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利用烟草瞬时表达系统表达限制性DNA内切酶PacI

利用烟草瞬时表达系统表达限制性DNA内切酶PacI

引用

2018中国遗传学会第十次全国会员代表大会暨学术讨论会

作者：黄爽坚伟宁左朋张国珍范杰英韦正乙邢少辰吉林省农业科学院农业生物技术研究所吉林师范大学生命科学学院

限制性DNA内切酶是基因工程和分子生物学研究中不可或缺的工具酶。市场上的限制性DNA内切酶大多是在大肠杆菌表达、分离和纯化得到的,但是有一部分是无法在大肠杆菌中表达,因此是直接从发现这些酶的原始宿主菌中直接提取和纯化的,这些... 详细信息

限制性DNA内切酶是基因工程和分子生物学研究中不可或缺的工具酶。市场上的限制性DNA内切酶大多是在大肠杆菌表达、分离和纯化得到的,但是有一部分是无法在大肠杆菌中表达,因此是直接从发现这些酶的原始宿主菌中直接提取和纯化的,这些酶通常需要定制,因此供货周期长,价格昂贵。植物瞬时表达系统是高效表达外源蛋白的一种表达系统,可以形成多种修饰和二级(三级)结构,从而保证重组蛋白的生物活性。本研究首先以烟草花叶病毒(TMV)为瞬时表达载体,以绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因,分别从生长条件、侵染时机、侵染方法,农杆菌的浓度和侵染时间等四个方面在普通烟草(Nicotiana babacum)和本氏烟草(N. benthamiana)中优化了表达条件。在此基础上,我们把按照烟草密码子偏好性进行优化的来自念珠菌(Candidatus Uhrbacteria)的限制性DNA内切酶Pac I基因PacIR在上述优化的条件下进行了表达。SDS-PAGE和Western分析结果表明,目标蛋白的到了表达;初步的活性分析表明,获得的重组Pac I具有限制性DNA酶切酶活性。进一步的分离纯化和活性分析正在进行中。

关键词：瞬时表达 DNA内切酶烟草花叶病毒 PacI

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桑树钾离子通道及转运体相关基因的克隆及表达分析

桑树钾离子通道及转运体相关基因的克隆及表达分析

引用

2018中国遗传学会第十次全国会员代表大会暨学术讨论会

作者：李阳陈丹丹赵卫国杜秋霞郑丹燕郭鹏江苏科技大学

钾(K+)作为植物生长发育所需的大量元素之一,钾参与了植物体内很多重要的生理活动。为此,植物在整体水平和细胞水平上严格控制钾离子的转运以适应环境中钾离子变化而造成的胁迫。本研究主要是对桑树中钾离子通道及转运体相关基因克隆以... 详细信息

钾(K+)作为植物生长发育所需的大量元素之一,钾参与了植物体内很多重要的生理活动。为此,植物在整体水平和细胞水平上严格控制钾离子的转运以适应环境中钾离子变化而造成的胁迫。本研究主要是对桑树中钾离子通道及转运体相关基因克隆以及相关功能进行验证分析,从而提高桑树钾离子利用效率,以实现改善人类的生存环境、蚕桑业的可持续发展。本文从分子生物学角度研究以鲁桑育71-1苗为材料的桑树中的钾离子通道及转运体相关的基因。通过荧光定量PCR,生理生化相关指标测定以及转录组分析等一系列生物学分析,研究了在不同钾浓度胁迫下桑树的基因表达。主要的研究内容如下:1、研究了桑树内与钾离子转运有关基因:KAT2、AKT2、KCO5、HAK5。得到了四个基因的完整开放阅读框,预测编码蛋白质分子质量。通过定量PCR结果表明四个基因在干旱、高盐和低温三种非生物环境胁迫条件下,其表达水平均有时间差异性。2、利用POD、SOD、MDA、叶绿素、BCA和PRO等生理生化指标的检测,选择与正常生长差异较大的样品进行转录组测序分析。研究了桑树在低钾胁迫和正常生长条件下部分筛选的差异基因的表达。

