由致病链霉菌（Streptomyces spp.）引起的马铃薯疮痂病（Potato Common Scab,PCS）是危害马铃薯的第四大病害,不仅影响马铃薯的商品价值和市场竞争力,严重时还会延迟出苗,甚至引起幼苗死亡,严重制约马铃薯产业的发展。果胶酸裂解酶（P...
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由致病链霉菌（Streptomyces spp.）引起的马铃薯疮痂病（Potato Common Scab,PCS）是危害马铃薯的第四大病害,不仅影响马铃薯的商品价值和市场竞争力,严重时还会延迟出苗,甚至引起幼苗死亡,严重制约马铃薯产业的发展。果胶酸裂解酶（PL）作为一类重要的多糖裂解酶,能够降解植物细胞壁的主要成分果胶,进而在病原菌侵染寄主植物时发挥重要作用。在加利利链霉菌（Streptomyces galilaeus）5T-1与马铃薯互作过程中,果胶酸裂解酶基因CP966＿RS08110上调表达,为证实该基因是否参与致病过程,本研究以加利利链霉菌5T-1为研究对象,利用生物信息学预测了果胶酸裂解酶PL-08110的理化性质及空间结构,并通过基因编辑技术对其致病功能进行验证。研究取得以下主要结果:
（1）从加利利链霉菌5T-1的基因组DNA中克隆出CP966＿RS08110基因,其编码44.38 k Da蛋白质,由19.28%α-螺旋、25.30%延伸链、6.75%β-折叠和48.67%无规则卷曲组成,属于亲水性蛋白质,无跨膜结构和信号肽序列,含有35个磷酸化位点,11个糖基化位点,具有完整的PL-6 superfamily和Pec＿lyase＿C结构域,呈现右手β-螺旋结构,属于PL1家族。
（2）通过密码子优化策略,替换稀有密码子为大肠杆菌高使用频率密码子,优化后的密码子适应指数（CAI）由原来的0.36升高为1.0,GC含量由70.59%降为56.33%。构建原核表达菌株进行体外诱导表达,并筛选其最佳诱导条件为:16℃时,0.1 m M IPTG诱导8 h;该蛋白一部分以可溶性蛋白质表达,另一部分以包涵体形式表达。利用Ni-NTA亲和层析柱纯化可溶性蛋白质,纯化后的PL-08110蛋白质活性达11.33 U/m L,接种健康马铃薯后可以引起马铃薯组织坏死,表现出较高的致病性,说明PL-08110蛋白质是引起马铃薯疮痂病的致病因子之一,参与疮痂病的侵染和致病过程。
（3）构建CP966＿RS08110基因敲除载体S-D-p TRIA,建立并优化了加利利链霉菌5T-1属间接合转移体系,最佳条件为:供受比控制在10:1,受体孢子50℃热激10 min后,震荡培养预萌发3 h,涂布于含有20 m M的Mg2+的MS接合转移培养基,14 h后覆盖抗生素;并以野生型加利利链霉菌5T-1为材料进行遗传转化,通过PCR扩增验证,筛选得到敲除突变株△PL5T-1。突变株△PL5T-1在MS平板上的菌落形态和色素产量与野生株没有明显差异,但其生长速率减慢;在果胶酶活性检测培养基上,突变株△PL5T-1利用果胶形成的透明圈显著小于野生株,且该基因缺失影响加利利链霉菌5T-1的侵染速度,但后期病害症状没有明显差异,说明CP966＿RS08110基因参与加利利链霉菌5T-1的前期侵染,后期可能不参与或有同工基因。
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