可见肺脏充血水肿、心冠脂肪有点状出血、肝脏有针尖状白色坏死灶,肺脏载菌量稳定在0～6CFU/lung。随机选取45只感染肉鸭,12h后随机分成9组,分别灌服生理盐水、1、2、5、8、10、15、20、30mg/kg bw的氟苯尼考,一天两次,连续三天,在最后一次给药12h后处死鸭子,无菌采取肺脏,测定肺脏载菌量。【结果】氟苯尼考对12株禽源多杀性巴氏杆菌的MIC范围为0.25-32μg/mL,MBC为2MIC;体外杀菌曲线表明细菌减少的log值随着药物浓度的增加而呈现梯度的变化,细菌暴露于大于等于4MIC药物浓度24h后,能够达到清除细菌的效果;体内药效中,经过72h治疗后,给药剂量为5mg/kg bw、15mg/kg bw、30mg/kg bw分别可达到抑菌作用、杀菌作用和清除作用。【结论】临床推荐的给药剂量20-30mg/kg bw治疗敏感菌株所致的鸭多杀性巴氏杆菌病可达到良好的治疗效果。

关键词：氟苯尼考禽源多杀性巴氏杆菌体外抗菌活性体内药效

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猪链球菌2型安徽株溶血素基因的表达及其免疫原性分析

猪链球菌2型安徽株溶血素基因的表达及其免疫原性分析

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中国毒理学会兽医毒理学委员会与中国畜牧兽医学会兽医食品卫生学分会联合学术研讨会暨中国毒理学会兽医毒理学委员会第5次全国会员代表大会

作者：吴华健毛天骄杨龙斌王玮李郁安徽农业大学动物科技学院

【目的】获得猪链球菌2型(Streptococcussuis serotype 2,SS2)溶血素基因(sly)的表达产物,并对其免疫原性进行分析鉴定。【方法】根据GenBank数据库中登陆号为DQ443533.1全长sly序列,设计合成一对分别带有BamHI、XhoI酶切位点的特异性引... 详细信息

【目的】获得猪链球菌2型(Streptococcussuis serotype 2,SS2)溶血素基因(sly)的表达产物,并对其免疫原性进行分析鉴定。【方法】根据GenBank数据库中登陆号为DQ443533.1全长sly序列,设计合成一对分别带有BamHI、XhoI酶切位点的特异性引物,利用PCR从SS2安徽分离株(HF10-6)中扩增sly,构建pET-30a-sly原核表达重组质粒,经BamHI、XhoI双酶切和测序验证,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中,进行IPTG诱导表达和His-Tag镍柱纯化蛋白,利用SDS-PAGE检测目的蛋白(SLY),Western blot鉴定SLY的反应原性。利用昆明鼠和斑马鱼两种动物模型进行SLY免疫保护试验,间接ELISA方法检测昆明鼠血清抗体效价水平。【结果】重组质粒pET-30a-sly在大肠杆菌中实现高效表达,获得大小为60kDa的目的蛋白,与预期大小的SLY分子质量一致,能与SS2阳性血清发生特异性反应。SLY和SS2强毒株灭活全菌体对昆明鼠和斑马鱼的相对保护率分别为40%、80%和84%、92%,SLY和SS2强毒株灭活全菌体三次免疫昆明鼠后的血清IgG抗体效价分别为1:6400、1:819200(以SS2强毒株全菌体的超声裂解物为包被抗原)和1:102400、1:51200(以SLY为包被抗原)。【结论】成功表达的SLY不仅具有良好的反应原性,还兼具良好的免疫原性以及诱导机体产生保护性免疫反应的能力,有望成为研制SS2新型疫苗的候选成分。

关键词：猪链球菌2型溶血素基因表达免疫原性

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肿节风三清颗粒的急性和亚慢性毒性试验

肿节风三清颗粒的急性和亚慢性毒性试验

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中国毒理学会兽医毒理学委员会与中国畜牧兽医学会兽医食品卫生学分会联合学术研讨会暨中国毒理学会兽医毒理学委员会第5次全国会员代表大会

作者：徐杨峰梁秋玲冯鹤宇文雪梅颜国庆何家康广西大学动物科学技术学院

【目的】肿节风三清颗粒为肿节风、射干、甘草经加工制成的纯中药颗粒制剂。本研究在《兽药研究技术指导原则》的指导下,进行了肿节风三清颗粒的急性毒性试验和亚慢性毒性试验,以期对该制剂的毒理学进行初步评价。【方法】急性毒性试验... 详细信息

