绝经后骨质疏松症是困扰绝经后妇女的常见问题,主要由绝经后雌激素分泌减少所致[1]。绝经后骨质疏松症是颌骨骨质丢失的常见危险因素,可加速牙槽骨的吸收,进而导致牙龈退缩,牙根暴露,牙齿松动脱落等,这给正畸治疗中牙齿的移动及牙齿缺失后的义齿或种植修复等带来了很多困难[2]。雌激素替代治疗一直是绝经后骨质疏松症的主要治疗方法,但骨组织并非雌激素的唯一靶器官,长期服用雌激素可增加子宫内膜癌、乳腺癌、卵巢癌、血栓栓塞、胆囊炎等的发生率[3,4]。如何更有效地促进绝经后骨质疏松症患者的骨再生及牙周缺损的修复,越来越受到医疗工作者的关注与重视。骨髓间充质干细胞(BMMSCs)是一类具有自我更新及多向分化潜能的成体干细胞,利用BMMSCs移植治疗骨质疏松引起的牙周缺损一直是目前的研究热点。但有研究表明,在雌激素缺乏的微环境中,BMMSCs的增殖、凋亡及成骨分化能力均受到一定的影响[5,6]。因此,从分子或基因水平寻找有效且可靠的方法来恢复BMMSCs的成骨分化能力可能是治疗的关键。骨膜蛋白(Periostin)是由成骨细胞及其前体细胞所分泌的一种粘附蛋白,其可促进成骨细胞的粘附、迁移、增殖及分化等,在调控骨发育及代谢中发挥了重要的作用[7-9]。然而对于雌激素是否通过影响Periostin在BMMSCs中的表达,进而调节BMMSCs的生理功能,目前仍未见相关研究报道。本研究分别从去势(OVX)和假手术(SHAM)组SD大鼠骨髓中分离培养BMMSCs,比较两组BMMSCs成骨分化能力及Periostin m RNA的表达水平,并在此基础上探索17β-雌二醇(17β-E2)对去势大鼠BMMSCs中Periostin m RNA表达水平的影响,从而为利用Periostin改善绝经后骨质疏松患者BMMSCs的成骨分化能力提供一定的参考依据。研究内容:1、去势大鼠骨质疏松动物模型的构建与鉴定通过对雌性SD大鼠行双侧卵巢切除术来构建绝经后骨质疏松动物模型,对照组则仅去除卵巢周围等量的脂肪组织而保留双侧卵巢。术后12周,分别取两组大鼠股骨进行HE染色及Micro-CT扫描以鉴定绝经后骨质疏松动物模型构建成功与否。2、rBMMSCs的分离培养与鉴定利用全骨髓贴壁培养法从SD大鼠股骨与胫骨中分离培养r BMMSCs,倒置显微镜观察细胞形态变化,并用流式细胞仪对r BMMSCs细胞表面的特异性标记物进行检测。3、检测两组r BMMSCs的增殖与成骨分化能力及Periostin mRNA的表达情况采用CCK-8法检测两组r BMMSCs的增殖能力,然后对r BMMSCs进行成骨诱导染色,并提取细胞RNA进行Real-time PCR检测成骨相关因子OCN、BSP及Runx2m RNA的表达水平,进而比较两组r BMMSCs的成骨分化能力,同时还检测两组r BMMSCs中Periostin m RNA表达水平的差异。4、检测17β-E2对去势大鼠BMMSCs成骨分化能力及Periostin mRNA表达水平的影响(1)体外实验:利用CCK-8法检测不同浓度17β-E2对OVX组r BMMSCs增殖能力的影响以确定其最适刺激浓度,再用该浓度的17β-E2刺激OVX组r BMMSCs,利用成骨诱导染色及Real-time PCR分别检测r BMMSCs成骨分化能力及Periostin m RNA表达水平的变化。(2)体内实验:SD大鼠去势手术后3周开始皮下注射17β-E2溶液(10ug/kg),每2日注射1次,连续注射9周。采用HE染色及Micro-CT扫描观察大鼠股骨微结构的改变,并分离培养r BMMSCs,利用成骨诱导染色及Real-time PCR分别检测r BMMSCs的成骨分化能力及Periostin m RNA的表达水平。研究结果:1、HE染色及Micro-CT扫描结果均显示OVX组大鼠股骨骨小梁数量明显减少,骨松质蜂窝结构被严重破坏,骨小梁穿孔甚至断裂。骨形态学指标分析结果显示OVX组大鼠股骨的BV/TV、***及Tb.N值均显著降低,***值则明显增加,组间差异均具有统计学意义(P<0.05)。2、体外分离培养的r BMMSCs镜下观察多为梭形或多角形,呈放射状或旋涡样密集排列,流式细胞术检测结果显示间充质干细胞表面标志物CD29、CD90在所培养的细胞中的表达率分别为96.6%、94.2%,而造血干细胞标志物CD34、CD45的表达率分别则为1.3%、2.0%。3、CCK-8法检测结果显示OVX组r BMMSCs的增殖速率明显低于SHAM组,成骨诱导染色结果显示OVX组ALP染色及钙沉积均明显减弱,Periostin m RNA表达显著降低,同时OCN、BSP及Runx2 m RNA的表达水平也显著降低(P<0.05)。4、(1)体外实验:CCK
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