本论文主要研究了运用生物催化的方法制备醛类香料化合物。论文的第二章主要建立了一种测定有机酸含量的羟肟酸铁比色法,并将其应用到论文第三章中,初步快速检测了产物脂肪酸的产生,为得到高产率的脂肪醛类化合物奠定了基础。有机酸可与DCC和盐酸羟胺溶液反应生成羟肟酸,而羟肟酸遇三氯化铁生成紫红色的羟肟酸铁。基于这种羟肟酸铁比色法反应机制,可建立测定有机酸含量的策略。首先,为了得到测定有机酸含量反应体系的最佳条件,对盐酸羟胺和DCC的浓度、三氯化铁的浓度、显色反应的时间、水浴的温度和时间以及实验的抗干扰因素进行了研究。优化的最佳反应条件如下:4 m M盐酸羟胺和0.2 M DCC、0.5 M三氯化铁、反应时间10 min、水浴温度60℃及水浴时间20 min。其次,利用静息细胞催化反应,以1-氰基-环己基-乙腈为底物,羟肟酸铁比色法测定的RSD和回收率分别是0.6892%1.8250%和99%105%,动力学常数Km和Vmax分别是9.7968 m M和0.5772 m M/min,并且这些结果与HPLC法测定实验结果一致,结果表明,此法操作简单,快速,精确。论文的第三章主要针对酵母菌长链脂肪醇氧化酶FAO1基因在大肠杆菌中的表达及其催化性能进行了研究。将FAO1基因导入到p ET-21a质粒中,构建好的质粒转入宿主菌Rosetta菌株中,获得重组菌株。质粒提取并酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定纯化结果,切胶送公司测序,测序结果与已报道的FAO1基因序列一致。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,使用乳糖诱导时,醇氧化酶FAO1基因高表达。超声破碎细胞获得蛋白质,测定醇氧化酶活性,并对破碎条件及测活体系进行探索,最佳条件:破碎细胞量20 g/L,超声时间10 min,蛋白含量0.2 mg,HRP含量300μg。对其发酵和转化条件进行了优化,最佳条件为:乳糖3 g/L,诱导时间2 h,接种量5%,p H 7.0,温度30℃,4%DMSO,反应时间8 h,细胞量30 g/L,环己烷:水相比例为1:4,还原剂类型维生素C等。在最优条件下,首先实现了高产率的脂肪酸的积累,进一步通过通透实验,得到99%高产率的正辛醛,并通过研究底物谱,实现了高产率己醛、葵醛和十二醛的积累。论文的第四章主要研究了生物催化阿魏酸生成香草醛菌株的筛选和鉴定,并采用摇瓶发酵优化的方式,对其种子及转化反应条件进行优化。微生物法生产香草醛研究的前期工作主要集中在选育高产菌种上,选用富集培养法和驯化培养法筛选目标菌株,得到性状较好且较稳定的两株高产菌株E4-1和E6-1。根据菌株的形态特征、生理生化特点和16S r DNA电泳的结果鉴定E4-1和E6-1菌株的类型,鉴定后菌株类型分别为高地芽孢杆菌和嗜血芽孢杆菌。从中选取一株性状较好菌株E4-1对生物法生产香兰素的生产工艺进行研究,优化了碳源的种类及浓度、氮源的种类及浓度、装液量、p H和温度等。结果表明,该菌株生产香草醛的最佳条件为:蔗糖15 g/L,酵母膏5 g/L,装液量50 m L,p H 7.5,温度30℃,香草醛的浓度从0.0698 g/L提高0.166 g/L。经过一系列的探索,运用生物催化的方法,首次得到两株细菌能够实现积累高产率的香草醛。
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