【目的】肿节风三清颗粒为肿节风、射干、甘草经加工制成的纯中药颗粒制剂。本研究在《兽药研究技术指导原则》的指导下,进行了肿节风三清颗粒的急性毒性试验和亚慢性毒性试验,以期对该制剂的毒理学进行初步评价。【方法】急性毒性试验:一次性给小鼠灌胃给药,未测出LD,故采用24小时内多次给药的方式测定最大给药量。亚慢性毒性试验:将80只大鼠分为4组,每组20只（雌雄各半）,设定高、中、低三个剂量组,给药剂量分别1.25g/100g体重、0.625g/100g体重、0.31g/100g,并设一个生理盐水对照组（1mL/100g体重）,每天灌胃给药一次,连续给药35天（即共5周）。于给药结束后,每组取10只动物（雌、雄各半）处死取血,进行血常规和生化指标检测,并进行病理剖检和组织学检查。【结果】急性毒性试验:小鼠24 h内灌胃给药3次,每次0.5g/20g体重,每次间隔8小时,在最大给药量为1.5g/20g,即75g/kg体重（以颗粒计）时仍未出现任何毒性反应。观察期结束后处死存活小鼠,通过解剖未发现明显可见的病理变化。亚慢性毒性试验:高、中、低剂量组及对照组大鼠在35天给药期间,活动正常、毛发光润、摄食,饮水、粪便均正常,未发现中毒症状,动物无一死亡。血液学检查结果,各试验组雌、雄大鼠与对照组比较,血液学和血液生化指标差异不显著（P>0.05）。病理剖检和组织学检查结果,各试验组在给药结束后,对大鼠进行剖检,经肉眼观察均未发现任何异常和可疑病变。将对照组、高剂量组大鼠的肝、脾、肺、肾、胃、肠、睾丸（♂）及子宫（♀）组织进行组织病理学切片检查,结果均未发现异常的显微病理学变化。【结论】肿节风三清颗粒在最大给药量为75g/kg体重（以颗粒计）,其最大给药量远远超过5000mg/kg,仍不引起动物死亡,说明该药对小鼠无急性毒性作用;肿节风三清颗粒连续给药35天,未对大鼠的血液学、血液生化指标、脏器产生不良影响,表明该药无亚慢性毒性作用。

关键词：肿节风三清颗粒急性毒性亚慢性毒性

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牛奶中磺胺类药物残留不同检测方法的比较

牛奶中磺胺类药物残留不同检测方法的比较

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中国毒理学会兽医毒理学委员会与中国畜牧兽医学会兽医食品卫生学分会联合学术研讨会暨中国毒理学会兽医毒理学委员会第5次全国会员代表大会

作者：马明芳李成龙张素霞王战辉北京市食品营养与人类健康高精尖研究中心中国农业大学动物医学院

【目的】建立快速、高效、灵敏的免疫分析方法,检测牛奶中磺胺类药物残留。【方法】本实验比较了三种不同的免疫检测方法,酶联免疫检测（ELISA）,荧光偏振检测（FPIA）和化学发光共振能量转移（CRET）检测方法。ELISA体系,将磺胺半抗原B... 详细信息

【目的】建立快速、高效、灵敏的免疫分析方法,检测牛奶中磺胺类药物残留。【方法】本实验比较了三种不同的免疫检测方法,酶联免疫检测（ELISA）,荧光偏振检测（FPIA）和化学发光共振能量转移（CRET）检测方法。ELISA体系,将磺胺半抗原BS与BSA偶联,得到的BS-BSA作为包被原,采用间接竞争方法进行检测;FPIA体系中采用荧光素4'-AMF标记磺胺半抗原BS,得到4'-AMF-BS,4'-AMF-BS与磺胺标准品（SMZ）竞争结合磺胺单克隆抗体4D建立均相体系,检测体系偏振值的信号变化;CRET体系,将磺胺单克隆抗体4D透析纯化,使用过碘酸钠法将其与辣根过氧化物酶（HRP）偶联,得到酶标抗体Ab4D-HRP。利用碳二亚胺法（EDC）将磺胺药物半抗原BS与表面带有氨基基团的水溶性量子点（NH-QDs）进行共价偶联,得到QDs-BS,QDs-BS与磺胺药物标准品（SMZ）竞争Ab4D-HRP,加入底物鲁米诺,检测该均相体系中量子点荧光信号值变化。三种检测方法体系均选择磷酸盐缓冲溶液（PBS）作为稀释液。将牛奶样本用等体积1.5%的三氯乙酸处理,沉淀蛋白,上清液使用PBS分别进行2倍（ELISA）、4倍（FPIA）和20倍（CRET）稀释可基本消除基质效应。【结果】三种检测方法ELISA、FPIA、CRET对磺胺二甲基嘧啶（SMZ）的检测限分别为:12.1μg/L、0.151μg/L、0.009μg/L;三种方法的回收率均在64.7%-125.3%之间,变异系数均小于16.3%。【结论】本研究比较了三种不同的免疫检测方法,所建立的方法灵敏度和检测限均满足我国牛奶中对磺胺药物的残留检测要求。而且,基于量子点的CRET检测方法灵敏度高于FPIA和ELISA,而且CRET均相反应体系比ELISA方法更省时简便,性质更加优越。

