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组织工程化房室结的体外构建

组织工程化房室结的体外构建

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首届全国组织修复与再生医学大会暨国际组织修复与再生医学学术研讨会

作者：袁鑫立李玉泉张传森第二军医大学解剖教研室上海200433

目的：研究胚胎心脏祖细胞向心传导细胞的诱导分化,并以胚胎心脏祖细胞源性起搏细胞和传导细胞为种子细胞,体外构建组织工程化房室结的可行性.方法：用内皮素-1诱导胚胎心脏祖细胞的方法获得胚胎心脏祖细胞源性心起搏细胞,免疫荧光细胞...

目的：研究胚胎心脏祖细胞向心传导细胞的诱导分化,并以胚胎心脏祖细胞源性起搏细胞和传导细胞为种子细胞,体外构建组织工程化房室结的可行性.方法：用内皮素-1诱导胚胎心脏祖细胞的方法获得胚胎心脏祖细胞源性心起搏细胞,免疫荧光细胞化学技术鉴定诱导后的细胞;用神经调节蛋白-1诱导胚胎心脏祖细胞,获得胚胎心脏祖细胞源性心传导细胞,在光镜下观察细胞形态和搏动情况的变化,细胞免疫荧光、Real-Time PCR、WB等的方法检测鉴定诱导后细胞,并用电子显微镜观察细胞超微结构的变化;用胚胎心脏祖细胞源性起搏样细胞和传导系样细胞以1∶1的浓度分别种植在胶原海绵支架和水凝胶支架上,倒置相差显微镜观察细胞支架复合体的生长状态,HE染色、透射电镜和扫面电镜检测细胞与支架的相容性和细胞之间的连接.结果：经过内皮素-1诱导后的起搏细胞的表面分子标志物HCN4、CX45、HCN2表达呈阳性,而胚胎心脏祖细胞表面标志NKX2.5、OCT-4的表达变化不大;经神经调节蛋白-1诱导后,细胞形态发生明显的变化,细长条样的细胞和簇状集落明显增多,搏动更趋于一致性,在相同条件下跳动频率由300-400次/分钟降到100-150次/分钟,诱导前后细胞活力无明显变化,在第五天时细胞达到对数生长期.细胞超微结构显示,细胞间连接有显著增高.免疫荧光细胞染色显示诱导后细胞表达传导系细胞表面标志CX40、CMYBP-C和SMHC等,而起搏细胞表面标志HCN4,CX45,CX43的表达呈弱阳性.Real-Time PCR和Western-blot的结果与免疫荧光细胞化学的结果一致.传导样细胞具有传导系细胞的基本生理功能;可观察细胞支架复合体有规律跳动,细胞之间和细胞与支架之间有较好的细胞相容性,有明显的细胞间连接可见.结论：用内皮素-1和神经调节蛋白-1的方法可分别成功将胚胎心脏祖细胞诱导成起搏细胞和心传导样细胞;并且在体外初步成功构建组织工程化房室结.

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Treg细胞参与小鼠骨骼肌损伤修复的研究

Treg细胞参与小鼠骨骼肌损伤修复的研究

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首届全国组织修复与再生医学大会暨国际组织修复与再生医学学术研讨会

作者：黄岚张超奇乔亚敏李峰张毅郑州大学第一附属医院生物细胞治疗中心河南郑州450052 郑州大学第一附属医院胸外科郑州大学第一附属医院生物细胞治疗中心河南郑州450052 郑州大学生命科学院

目的：骨骼肌损伤是严重车祸、肌肉外伤、冻伤、战地伤等临床医学和运动医学领域中的一种常见疾患,骨骼肌损伤修复不良严重影响人们的日常生活和工作,如何促进骨骼肌修复是一个亟待解决的重要问题.调节性T(Treg)细胞是一类调节免疫反应...