关键词：桑树 MaKAT2基因 MaAKT2基因 MaKCO5基因 MaHAK5基因克隆胁迫表达原核表达生理生化指标转录组测序

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COPD易感基因GSTCD的表达调控机制研究

COPD易感基因GSTCD的表达调控机制研究

引用

2018中国遗传学会第十次全国会员代表大会暨学术讨论会

作者：李锦秀张晓华彭旻晟张璟钟丽于黎张亚平云南大学云南生物资源保护与利用国家重点实验室中国科学院昆明动物研究所遗传资源与进化国家重点实验室昆明医科大学第一附属医院胸外科陕西师范大学生命科学学院

慢性阻塞性肺病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)是一种以肺功能下降为特征的常见呼吸系统疾病。遗传因素在COPD发生发展中起重要作用。近年来,多国学者先后开展了大规模的全基因组范围内的关联研究(Genome-Wide Associat... 详细信息

慢性阻塞性肺病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)是一种以肺功能下降为特征的常见呼吸系统疾病。遗传因素在COPD发生发展中起重要作用。近年来,多国学者先后开展了大规模的全基因组范围内的关联研究(Genome-Wide Association Studies, GWAS)以揭示COPD的遗传基础。研究发现位于4q24区段的GSTCD(Glutathine S-transferase, C-terminal domain)基因内含子区SNP位点rs10516526与FEV1及COPD密切相关。然而,GSTCD基因的潜在致病位点及其在COPD发生中的作用机理尚不清楚。为此,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测,我们发现GSTCD的表达水平与COPD相关。利用染色质构象捕获技术(Chromosome conformation capture, 3C)结合ENCODE数据库有关信息,我们定位到GSTCD基因下游的一个区段可能作为增强子参与调控GSTCD基因的表达,并通过双荧光报告系统分析进行了验证。进一步的染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)及电泳迁移率分析(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)分析发现,rs10516526所在的连锁不平衡区域(Linkage disequilibrium block)可结合CREB1和C-Jun两种转录因子。综上所述,我们的结果表明位于4q24上的rs10516526连锁不平衡区域可通过结合CREB1和C-Jun转录因子,远距离调控GSTCD基因表达,进而增强COPD的易感性。

关键词：慢性阻塞性肺病 GSTCD 单核苷酸多态性 3C 远距离调控

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DNA给体细胞对细菌自然遗传转化过程的促进作用

DNA给体细胞对细菌自然遗传转化过程的促进作用

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2018中国遗传学会第十次全国会员代表大会暨学术讨论会

作者：张晓明晋婷婷邓丽萍汪超张煜华陈向东武汉大学生命科学学院微生物遗传学研究室

自然遗传转化被认为是"名副其实"的细菌水平基因转移途径,因为它的进行须涉及到细菌自身染色体上数十个基因的功能,而接合和转导则分别只与质粒和噬菌体相关。由于DNA易于人工提取,因此在传统上对转化的研究历来都是以受体为... 详细信息