关键词：酶联免疫检测(ELISA) 荧光偏振检测(FPIA) 化学发光共振能量转移(CRET) 磺胺药

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紫叶止嗽口服液急性毒性试验研究

紫叶止嗽口服液急性毒性试验研究

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中国毒理学会兽医毒理学委员会与中国畜牧兽医学会兽医食品卫生学分会联合学术研讨会暨中国毒理学会兽医毒理学委员会第5次全国会员代表大会

作者：孙卓健郝智慧赵莉

【研究目的】开展紫叶止嗽口服液急性毒性试验研究,以评价紫叶止嗽口服液的安全性。【实验方法】预实验取4周龄、体重18g2g的SPF级昆明种健康小鼠8只,体重18～22g,雌雄各半,随机分为紫叶止嗽口服液组和生理盐水对照组,每组4只,实验前禁... 详细信息

【研究目的】开展紫叶止嗽口服液急性毒性试验研究,以评价紫叶止嗽口服液的安全性。【实验方法】预实验取4周龄、体重18g2g的SPF级昆明种健康小鼠8只,体重18～22g,雌雄各半,随机分为紫叶止嗽口服液组和生理盐水对照组,每组4只,实验前禁食（不禁水）12h。将25%的紫叶止嗽口服液,按0.4ml/20gb.w给紫叶止嗽口服液组小鼠1次灌胃,将等体积生理盐水给予对照组小鼠。给药后连续观察4h,以后每日上、下午各观察一次,共观察7d内小鼠的死亡情况。换取小鼠10只,体重18～22g,雌雄各半,随机分为2组,即紫叶七嗽口服液组和生理盐水对照组,每组5只,实验前禁食（不禁水）12h,重复一次预实验。单次最大给药剂试验取小鼠20只,体重18～22g,雌雄各半,随机分为2组,即紫叶止嗽口服液组和生理盐水对照组,每组10只,实验前禁食（不禁水）12h,将紫叶止嗽口服液原液按0.4ml/20gb.w给小鼠1次灌胃。单次最大给药剂量为20ml/kgb.w,空白组给予等体积生理盐水。给药后连续4h内,观察小鼠存活情况和生理活动。之后每天上午下午各观察一次,详细记录7d内受试小鼠饮食活动、行为及死亡情况,死亡小鼠及时进行尸检,观察期结束后,全部小鼠脱颈椎处死,解剖并观察主要内脏器官的变化。单次最大耐受量试验取小鼠20只,体重18～22g,雌雄各半,随机分为2组,即紫叶止嗽口服液组和生理盐水对照组,每组10只,实验前禁食（不禁水）12h,将紫叶止嗽口服液原液按0.4ml/20g体重给小鼠1次灌胃。24h内给药3次,每次间隔4h,对照组给于等体积生理盐水。给药后连续4h内,观察小鼠存活情况和生理活动。之后每天上午下午各观察一次。详细记录7d内受试小鼠饮食活动、行为及死亡情况,死亡小鼠及时进行尸检,计算小鼠口服紫叶止嗽口服液的最大耐受量。观察期结束后,全部小鼠脱颈椎处死,解剖并观察主要内脏器官的变化。【结果】以0.4ml/20g给小鼠灌胃紫叶止嗽口服液原液以及24h内迮续给药3次,累计最大给药量达60ml/kgb.w时,试验观察期内所有小鼠均存活,且采食、饮水、排便等正常,未出现明显的毒性反应,观察期结束后处死存活的小鼠,眼观病理学检查亦未发现明显可见的病理变化。结果表明,紫叶止嗽口服液小鼠经口染毒,LD50大于5g/kg。【结论】根据有关外源性化学物急性毒性分级标准进行评价,实验结果表明紫叶止嗽口服液属实际无毒。