目的：骨骼肌损伤是严重车祸、肌肉外伤、冻伤、战地伤等临床医学和运动医学领域中的一种常见疾患,骨骼肌损伤修复不良严重影响人们的日常生活和工作,如何促进骨骼肌修复是一个亟待解决的重要问题.调节性T(Treg)细胞是一类调节免疫反应的重要淋巴细胞亚群,传统上认为这类Foxp3+CD4+T细胞在体内主要发挥抑制免疫应答的功能.最近有文献报道在小鼠骨骼肌损伤局部发现有组织特异性Treg细胞聚集并参与骨骼肌修复的现象.本研究旨在探索Treg细胞在小鼠骨骼肌损伤中的作用及其相关机制,为骨骼肌损伤修复提供新的思路,并为再生医学提供新的治疗手段.方法：利用冻伤法构建小鼠骨骼肌急性损伤模型,并用胶原纤维染色(Masson三色染色法)鉴定肌肉损伤程度.在冻伤后不同时间,用流式细胞仪检测Treg细胞在受损肌肉中的比例;用免疫组化法检测受损肌肉中Treg细胞的浸润程度;用qRT-PCR法检测肌肉损伤部位Treg细胞特异性分子Foxp3和相关趋化因子(CCL3、CCL4、CCL5)、以及表皮生长因子家族的双调蛋白(Areg)、骨骼肌增殖分化基因MyoG等表达情况,并进行相关性分析.结果：Masson三色染色法显示成功建立了小鼠骨骼肌冻伤模型和评价体系.冻伤后不同时间在肌肉损伤局部均出现Treg细胞比率增加,其中第1天Treg细胞为(8.4±1.7)％,第2天为(12.1±2.3)％,第4天为(16.9±2.1)％,第7天为(13.1±1.9)％,第14天为(7.7±1.3)％,均较第0天对照组小鼠具有统计学差异(P＜0.05).免疫组化实验证实Treg细胞在肌肉损伤部位聚集.qRT-PCR结果显示损伤第4天Foxp3(P=0.0255)、CCL3 (P=0.0149)、CCL4 (P=0.0187)、CCL5 (P=0.0275)、Areg (P=0.0317)和MyoG(P=0.0166)在受损组织表达均增高.相关性分析提示Foxp3与Areg (P=0.0481)呈显著正相关,CCL3、CCL4、CCL5和MyoG也和Foxp3呈正相关.结论：本研究提示Treg细胞可能通过相关趋化因子募集到骨骼肌受损部位;Areg和MyoG等分子可能参与了Treg细胞介导的骨骼肌损伤修复,具体的分子机制正在研究中.

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早期胎儿表皮microRNAs调控TGF-β/Smads传导通路促进皮肤创伤无瘢痕愈合机制的研究

早期胎儿表皮microRNAs调控TGF-β/Smads传导通路促进皮肤创伤无...

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首届全国组织修复与再生医学大会暨国际组织修复与再生医学学术研讨会

作者：赵峰施萍庞希宁中国医科大学细胞生物学卫生部重点实验室干细胞与再生医学研究室沈阳110001 中国医科大学附属第一医院全科医学教研室沈阳110001

目的：哺乳动物妊娠早期,胎儿皮肤创伤可以快速愈合,并不伴有瘢痕和炎症反应.妊娠晚期,胎儿皮肤对创伤的反应从再生修复转变为成人的纤维化修复,并最终导致瘢痕形成.研究孕早、中期胎儿皮肤创伤无瘢痕愈合机制一直是创伤修复领域的研究...

目的：哺乳动物妊娠早期,胎儿皮肤创伤可以快速愈合,并不伴有瘢痕和炎症反应.妊娠晚期,胎儿皮肤对创伤的反应从再生修复转变为成人的纤维化修复,并最终导致瘢痕形成.研究孕早、中期胎儿皮肤创伤无瘢痕愈合机制一直是创伤修复领域的研究重点.表皮角质形成细胞在胎儿皮肤再生过程中起到了一定的作用.妊娠早期,皮肤创伤后再上皮化过程迅速,角质形成细胞的增殖及迁移能力显著高于妊娠晚期.并且,角质形成细胞能够通过对成纤维细胞的作用进而调控瘢痕形成过程.我们通过本研究检测人孕中、晚期胎儿角质形成细胞中miRNAs的表达差异并探讨表皮角质形成细胞中差异表达的miRNAs对皮肤创伤无瘢痕愈合的作用.方法：我们应用Solexa二代测序分别检测3例孕中期及3例孕晚期胎儿表皮角质形成细胞中miRNAs的表达.在去除低质量序列并与人类基因组数据库及已知非编码RNA数据库比对后,应用mirTools 2.0网站运行miRDeep 2.0在测序结果原始数据中预测候选新miRNAs.实时定量PCR技术验证测序得到的miRNAs相对表达结果.RNAfold及UCSC预测候选新miRNAs的二级结构及其在基因组中的定位.将候选新miRNAs与已知miRNA数据库比对预测候选新miRNAs的保守性.生物信息学分析方法预测候选新miRNAs的靶基因及靶向传导通路.结果：我们检测出106个高度可能成为新miRNA的候选新miRNAs.将测序与实时定量PCR的检测结果进行相关性分析得出测序结果具有很高的可重复性,可以代表不同胎龄的人角质形成细胞中miRNAs的基本相对表达情况.通过RNAfold,我们获得候选新miRNAs前体序列的二级结构等相关信息.我们预测出25个与已知各物种miRNAs具有相同种子序列的候选新miRNAs.其中,获得了19个保守性高的候选新miRNAs,8个是与已知人miRNAs有高度保守性的.孕晚期胎儿角质形成细胞中miRNAs的表达总体呈降低趋势.不同胎龄的表皮角质形成细胞中,6对miRNAs存在成簇表达的现象.生物信息学预测差异表达的miRNAs能够广泛调控TGF-β/Smads传导通路.结论：与孕中期相比,孕晚期胎儿角质形成细胞中miRNAs的表达总体呈降低趋势.孕中期角质形成细胞中高表达的miRNAs通过显著抑制TGF-β/Smads传导通路促进胎儿无瘢痕愈合.