自然遗传转化被认为是"名副其实"的细菌水平基因转移途径,因为它的进行须涉及到细菌自身染色体上数十个基因的功能,而接合和转导则分别只与质粒和噬菌体相关。由于DNA易于人工提取,因此在传统上对转化的研究历来都是以受体为主体,很少考虑DNA的来源及给体细胞的作用。但在自然界中,随机游离的DNA是有限的和不稳定的,受体细胞花费巨大的基因资源建立的复杂体系如果只是为了吸收细胞周围随机存在的游离DNA是难以令人想象的。我们的研究发现,在不添加外源游离DNA的情况下,将具有不同遗传标记的两种枯草芽孢杆菌混合在一起并且放置于固体基本培养基上培养10 h后就可以发生细胞间基因重组过程,且染色体和质粒DNA在两个细胞间都进行双向转移,但前者的效率明显比后者高。虽然这种发生在细胞间的遗传重组过程对DNase的处理基本不敏感,且依赖于给体和受体细胞间的接触,但却属于自然遗传转化,因为将受体菌基因组上控制细胞感受态建立的关键基因comK敲除后就可以彻底阻止这个基因重组过程的发生。进一步的实验证实,该过程的发生需要营养胁迫、抗生素压力等环境条件,以及供体和受体细胞间的协同作用,且在相同条件下这种以细胞形式提供DNA来源的转化频率远远高于等量的游离DNA。此外,我们还证实这种DNA供体细胞功能在芽孢菌中具有一定的普遍性。这说明DNA给体细胞在自然界中进行的自然转化过程中确实可能发挥着此前未被人们注意的重要作用,这为进一步揭示细菌的遗传转化机理和生物学意义提供了新的研究切入点。

关键词：枯草芽孢杆菌水平基因转移细胞间接触 DNase敏感 DNA给体细胞

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基于RNA降解机制研究寡孢节丛孢中与捕食器官形成相关的lncRNA

基于RNA降解机制研究寡孢节丛孢中与捕食器官形成相关的lncRNA

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2018中国遗传学会第十次全国会员代表大会暨学术讨论会

作者：吴汝念云南大学

近年来,研究长非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）在表观遗传水平、转录水平以及转录后水平等多种层面调控生命活动的过程成为生命科学领域的热点。然而,在真菌中lncRNA的研究尚处起步阶段,且主要集中在酵母、粗糙脉孢霉等模式真菌... 详细信息

近年来,研究长非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）在表观遗传水平、转录水平以及转录后水平等多种层面调控生命活动的过程成为生命科学领域的热点。然而,在真菌中lncRNA的研究尚处起步阶段,且主要集中在酵母、粗糙脉孢霉等模式真菌中,对lncRNA在病原真菌中的调控机制知之甚少。细胞中lncRNA的表达量通常较低,极大的限制了人们对lnc RNA的产生及功能机制的研究,主要是由于细胞内存在一种RNA降解机制（RNA decay）来维持RNA生成与降解之间的平衡状态,并对转录过程中RNA的质量以及稳定性进行监管。而利用分子生物学手段使控制RNA降解的关键蛋白功能失活将放慢lncRNA的降解速度,提高lncRNA在细胞中的转录水平,有助于我们更好的对lncRNA开展分子生物学研究。基于该思路,本研究以通过产生三维菌网对线虫进行捕食的病原真菌寡孢节丛孢（Arthrobotrys oligospora）为研究对象,使用同源重组的方法对该菌RNA降解途径中的5个关键蛋白的编码基因【Xrn1（AOL00007g507）、Trf4（AOL00097g578和AOL00078g371）、Dcp2（AOL00004g432）和Dis3（AOL00076g625）】进行敲除,之后再利用RNA-seq技术对典型敲除株进行lncRNA测序和分析,发现了许多可能参与捕食器官形成的潜在lncRNA,为对其开展功能研究奠定基础。此外,本研究在寡孢节丛孢2个功能基因【xlnR（AOL00006g84）和palH（AOL00006g291）】的ORF区域上下游2000 bp内分别找到1条经生物信息学预测的lncRNA TCONS0026732和TCONS0024985,使用同源重组的方法对这2个基因及2条lncRNA进行敲除,通过表型实验和RT-qPCR初步探索了这些lncRNA与基因的关系。