关键词：紫叶止嗽口服液急性毒性小鼠

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复方苦玄参颗粒的毒理学评价

复方苦玄参颗粒的毒理学评价

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中国毒理学会兽医毒理学委员会与中国畜牧兽医学会兽医食品卫生学分会联合学术研讨会暨中国毒理学会兽医毒理学委员会第5次全国会员代表大会

作者：廖晓光吴莉芩颜国庆文雪梅何超远何家康广西大学动物科学技术学院

【目的】复方苦玄参颗粒为本课题组筛选广西道地药材苦玄参、桃金娘为主要药味经加工制成的纯中药复方颗粒制剂。本研究旨在考察复方苦玄参颗粒的急性毒性和亚慢性毒性。【方法】急性毒性试验:经过预试验发现,一次性给小鼠灌胃给药,未测... 详细信息

【目的】复方苦玄参颗粒为本课题组筛选广西道地药材苦玄参、桃金娘为主要药味经加工制成的纯中药复方颗粒制剂。本研究旨在考察复方苦玄参颗粒的急性毒性和亚慢性毒性。【方法】急性毒性试验:经过预试验发现,一次性给小鼠灌胃给药,未测出LD50,故采用24小时内多次给药的方式测定最大给药量。亚慢性毒性试验:将80只大鼠分为4组,每组20只(雌雄各半),设定高、中、低三个剂量组,给药剂量分别1.34g/100g体重、0.67g/100g体重、0.32g/100g(以颗粒计),并设一个生理盐水对照组(1mL/100g体重),每天灌胃给药一次,连续给药35天(即共5周)。于给药结束后,每组取10只动物(雌、雄各半)处死取血,进行血常规和生化指标检测,并进行病理剖检和组织学检查。【结果】急性毒性试验:小鼠24 h内灌胃给药3次,每次0.54g/20g体重,每次间隔8小时,在最大给药量为1.62/20g,即80.4g/kg体重(以颗粒计)时仍未出现任何毒性反应。亚慢性毒性试验:高、中、低剂量组及对照组大鼠在35天给药期间,活动正常、毛发光润、摄食,饮水、粪便均正常,未发现中毒症状,动物无一死亡,临床表现正常。各试验组给药结束时,雌、雄性大鼠的体重增重与对照组相比均无显著差异(P>0.05)。血液学检查结果,给药结束后,各组大鼠血液学和血液生化与对照组相比,著异不显著(P>0.05)。病理剖检和组织学检查结果,给药结束后,剖检大鼠,经肉眼观察均未发现任何异常和可疑病变。将复方苦玄参颗粒高剂量组和对照组大鼠的肝、脾、肺、肾、胃、肠、睾丸(♂)及子宫(♀)组织进行组织病理学切片检查,结果均未发现异常的组织病理学变化。【结论】复方苦玄参颗粒在最大给药量为80.4g/kg体重(以颗粒计),其最大给药量远远超过5000mg/kg,仍不引起动物死亡,说明该药对小鼠无急性毒性作用;复方苦玄参颗粒连续给药35天,对大鼠增重、摄食、血常规及血液生化指标、脏器无不良影响,表明复方苦玄参颗粒无亚慢性毒性作用。

关键词：复方苦玄参颗粒毒理学急性毒性亚慢性毒性

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生鲜牛奶中双氯芬酸钠残留检测方法的建立

生鲜牛奶中双氯芬酸钠残留检测方法的建立

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中国毒理学会兽医毒理学委员会与中国畜牧兽医学会兽医食品卫生学分会联合学术研讨会暨中国毒理学会兽医毒理学委员会第5次全国会员代表大会

作者：刘希望杨亚军秦哲孔晓军李世宏郭玉凡李剑勇中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所/农业部兽用药物创制重点实验室/甘肃省新兽药工程重点实验室郑州百瑞动物药业有限公司