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OCT4诱导人毛囊间充质干细胞向红细胞分化

OCT4诱导人毛囊间充质干细胞向红细胞分化

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首届全国组织修复与再生医学大会暨国际组织修复与再生医学学术研讨会

作者：刘志晶李玉林全成实孙连坤吉林大学基础医学院 130021

目的：研究OCT4诱导人毛囊间充质干细胞(hHFMSCs)向红细胞分化的作用方法：(1)用携带OCT4的慢病毒转导hHFMSC,用RT-qPCR及Western Blot鉴定转导结果;(2) OCT4转导后的hHFMSC形态改变及造血标志物的表达;(3)造血相关的细胞因子诱导hHFMSC...

目的：研究OCT4诱导人毛囊间充质干细胞(hHFMSCs)向红细胞分化的作用方法：(1)用携带OCT4的慢病毒转导hHFMSC,用RT-qPCR及Western Blot鉴定转导结果;(2) OCT4转导后的hHFMSC形态改变及造血标志物的表达;(3)造血相关的细胞因子诱导hHFMSCOCT4向红细胞分化：利用Wright-Giemsa染色观察细胞形态改变,细胞免疫荧光和流式细胞术检测红细胞特异性标志物;(4) RT-qPCR检测OCT4靶基因.结果：(1)携带OCT4慢病毒转导hHFMSC及鉴定：转导后的hHFMSCs中EGFP阳性细胞占88.92％,OCT4的mRNA和总蛋白表达明显上调.(2) OCT4转导后的hHFMSC形态改变及造血标志物的表达：①转导后细胞由大变小,由长梭形变成类圆形,14d后出现易悬浮的细胞亚群,呈克隆样生长;②OCT4转导后hHFMSCs中CD45阳性细胞占1.5％,悬浮的hHFMSCs中CD34阳性细胞占2.19％.(3)转导OCT4的hHFMSCs向红细胞分化：①光镜下观察,造血诱导第7d开始出现造血集落,10-20d先后出现红系爆炸式集落及红系集落形成单位;②Wright-Giemsa染色显示,第7d开始先后出现早幼红、中幼红和晚幼红细胞,第20d晚幼红细胞数量不再增加.③造血诱导第7-20d的细胞表达红系祖细胞标志CD71和CD235a,同时表达血型蛋白A和B;诱导第23d红细胞完成脱核,80％以上红细胞表达成人型β血红蛋白;④hHFMSC向红细胞分化中细胞直径及核质比逐渐减小,血红蛋白化逐渐增加.(4) hHFMSCs向红细胞分化中OCT4靶基因的表达：OCT4转导后,多潜能相关的靶基因OCT4、NANOG、SEMA3A和LEFTY2和造血相关的靶基因FLI1、TAL1、HBG1和CA2表达均上调.造血诱导21d后,多潜能相关的靶基因LEFTY2及OCT4显著下调,而造血相关的靶基因TAL1、HBG1和RHD表达显著上调.结论：(1)转录因子OCT4可以诱导hHFMSC向红细胞分化;(2)由hHFMSC分化的红细胞表达成人型血红蛋白;(3)转录因子OCT4通过调控造血相关靶基因的表达促使hHFMSC向红细胞分化.

