犬巴贝斯虫病和犬埃立克体病作为犬的两种血液原虫病,它们之间存在着交叉感染,可以引起人畜共患病,对人类的健康也是一大威胁。本实验旨在建立犬巴贝斯虫病和犬埃立克体病双重纳米PCR方法,为这两种血液原虫病的临床诊断和大规模筛查奠定技术基础。1.犬巴贝斯虫病和犬埃立克体病双重PCR方法的建立。分别收集犬的阳性或疑似阳性犬巴贝斯虫和犬埃立克体抗凝血样本,提取DNA,分别设计犬巴贝斯虫18s r RNA和犬埃立克体16s r RNA引物,PCR扩增相应的DNA片段,分别进行胶回收,TA克隆至p MD-18T载体,构建重组质粒p MD-BC和p MD-EC,质粒PCR鉴定并测序验证。以阳性质粒p MD-BC和p MD-EC为模板,进行双重PCR扩增并选择最适退火温度。在此基础上,系列稀释质粒模板,再次进行双重PCR,检测其灵敏度。结果表明,(1)犬巴贝斯虫和犬埃立克体重组质粒p MD-BC和p MD-EC测序结果与Gen Bank公布的相应18s r RNA和16s r RNA核苷酸序列同源性均100%;(2)双重PCR最佳退火温度为62℃;(3)该体系对巴贝斯虫和埃立克体病原最低核酸检出量分别为2.07×10～5和1.92×10～5 copies/μL。2.犬巴贝斯虫病和犬埃立克体病双重纳米PCR方法的建立。在前一个实验的基础上,应用纳米PCR试剂盒,对退火温度和引物用量进行了优化,在确定最佳退火温度后,以上述实验同样的方法测定了双重纳米PCR方法的灵敏度;应用犬立克次体、弓形虫、细小病毒和犬瘟热病毒阳性DNA样品为模板,验证了该体系的特异性。此外,收集南宁地区152份犬血样,应用该双重纳米PCR方法对犬巴贝斯虫和犬埃立克体病流行病学进行了调查。结果表明,(1)成功建立了犬巴贝斯虫病和犬埃立克体病双重纳米PCR方法;最佳退火温度为57℃;(2)该双重纳米PCR体系特异性良好,对犬巴贝斯虫和犬埃立克体最低核酸检测量分别为2.07×10～3copies/μL和1.92×10～3copies/μL,敏感度比先前双重PCR体系高100倍。(3)应用该体系对152份临床样本进行流行病学筛查,结果证明该方法切实可行。总而言之,本实验建立了犬巴贝斯虫和犬埃立克体的双重纳米PCR方法,该方法特异性强,灵敏度高,可用于犬巴贝斯虫病和犬埃立克体病的临床诊断和大规模流行病学筛查。
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