非甾体抗炎药双氯芬酸钠在欧盟已被批准用于猪和牛,欧盟规定（2009）双氯芬酸钠在牛和猪可食性组织中的双氯芬酸钠残留标识物为双氯芬酸,肌肉、脂肪、肝脏和肾脏中的残留限量（MRLs）分别5、1、5和10μg/kg;牛奶中的残留标识物亦为双氯... 详细信息

非甾体抗炎药双氯芬酸钠在欧盟已被批准用于猪和牛,欧盟规定（2009）双氯芬酸钠在牛和猪可食性组织中的双氯芬酸钠残留标识物为双氯芬酸,肌肉、脂肪、肝脏和肾脏中的残留限量（MRLs）分别5、1、5和10μg/kg;牛奶中的残留标识物亦为双氯芬酸,MRL为0.1μg/kg。【目的】本研究拟建立生鲜牛奶中双氯芬酸钠的残留检测方法。【方法】取试料10 g,加入托芬那酸（内标）混匀静置后,加入10 mL乙腈及1 g乙酸铵,高速涡旋1 min,4℃条件下4500 g离心20 min;取上清液7 ml转入10 mL带盖聚丙烯离心管中,50℃条件下氮气吹干,加入200μL0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸（50+50）,涡旋振荡30 s,经孔径为0.22μm滤膜过滤后,进样;梯度洗脱,进行HPLC-ESI+-MS/MS,MRM模式,双氯芬酸钠的监测离子为296.0→250*,215,托芬那酸的监测离子为262.0→209*,244。取空白试料,加入双氯芬酸钠和托芬那酸标准溶液,按照前述方法提取、净化,并检测,绘制标准曲线,确定线性范围及相关系数等。【结果】检测限和定量限分别为0.03和0.05μg/kg,在0.05～5μg/kg的浓度范围内,线性关系良好,相关系数大于0.99;双氯芬酸钠的添加浓度分别为0.05、0.5和5μg/kg时,其加样回收率在84.6%08.5%之间,批内变异系数小于10%,批间变异系数小于25%,符合农业部相关文件的要求。【结论】该方法稳定可靠,简便易行,满足牛奶中双氯芬酸钠残留（MRL为0.1μg/kg）的检测要求,可用于牛奶中双氯芬酸钠残留量的测定,以及双氯芬酸钠注射液给药后,牛奶中双氯芬酸钠的残留消除研究。

关键词：双氯芬酸钠牛奶残留 HPLC-MS/MS

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“毛泽东思想与中华民族解放与复兴”学术研讨会暨全国毛泽东哲学思想研究会第22次年会综述

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湖南科技大学学报（社会科学版） 2015年第5期18卷 F0002-F0002,F0003页

作者：王晓峰南京大学哲学系南京工业职业技术学院

2015年7月25日至27日．由全国毛泽东哲学思想研究会主办、中共南京市委党校承办的“毛泽东思想与中华民族解放和复兴”学术研讨会暨全国毛泽东哲学思想研究会第22次年会在南京召开。参加此次会议的有来自中央文献研究室、中共中央党校... 详细信息

2015年7月25日至27日．由全国毛泽东哲学思想研究会主办、中共南京市委党校承办的“毛泽东思想与中华民族解放和复兴”学术研讨会暨全国毛泽东哲学思想研究会第22次年会在南京召开。参加此次会议的有来自中央文献研究室、中共中央党校、中共中央党史研究室、教育部社科司、上海市社会科学院、山东省社会科学院、湖南省社会科学院、四川省社会科学院、中国人民大学、南京大学、中山大学、武汉大学、湘潭大学等学术研究机构与高等院校的100余位专家学者。

关键词：毛泽东哲学思想学术研讨会毛泽东思想年会综述民族解放湖南省社会科学院中华中共中央党校

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益生蜡样芽孢杆菌中新型四环素耐药基因tet(45)变体的研究

益生蜡样芽孢杆菌中新型四环素耐药基因tet(45)变体的研究

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中国毒理学会兽医毒理学委员会与中国畜牧兽医学会兽医食品卫生学分会联合学术研讨会暨中国毒理学会兽医毒理学委员会第5次全国会员代表大会

作者：崔一芳刘晓晔罗海玲丁双阳朱奎中国农业大学动物医学院动物营养学国家重点实验室中国农业大学动物科技学院

【目的】研究益生蜡样芽孢杆菌中携带的新型四环素耐药基因tet(45)变体的功能及进化分析。【方法】结合特异性外排泵抑制剂与最小抑菌浓度检测试验(MIC),确证tet(45)变体的功能;比较该基因与已报道的四环素外排泵型耐药基因,进行进化分... 详细信息