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羊膜联合水凝胶及hAMSCs对大鼠腓总神经损伤的修复作用

羊膜联合水凝胶及hAMSCs对大鼠腓总神经损伤的修复作用

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首届全国组织修复与再生医学大会暨国际组织修复与再生医学学术研讨会

作者：杨进范振海魏再荣王钰莹方宁孙广峰刘燕飞余丽梅遵义医学院附属医院贵州省细胞工程重点实验室(贵州省细胞工程中心) 贵州遵义563003 遵义医学院附属医院烧伤整形外科贵州遵义563003

目的：研究羊膜联合水凝胶及人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)对大鼠腓总神经损伤的修复作用。方法：机械分离和二酶消化、差速贴壁法培养hAMSCs,观察细胞形态与生长,流式细胞术鉴定细胞表型。制作新鲜羊膜片,BeaverNano？水凝胶与hAMSCs组装...

目的：研究羊膜联合水凝胶及人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)对大鼠腓总神经损伤的修复作用。方法：机械分离和二酶消化、差速贴壁法培养hAMSCs,观察细胞形态与生长,流式细胞术鉴定细胞表型。制作新鲜羊膜片,BeaverNano？水凝胶与hAMSCs组装,神经切除制备腓总神经损伤,观测大鼠行走、趾展情况和神经传到速度(NCV),计算趾展功能(TSF),FB逆向轴浆运输荧光染色,称量胫骨前肌湿重,计算肌肉恢复率,病理组织学检查肌肉组织变化,定量PCR测定脊髓组织基因转录水平。结果：(1)传代培养第3-5代hAMSCs形态、生长方式和免疫表型符合以往所述鉴定标准。(2)术后3和7d,除空白组外,其余大鼠右后肢均出现跛行或足不触地,足展距离较窄,TSF降低;第14d,羊膜片组与缝合组大鼠足印和趾展距离均大于模型组,TSF由高至低依次为：羊膜片组、空白组＞缝合组＞模型组、HG-AMP组、羊膜+hAMSCs+水凝胶(HG-hAMSCs-AMP组);28d,各组足印和趾展距离均有不同程度的进一步恢复;不同时间点TSF比较,羊膜片组于术后第7和14d TSF恢复速度最快,缝合组TSF则于14、28d逐渐恢复。(3)术后28d,与模型组比较,其他4组NCV增高,依次为空白组＞羊膜片组、HG-AMP组、HG-hAMSCs-AMP组。(4)胫骨前肌肌肉恢复率由高至低依次为空白组＞羊膜片组＞缝合组＞ HG-AMP和HG-hAMSCs组。空白组肌肉组织结构完整、清晰,羊膜片组最接近空白组,且炎细胞浸润较少;缝合组可见轻微的肌肉萎缩性改变,模型组肌肉萎缩明显,炎细胞浸润较多;HG-AMP组肌肉萎缩较HG-hAMSCs-AMP组和缝合组明显。(5)除模型组外,其余各组均可见一定量FB蓝色荧光物质,空白组最多。(6)模型组脊髓中BDNF、CRMP-2、GAP-43、Lingo-1、NGF mRNA水平高于空白组,而GDNF mRNA水平降低;羊膜片组除Lingo-1和GDNF mRNA表达与模型组无显著差异外,其余4种基因mRNA表达水平均与空白组相当。结论：新鲜人羊膜可及早促进离断后缝合的腓总神经功能恢复,减轻所支配肌肉萎缩,提高TSF,疗效优于单纯缝合术。各组脊髓组织中BDNF、CRMP-2、GAP-43、Lingo-1、NGF和GDVF mRNA表达的变化进一步确证了人羊膜应用的效应。

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京尼平交联猪小肠黏膜下层的制备及评价

京尼平交联猪小肠黏膜下层的制备及评价

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首届全国组织修复与再生医学大会暨国际组织修复与再生医学学术研讨会

作者：王昱龚梅陈曦李胜富解慧琪四川大学华西医院干细胞与组织工程研究室四川省成都市高朋大道科园四路1号 610041

目的：猪小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS)已成功应用于多种组织器官的损伤修复,但由于SIS主要由胶原蛋白构成,在酸性及酶解环境中易降解,因此限制了其在消化道黏膜修复中的应用.本研究使用京尼平(genipin,GP)对SIS进行交...