关键词：寡孢节丛孢 RNA降解基因敲除 RNA-seq lncRNA

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LDHC基因定点突变转基因小鼠的制备、饲养、繁殖及鉴定

LDHC基因定点突变转基因小鼠的制备、饲养、繁殖及鉴定

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2018中国遗传学会第十次全国会员代表大会暨学术讨论会

作者：张慧白晔张朵钱扬文兰风华福州总医院临床遗传与实验医学科

目的:本课题组前期在不明原因男性不育症患者中,首次检测到乳酸脱氢酶C (LDHC)基因一杂合无义突变:L153X。为明确其致病机理,我们制备了小鼠LDHC基因第153位密码子(F153X)的转基因模式小鼠。方法:利用CRISPR-Cas9系统定点突变技术制备小... 详细信息

目的:本课题组前期在不明原因男性不育症患者中,首次检测到乳酸脱氢酶C (LDHC)基因一杂合无义突变:L153X。为明确其致病机理,我们制备了小鼠LDHC基因第153位密码子(F153X)的转基因模式小鼠。方法:利用CRISPR-Cas9系统定点突变技术制备小鼠LDHC基因第153位密码子突变的C57BL/6J模式小鼠,将杂合子首建鼠与野生型C57BL/6J小鼠进行交配,对F1代小鼠通过PCR进行基因型鉴定,对F1代杂合子小鼠进行同窝交配,获得稳定遗传的杂合子、纯合子子代,随后扩群繁殖,将杂合子、纯合子、野生型雄鼠分别与野生型C57BL/6J成年雌鼠交配,观察雌鼠怀孕率、自然产仔数及子代鼠生长发育是否存在差异。结果:通过CRISPR-Cas9系统定点突变技术最终获得3只LDHC基因F153X定点突变的首建鼠。扩群后,共得到16只杂合雄鼠,7只纯合雄鼠。杂合子和野生型雄鼠对应雌鼠的受孕率差异并无统计学意义(P>0.05);杂合子和野生型对应雌鼠每窝自然产仔数分别为(7.00±1.63)只、(7.20±2.74)只,组间比较差异无统计学意义(P>0.05);纯合子对应雌鼠的受孕率仅为14.28%,自然产仔数平均为(3.33±1.53)只,与杂合子和野生型雄鼠的受孕率及自然产仔数相比均有显著差异;各组子代鼠生长发育差异无统计学意义(P>0.05)。结论:得到了稳定遗传的LDHC基因F153X突变小鼠,为深入研究L153X杂合无义突变导致男性不育的机理奠定了基础。

关键词： LDHC基因 CRISPR-Cas9 基因编辑模式小鼠生育力

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黔北麻羊MEF2D基因多态性及生物信息学分析

黔北麻羊MEF2D基因多态性及生物信息学分析

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2018中国遗传学会第十次全国会员代表大会暨学术讨论会

作者：罗铮翁吉梅封竣琪徐伟黄兰罗卫星蔡惠芬贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室贵州大学动物科学学院贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室

本研究旨在对黔北麻羊肌细胞增强因子2D（myocyte enhancer factor 2D,MEF2D）基因的多态位点进行筛选及生物信息学分析,以期丰富黔北麻羊MEF2D基因研究的基础数据。根据GeneBank中山羊MEF2D序列（登录号:NC30810）,应用Primer Premier ... 详细信息

本研究旨在对黔北麻羊肌细胞增强因子2D（myocyte enhancer factor 2D,MEF2D）基因的多态位点进行筛选及生物信息学分析,以期丰富黔北麻羊MEF2D基因研究的基础数据。根据GeneBank中山羊MEF2D序列（登录号:NC30810）,应用Primer Premier 5.0软件设计引物,运用混合DNA池结合PCR产物直接测序获得黔北麻羊MEF2D基因第2、3、4、5、6外显子序列进行多态性分析,利用生物信息学分析软件对黔北麻羊MEF2D基因进行系统进化树、理化性质、疏水性、跨膜结构、信号肽和二级结构分析。结果显示,共筛选出3个SNPs,分别为Exon3-G17617A、Exon5-C20180A和Exon5-C20259T。进化树分析显示,黔北麻羊和黄牛的亲缘性最近,与野猪和人的亲缘关系较近,与褐家鼠和小家鼠的亲缘关系较远。蛋白理化性质分析显示,黔北麻羊MEF2D蛋白理论等电点为7.74,亲水值最小为-2.867,疏水值最大为1.933,不是跨膜蛋白,没有信号肽存在。二级结构显示,Exon5-C20180A突变黔北麻羊MEF2D蛋白质二级结构中α螺旋和扩展链的增加,β-转角和无规则卷曲减少。本研究成功筛选黔北麻羊MEF2D基因多态位点,对研究黔北麻羊育种的分子遗传标记辅助选择奠定了理论基础。