【目的】研究益生蜡样芽孢杆菌中携带的新型四环素耐药基因tet(45)变体的功能及进化分析。【方法】结合特异性外排泵抑制剂与最小抑菌浓度检测试验(MIC),确证tet(45)变体的功能;比较该基因与已报道的四环素外排泵型耐药基因,进行进化分析;通过氨基酸序列二级结构模拟,对比tet(45)基因及tet(45)变体蛋白结构的差异。【结果】益生蜡样芽孢杆菌中携带的新型四环素耐药基因tet(45)变体可介导菌株对四环素、多西环素、土霉素和金霉素产生耐药性;可通过外排泵蛋白抑制剂如CCCP(Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)、PAβN(Phe-Arg-β-naphthylamide dihydrochloride)及Reserpine恢复该菌株对四环素类药物的敏感性。进一步分析表明该变体与tet(45)基因都属于主要易化超家族(MFS)Ⅱ型外排泵型四环素耐药基因,同时通过与已报道的四环素外排泵型耐药基因对比发现,tet(45)变体在不同种属的细菌中分布广泛。tet(45)变体的蛋白结构与Tet(45)基本一致,都包括一个12个核心螺旋组成跨膜结构,仅在环区(loop region)和α-螺旋(α-helix)处有细微差异。【结论】结合之前的研究,该蜡样芽孢杆菌中所携带的新型、位于一个可移动元件上四环素耐药基因应归为tet(45)变体。因此,新型tet(45)变体的发现将对动物性食品安全和人类健康都构成严重的潜在危害。

关键词：益生菌蜡样芽胞杆菌 tet(45) 四环素

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土壤宏基因组文库中四环素耐药基因的功能筛选

土壤宏基因组文库中四环素耐药基因的功能筛选

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中国毒理学会兽医毒理学委员会与中国畜牧兽医学会兽医食品卫生学分会联合学术研讨会暨中国毒理学会兽医毒理学委员会第5次全国会员代表大会

作者：王绍琛高霞高月皎李延清冯治洋南京农业大学食品科技学院

【目的】土壤微生物是抗生素耐药基因的起源和最大的储存库,土壤耐药基因组中蕴含了大量未知的耐药基因,可能通过基因的水平转移对生态环境和人类健康构成潜在威胁。宏基因组学方法可最大限度挖掘土壤中庞大的耐药基因组多样性,进而为... 详细信息

【目的】土壤微生物是抗生素耐药基因的起源和最大的储存库,土壤耐药基因组中蕴含了大量未知的耐药基因,可能通过基因的水平转移对生态环境和人类健康构成潜在威胁。宏基因组学方法可最大限度挖掘土壤中庞大的耐药基因组多样性,进而为临床上细菌耐药性的预测及监控提供必要支持。【方法】将土壤样品总eDNA随机打断后与cosmid载体pWEB-TNC连接,并转染宿主细胞Escherichia coli EPI100-T1R构建宏基因组文库。应用功能宏基因组学筛选方法,对文库中四环素耐药克隆进行了筛选;并对阳性克隆中鉴定得到的四环素解构酶基因进行异源表达和生物化学分析,通过体外酶促反应和HPLC分析验证其生物活性。【结果】利用西藏、云南及四用土壤样品构建了三个平均插入片段约为38 kb的大容量宏基因组文库。从三个土壤文库中共筛选得到21个四环素外排泵基因,包括20个MFS家族基因和1个MATE家族基因。同时从珠穆朗玛峰土壤文库中得到2个新型四环素解构酶基因,与目前临床菌中唯一分离到的四环素解构酶Tet(X)仅有约20%氨基酸序列同源性。通过异源表达分别得到43 kDa和48kDa两个产物蛋白,经体外酶促反应验证了两个酶的体外四环素解构活性。【结论】本研究结果提示了四环素解构酶这一临床上长期被忽视的耐药机制可能是广泛存在的,有必要对其催化机制以及临床分布情况开展进一步研究。本研究同时证明了功能宏基因组学方法在挖掘新型耐药基因研究中的优势,对临床上细菌耐药性的监测具有早期预警的作用。

关键词：功能宏基因组学土壤四环素外排泵四环素解构酶

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