目的：猪小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS)已成功应用于多种组织器官的损伤修复,但由于SIS主要由胶原蛋白构成,在酸性及酶解环境中易降解,因此限制了其在消化道黏膜修复中的应用.本研究使用京尼平(genipin,GP)对SIS进行交联,在保持SIS良好的生物相容性及生物活性的前提下提高其抗酸、抗酶解性能,研究其在胃黏膜缺损修复中的可能应用.方法：本实验通过交联指数的测定及初步的抗酸、抗酶解实验对京尼平交联猪小肠黏膜下层(GP-crosslinked SIS)的制备条件进行筛选.通过溶胀率和红外吸收光谱对GP-crosslinked SIS的交联效率及分子结构进行分析.采用扫描电镜对材料的亚显微结构进行观察.我们将未交联的SIS及GP-crosslinked SIS浸泡在模拟胃液中,测定材料的剩余质量百分比;在力学性能评价中,通过单轴拉伸实验对模拟胃液处理后GP-crosslinked SIS的最大载荷和刚度进行测定.通过酶联免疫吸附实验比较SIS及0.5％GP-crosslinked SIS中生长因子VEGF和TGF-β1在14天内的释放情况.通过直接细胞毒性和间接细胞毒性实验对材料的细胞相容性和细胞毒性进行评价.在组织相容性研究中,将SIS及GP-crosslinked SIS植入大鼠皮下,进行组织学评价.结果：确定了GP-crosslinked SIS的制备条件,即在37℃条件下采用浓度为0.05％、0.1％、0.3％和0.5％的GP与SIS交联24 h.溶胀率结果显示,GP与SIS交联反应效率较高;红外光谱分析结果显示,GP通过与SIS中的氨基发生反应进行高效交联.扫描电镜结果显示,GP交联后SIS保持了其多孔结构,有利于细胞粘附.模拟胃液处理GP-crosslinked SIS 8周后,材料的降解率小于10％,且保持了一定的最大载荷和刚度.直接细胞毒性和间接细胞毒性实验结果显示, GES-1在GP-crosslinked SIS上呈明显延展态;且GES-1在GP-crosslinked SIS浸提液中的增殖率大于100％.ELISA检测结果显示,0.5％ GP-crosslinked SIS中VEGF和TGF-β1在14天内累计释放量分别达到了72.4±9.6 pg和59.1±3.4 pg.将GP-crosslinked SIS植入大鼠皮下8周,炎性反应较轻,无明显降解出现.结论：京尼平交联后SIS的抗酸、抗酶解性能显著提高,且保持了一定的力学性能及生物活性,细胞毒性低、组织相容性好,有望应用于促进胃黏膜损伤的修复.

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轻微升高的血糖通过刺激糖尿病大鼠β细胞复制从而促进β细胞再生,治疗糖尿病的研究

轻微升高的血糖通过刺激糖尿病大鼠β细胞复制从而促进β细胞再生...

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首届全国组织修复与再生医学大会暨国际组织修复与再生医学学术研讨会

作者：程愈郝好杰申晶母义明韩为东解放军总医院基础研究所 100083 解放军总医院内分泌科 100083 解放军总医院基础研究所 100083 解放军第309医院 100094 解放军总医院内分泌科 100083

目的：寻找简便易行的方法促进β细胞再生将会为糖尿病治疗带来福音.葡萄糖长久以来被认为是调控β细胞复制的关键因子.大量体内,体外研究表明轻微升高的β糖可以有效促进β细胞的复制,并且不影响β细胞的存活.然而,并未有研究将轻微升...