关键词：黔北麻羊 MEF2D基因生物信息学

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牦牛MEF2A基因克隆与差异性表达分析

牦牛MEF2A基因克隆与差异性表达分析

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2018中国遗传学会第十次全国会员代表大会暨学术讨论会

作者：邓磊柴志欣王会王吉坤信金伟姬秋梅钟金城西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室西藏自治区农牧科学院省部共建青稞和牦牛种质资源与遗传改良国家重点实验室

MEF2A是一种由MEF2A基因编码的蛋白质,在心脏和平滑肌细胞的形态发生和肌细胞的生成过程发挥关键作用。本研究运用RT-PCR技术并结合生物信息学分析方法,对西藏类乌齐牦牛MEF2A基因CDS区序列进行克隆及差异表达分析。结果表明:牦牛MEF2A... 详细信息

MEF2A是一种由MEF2A基因编码的蛋白质,在心脏和平滑肌细胞的形态发生和肌细胞的生成过程发挥关键作用。本研究运用RT-PCR技术并结合生物信息学分析方法,对西藏类乌齐牦牛MEF2A基因CDS区序列进行克隆及差异表达分析。结果表明:牦牛MEF2A基因CDS区全长1 469bp,共编码489个氨基酸。分子式为C2263H3601N647O742S20,蛋白质分子量52385.58,总原子数为7 273,理论等电点(pI)为6.27,消光系数为27515,不稳定指数60.68。脂溶系数和亲水性平均值分别是64.60、-0.604,该蛋白属于亲水性不稳定蛋白。蛋白质二级结构和三级结构预测结果显示,MEF2A蛋白主要由无规卷曲、α螺旋和延长链在空间上折叠形成。牦牛MEF2A基因CDS区编码的氨基酸序列与普通牛、家猫、家犬、绵羊、小鼠、金钱豹、宽吻海豚、抹香鲸、美洲野牛、白犀、马、东北虎、猴的同源性分别为99.6%、96.1%、96.4%、99.6%、89.3%、96.8%、96.6%、96.8%、93.6%、97.2%、96.1%、96.3%、96.7%,该基因在不同物种高度保守。利用实时荧光定量PCR检测可知,MEF2A mRNA在牦牛臀肌、心脏、肝脏、肺脏中均有表达,且在臀肌中的表达优势较为显著(P<0.05)。通过克隆及生物信息学与差异表达分析为进一步探讨MEF2A基因对牦牛肌肉代谢调控的分子机制研究提供理论依据。

关键词：类乌齐牦牛 MEF2A基因克隆组织表达 Real-time PCR

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须糖多孢菌功能基因组研究

须糖多孢菌功能基因组研究

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2018中国遗传学会第十次全国会员代表大会暨学术讨论会

作者：穰杰何昊城唐建立刘朱东苑爽芹彭胜男孙运军夏立秋湖南师范大学生命科学学院湖南省微生物分子生物学重点实验室淡水鱼类发育生物学国家重点实验室

丁烯基多杀菌素是由放线菌须糖多孢菌生物合成的次级代谢产物,对防治农业害虫具有极好的发展前景。但野生型须糖多孢菌产量极低且遗传背景未知,需进行该菌遗传背景和丁烯基多杀菌素生物合成功能基因组的研究。对重要功能基因敲除或过表... 详细信息

