目的：在糖尿病患者中,骨组织内的晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)及其受体(receptor for AGEs,RAGE)的异常增加与糖尿病患者骨质疏松的发生、发展密切相关,因此本文主要探讨AGEs和RAGE对成骨细胞自噬流水平...
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目的：在糖尿病患者中,骨组织内的晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)及其受体(receptor for AGEs,RAGE)的异常增加与糖尿病患者骨质疏松的发生、发展密切相关,因此本文主要探讨AGEs和RAGE对成骨细胞自噬流水平和凋亡的影响及其潜在的作用机制。 方法：应用不同浓度的AGEs作用于成骨细胞不同时间点后,CCK-8法检测细胞活力;筛选合适浓度及时间点后,使用RAGE-shRNA慢病毒感染成骨细胞构建稳转细胞系;annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡;CellROX？ Deep Red染色,JC-1染色和MitoSOX染色分别检测细胞内总活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,线粒体膜电位和线粒体超氧化物水平变化;Western blotting检测RAGE、凋亡相关蛋白、自噬相关蛋白和ERK信号通路蛋白表达变化;透射电镜检测细胞自噬囊泡;GFP-RFP-LC3慢病毒感染成骨细胞观察细胞自噬流变化;免疫荧光检测细胞RAGE及LC3蛋白表达情况;使用MitoTracker染色标记细胞内线粒体,使用免疫荧光染色LC3,并在激光共聚焦显微镜下观察线粒体与LC3共定位情况。
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