目的：寻找简便易行的方法促进β细胞再生将会为糖尿病治疗带来福音.葡萄糖长久以来被认为是调控β细胞复制的关键因子.大量体内,体外研究表明轻微升高的β糖可以有效促进β细胞的复制,并且不影响β细胞的存活.然而,并未有研究将轻微升高的血糖应用于糖尿病模型中,观察其对抗糖尿病的效应.因此,我们的研究旨在观察将糖尿病模型血糖控制在轻微升高的范畴后,β细胞复制,再生以及糖尿病的恢复情况.方法：空腹12h,给予8周龄SD雄性大鼠单次大剂量STZ(60mg/kg)注射,48小时后将糖尿病大鼠分为三组：高糖组,不给予任何处理;稍高血糖组,每日给予甘精胰岛素控制血糖15～18mmol/L;正常血糖组,每日给予甘精胰岛素控制血糖≤11.1mmol/L.观察期三个月.定期监测动物血糖、血清胰岛素的变化,观察期末各组大鼠行腹腔糖耐量实验.在一定时间点取各组胰腺组织行连续冰冻切片,分离胰岛行PCR及western实验.观察各组动物β细胞复制,数量及存活.结果：(1)稍高血糖组所需胰岛素用量逐渐减少,一月左右可撤离胰岛素,血糖即可维持15～18mmol/L,胰岛素撤离后随机血糖继续改善,观察期末基本恢复正常(9～14mmol/L),空腹胰岛素水平恢复正常.腹腔糖耐量试验提示糖清除和糖刺激胰岛素的分泌均接近正常.正常血糖组所需胰岛素用量缓慢增加,撤离后血糖反弹至约27mmol/L,空腹胰岛素水平接近正常,但糖刺激后胰岛素分泌只有轻微的升高.(2)高糖组动物β细胞数量逐步减少.轻微升高的血糖促进了胰岛再生及结构的重塑,β细胞数量恢复至正常水平50％左右.正常血糖仅可抑制β细胞数量的进一步减少,β细胞数量保持在正常水平10％左右.(3)轻微升高的血糖显著刺激了β细胞的复制,此效应在正常血糖组大大削减.(4)高糖组β细胞凋亡轻微增加,其余两组与正常对照相比无区别.结论：轻微升高的血糖刺激了胰岛素缺乏的糖尿病大鼠中β细胞的复制,从而促进了β细胞的再生,恢复了胰岛的功能,有效控制血糖,并且未影响新生β细胞的存活.本研究的完成提供了一个简便易行的促进β细胞再生的方法,为糖尿病的治疗开启一扇新的大门.

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用动物固定装置观察负压封闭敷料对小型猪全层皮肤缺损创面修复的影响

用动物固定装置观察负压封闭敷料对小型猪全层皮肤缺损创面修复的...

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首届全国组织修复与再生医学大会暨国际组织修复与再生医学学术研讨会

作者：周文芳黎君友孙同柱吴志谷付小兵解放军总医院全军创伤修复与组织再生重点实验室暨皮肤损伤修复与组织再生北京市重点实验室北京100048

目的：负压封闭敷料已在临床创面修复广泛应用,并获得较好的愈合效果,但对其作用机理我们还不甚了解,本文通过自制动物固定装置,观察武汉维斯第牌负压封闭引流材料(VDS)对小型猪全层皮肤缺损创面修复作用的影响.方法：动物固定装置：由...

目的：负压封闭敷料已在临床创面修复广泛应用,并获得较好的愈合效果,但对其作用机理我们还不甚了解,本文通过自制动物固定装置,观察武汉维斯第牌负压封闭引流材料(VDS)对小型猪全层皮肤缺损创面修复作用的影响.方法：动物固定装置：由不锈钢材料构成,包括可自由移动架、两用悬吊棒、悬吊制式服装、接大小便托盘和可放置负压吸引机和吸引罐的悬挂篮组成.动物模型制备：将4月龄小型猪全麻、备皮、消毒后于脊柱两侧各制一个全层皮肤缺损创面(4.5cm×4.5cm).实验分组：A组对照组,凡士林油纱布和4层无菌纱布覆盖包扎;B组125mmHg持续负压24h,至伤后24d.伤后分别将小型猪悬挂于动物固定装置上,单笼喂养,自由饮食.通过大体观察、皮下血流监测和细菌学判断负压封闭敷料对小型猪全层皮肤缺损创面的修复作用.结果：伤后早期大体观察显示两组创面新鲜,均无脓性分泌物.A组创面渗出物较B组多,B组创面无明显分泌物、无水肿.伤后7d,两组创面上皮生长较明显,其上皮化率均能达40％～60％;两组创面有不同程度的肉芽组织生长,A组肉芽填充率＜30％较B组差,B组能达50％以上.伤后14d,两组创面基本长平,A组肉芽填充率低于90％,B组可达到90％以上.伤后21d,A组上皮化率较B组差,B组能达到80％以上.伤后24d两组创面基本愈合.皮下血流监测,伤后4d B组血流灌注量较A高.伤后7d～21d两组血流灌注量均有所下降,但B组仍高于A组.伤后28d B组血流灌注量恢复到伤前水平,A组较高.细菌监测,伤后4d和7d大多创面细菌明显增多,A组细菌量较B组高.10d～21 d两组创面细菌均逐步下降,A组略高于B组.结论：动物固定装置能满足负压封闭引流材料实验研究的需要.在28d的实验中能保证小型猪固定良好,方便更换敷料.在固定状态下小型猪能自由饮水,进食和排便;同时能保证激光多普勒成像仪和其他相关指标的正常检测.负压封闭引流下创面血流量很快增加,能够有效除去创面的渗透液,减轻创面与创周的组织水肿,促进大量新生肉芽组织形成,为上皮爬行提供了基础,负压可促进创面引流的畅通,将存留于创面局部的坏死组织、细菌、分泌物等吸出,减少了创面局部细菌的繁殖.通过连续治疗后使用负压引流的方法创面愈合效果明显较对照组好.