丁烯基多杀菌素是由放线菌须糖多孢菌生物合成的次级代谢产物,对防治农业害虫具有极好的发展前景。但野生型须糖多孢菌产量极低且遗传背景未知,需进行该菌遗传背景和丁烯基多杀菌素生物合成功能基因组的研究。对重要功能基因敲除或过表达,基因簇阻断,探讨其对丁烯基多杀菌素生物合成的影响具有重要意义。本文在对须糖多孢菌进行第三代全基因组测序、定量蛋白质组研究基础上,获得了该菌株全基因组遗传信息和完成丁烯基多杀菌素生物合成调控网络构建,共筛选出26个差异表达基因以及5个聚酮基因簇,并选择4个生物合成基因,3个调控基因和2个聚酮基因簇进行遗传修饰。发现上述功能基因或基因簇修饰后能极大影响丁烯基多杀菌素生物合成,进一步分析发现,这些功能基因或基因簇可通过影响碳源吸收利用进而改变细胞生长趋势和丁烯基多杀菌素生物合成。结果表明,结合丁烯基多杀菌生物合成调控网络与差异蛋白质组分析所筛选出的功能基因和基因簇可以作为对须糖多孢菌进行代谢工程改造的重要靶标以促进丁烯基多杀菌素生物合成。

关键词：须糖多孢菌丁烯基多杀菌素生物合成基因调控网络第三代全基因组测序定量蛋白质组分析

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人外周血FMR1基因新型剪接异构体的检测及其初步功能研究

人外周血FMR1基因新型剪接异构体的检测及其初步功能研究

引用

2018中国遗传学会第十次全国会员代表大会暨学术讨论会

作者：邱萍严爱贞兰风华福州总医院临床遗传与实验医学科

目的:检测人外周血脆性X智力障碍1基因(FMR1基因)新型可变剪接异构体,对其功能进行初步研究。方法采用RT-PCR及T克隆-测序技术,检测正常人外周血白细胞各可变剪接产物类型及丰度,通过免疫印迹技术鉴定其中一类新型异构体(ISO51-ISO53)... 详细信息

目的:检测人外周血脆性X智力障碍1基因(FMR1基因)新型可变剪接异构体,对其功能进行初步研究。方法采用RT-PCR及T克隆-测序技术,检测正常人外周血白细胞各可变剪接产物类型及丰度,通过免疫印迹技术鉴定其中一类新型异构体(ISO51-ISO53)编码蛋白质的表达水平。通过服务器构建了人FMRP全长蛋白及新型剪接产物ISO51-ISO53编码蛋白质的结构模型,并运用分子克隆技术构建了含编码区全长序列的全长型真核表达载体和含新型可变剪接产物ISO51的真核表达载体,分别对其部分功能进行了研究。结果:从505个PCR产物-T载体重组质粒中共鉴定出50种FMR1基因可变剪接产物,其中包括27种未报道过的新型可变剪接产物。FMR1基因可变剪接产物中表达丰度最高的为ISO 17和ISO7,其次为ISO1和ISO13,其余各类剪接产物出现频率皆不高于5.0%。检测出的新型可变剪接异构体分别涉及外显子3、4、11的跳跃,来自内含子7中30bp、87bp片段及内含子9中46bp、140bp片段的插入。免疫印迹结果显示含来自内含子9的大小为140bp插入片段的新型转录本编码的蛋白在6例成人外周血中均有可检测的表达。构建的含新型可变剪接产物ISO51编码的蛋白结构模型显示其所编码的FMRP截短蛋白在细胞内定位发生了改变。结论:该研究丰富了对FMR1基因可变剪接复杂性和多样性的认识,而且为探讨可变剪接对FMRP功能影响、探索FXS发病机制奠定基础。

关键词：脆性X智力障碍1基因可变剪接脆性X综合征生物信息学真核表达

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