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人羊膜联合rhEGF治疗皮肤Ⅲ度烧伤实验研究

人羊膜联合rhEGF治疗皮肤Ⅲ度烧伤实验研究

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首届全国组织修复与再生医学大会暨国际组织修复与再生医学学术研讨会

作者：冯国纹惠学玲王钰莹王达利范振海赵玉洁肖瑜余丽梅遵义医学院附属医院贵州省细胞工程重点实验室贵州遵义563003 遵义医学院附属医院烧伤整形外科贵州遵义563003

目的：探讨人羊膜(HAM)联合重组人表皮生长因子凝胶(rhEGF)治疗皮肤Ⅲ度烧伤的疗效与作用机制.方法：铜棒烫伤制备兔皮肤Ⅲ度烧伤,切痂后创面贴敷HAM、HAM+rhEG、rhEGF,观测烧伤创面愈合率、痊愈时间,创面组织病理学检查,免疫组化染色...

目的：探讨人羊膜(HAM)联合重组人表皮生长因子凝胶(rhEGF)治疗皮肤Ⅲ度烧伤的疗效与作用机制.方法：铜棒烫伤制备兔皮肤Ⅲ度烧伤,切痂后创面贴敷HAM、HAM+rhEG、rhEGF,观测烧伤创面愈合率、痊愈时间,创面组织病理学检查,免疫组化染色与图像分析微小血管密度,双色免疫荧光染色观察人源细胞定植,Masson染色与图像分析检测皮肤组织纤维化程度,ELISA法检测创面组织细胞因子含量.结果：①切痂术后第3d、8d、18d,HAM组烧伤创面愈合率分别为(35.78±6.75)％、(71.21±6.63)％和(96.65±1.42)％,与HAM+rhEG组愈合率相当,两组均高于rhEGF组,3组不同处理的创面愈合率都高于对照组.HAM、HAM+rhEG组创面分别于18.40±1.26d和18.00±1.83d达痊愈,rhEGF组20.20±1.69d痊愈,3组痊愈时间均显著低于对照组22.13±1.25d.②HAM、HAM+rhEG组创面炎症反应明显较模型组、rhEGF组轻,并较早出现细胞增殖与创面修复,再生皮肤组织结构完整、附属器官丰富清晰,两组真皮层纤维化比率分别为(8.80±1.65)％和(8.50±1.70)％,低于正常组、对照组和rhEGF组;而皮下组织层纤维化比例为(16.48±1.86)％和(16.02±2.56)％,高于正常组,但明显低于对照组及rhEGF组.③第8d,HAM、HAM+rhEG组创面组织中,未检测到表达Cy3标记的人细胞核特异性抗原阳性的红色荧光细胞.且两组新生组织微细血管数显著高于对照组和rhEGF组,rhEGF组与对照组微细血管密度无明显差异.④第3d,HAM、HAM+rhEG、rhEGF组创面组织SDF-1表达量分别为192.63±17.39 ng/L, 157.76±8.69 ng/L and 199.21±27.77 ng/L,显著高于对照组和正常组,前两组又显著高于rhEGF组;并于第8、18d趋于正常皮肤组织水平.⑤第8d,HAM、HAM+rhEG、rhEGF组新生组织TGF-β含量分别为3441.50±125.27、3071.25±221.04和3504.00±134.41ng/L,显著高于对照组2912.50±181.68,HAM、HAM+rhEG组TGF-β含量又高于rhEGF组.⑥第8d,HAM、HAM+rhEG组创面组织EGF含量明显高于rhEGF组和对照组;第18d,HAM、HAM+rhEG组和rhEGF组新生组织EGF含量则显著低于对照组.⑦第8、18d,HAM、HAM+rhEG组和rhEGF组新生组织bFGF含量高于正常皮肤,但3组间比较无明显差异(P＞0.05).结论：HAM及其联合rhEGF治疗皮肤Ⅲ度烧伤,明显提高烧伤创面愈合率,缩短痊愈时间,改善创面组织病理学变化,作用机制涉及减轻创面炎症反应,促进新生血管形成,提高创面和新生组织SDF-1、TGF-β和EGF水平,羊膜治疗Ⅲ度烧伤的疗效及其提高创面修复质量优于传统的凡纱覆盖包扎与rhEGF凝胶治疗.

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干细胞活性因子鞘内注射治疗新生儿中-重度/重度缺氧缺血性脑病研究

干细胞活性因子鞘内注射治疗新生儿中-重度/重度缺氧缺血性脑病研...

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首届全国组织修复与再生医学大会暨国际组织修复与再生医学学术研讨会

作者：栾佐刘芳彭小明王琨刘卫鹏杨印祥王凤中国人民解放军海军总医院儿科北京100036 中国人民解放军白求恩国际和平医院河北石家庄050000 湖南省儿童医院新生儿四科长沙410007 中国人民解放军252医院河北保定071000

目的：探讨干细胞活性因子鞘内注射治疗新生儿中-重度/重度缺氧缺血性脑病(HIE)的可行性.对象及方法：参考2005年版《新生儿缺氧缺血性脑病诊断标准》、2006年中国亚低温多中心协作组亚低温临床试验、NICHD亚低温临床试验研究入组标准,2...

目的：探讨干细胞活性因子鞘内注射治疗新生儿中-重度/重度缺氧缺血性脑病(HIE)的可行性.对象及方法：参考2005年版《新生儿缺氧缺血性脑病诊断标准》、2006年中国亚低温多中心协作组亚低温临床试验、NICHD亚低温临床试验研究入组标准,2013年10月至2014年09月收治的新生儿缺氧缺血性脑病患儿17例,中-重度9例(53),重度8例(47％).所有患儿入组时完善脑电图、影像学检查(颅脑超声或头颅MRI).在常规治疗基础上,以体外培养的干细胞,适度传代后进行干细胞活性因子提取、富集,并行活性因子含量测定.以3×107个干细胞提取的活性因子为1个单位,在生后12小时、24小时、48小时内3次鞘内注射干细胞活性因子,每次1个单位.在生后7、28天、6个月、12个月、18个月复查脑电图、复查头颅MRI,进行新生儿神经行为测定(NBNA)、Bayley婴幼儿发展量表及Peabody运动发育量表进行评定,整体病人随访周期5个月-1岁.结果：(1) NBNA评分随访患儿中14天NBNA评分≥35分共6例,其中重度组患儿1例(25％),中-重度患儿5例(55.6％).28天NBNA评分≥35分的9例,重度患儿2例(50％),中-重度7例(77.8％).与对照组相比,治疗组患儿28天NBNA评分改善具有统计学意义.(2)随访情况17例患儿中存活16例(94.1％),死亡1例(5.9％),存活患儿中放弃治疗失访3例(18.7％).重度组死亡1例(12.5％),存活7例(87.5％),放弃治疗失访3例.智力、运动发育接近正常2例(50％),随访至6个月运动发育迟缓1例(25％),脑瘫1例(25％)(该例患儿6个月时复查头颅核磁提示原有软化灶面积缩小,脑容积明显增加).中-重度组患儿均存活(100％),运动及智力发育正常8例(88.9％);运动协调障碍1例(11.1％).(3)不良反应5例患儿出现注射后兴奋症状(29.4％),以上症状在8小时内缓解,未见其他不良反应.结论：中(重)度、重度HIE导致儿童死亡/严重神经发育障碍的比率高达55-73％,本研究初步结果提示千细胞活性因子鞘内注射治疗有望降低HIE死亡率及致残率、减轻中-重度及重度HIE患儿致残程度,同时,在一例重度缺氧缺血性脑病患儿脑软化后出现脑组织的再生,提示干细胞因子可能改善脑内环境,利于损伤后神经细胞再生.所有病例均未见严重并发症或不良反应,本组研究为进一步扩大样本和对照研究奠定了可行性和科学性的基础.

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