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雷公藤甲素抑制NLRP3炎症小体活化改善高糖诱导的足细胞上皮-间充质转分化

中国中药杂志 2019年第24期44卷 5457-5464页

作者：吴薇刘不悔万毅刚孙伟刘莹露王文文房其军涂玥 YEE Hong-yun 袁灿灿万子玥南京大学医学院附属鼓楼医院中医科江苏南京210008 南京中医药大学中西医结合鼓楼临床医学院中医科江苏南京210008 南京中医药大学附属医院肾内科江苏南京210029 南京中医药大学针灸推拿学院·养生康复学院中医养生学教研室江苏南京210023 Department of Social Work Meiji Gakuin UniversityTokyo108-8636

基于糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)肾组织Nod样受体蛋白3(Nod-like receptor protein 3 inflammasome,NLRP3)炎症小体活化的调控机制而探讨雷公藤有效成分——雷公藤甲素(triptolide,TP)在体外改善高糖(high glucose,HG)诱导足细胞上皮-间充质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的作用。将体外培养的小鼠永生化足细胞分为正常(the normal,N)组、HG组、低剂量TP(the low dose of TP,L-TP)组、高剂量TP(the high dose of TP,H-TP)组以及甘露醇(the mannitol,MNT)组。分别进行不同的干预,即N组加入5 mmol·L^-1D-葡萄糖(D-glucose,DG),HG组加入30 mmol·L^-1HG,L-TP组加入30 mmol·L^-1HG+5μg·L^-1TP,H-TP组加入30 mmol·L^-1HG+10μg·L^-1TP,MNT组加入5 mmol·L^-1DG+24.5mmol·L^-1MNT。在干预后的不同时间点(24,48,72 h),首先,观察HG或TP对足细胞增殖活性的影响;其次,检测足细胞上皮细胞标志性分子nephrin和ZO-1、间充质细胞标志性分子Ⅰ型胶原(collagenⅠ)和纤维连接蛋白(fibronectin,FN)的蛋白表达水平;最后,检测足细胞NLRP3炎症小体活化关键信号分子NLRP3,凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protien,ASC)以及下游效应蛋白caspase-1、白介素(interleutin,IL)-1β、IL-18的蛋白表达水平。结果表明,对于体外培养的足细胞,HG能引起nephrin,ZO-1蛋白表达水平下调,collagenⅠ,FN蛋白表达水平上调,诱导其发生EMT;还能引起NLRP3,ASC以及caspase-1,IL-1β,IL-18蛋白表达水平上调,诱导其NLRP3炎症小体活化。此外,L-TP或H-TP与HG联合干预足细胞能恢复nephrin,ZO-1蛋白表达水平,抑制collagenⅠ,FN蛋白表达水平,改善EMT;还能下调NLRP3,ASC蛋白表达水平,抑制NLRP3炎症小体活化,并减少其下游效应分子caspase-1,IL-1β,IL-18蛋白表达水平。总之,HG在体外能激活NLRP3炎症小体而诱导足细胞EMT;TP在适当的剂量范围内能抑制NLRP3炎症小体活性而改善足细胞EMT,这可能是TP保护DKD足细胞炎症性损伤的关键分子机制之一。

关键词：糖尿病肾病雷公藤甲素足细胞 NLRP3炎症小体活化上皮-间充质转分化

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Smad7而非Smad6基因可抑制TGF-β诱导肾小管上皮-间充质转分化

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细胞与分子免疫学杂志 2008年第11期24卷 1074-1078页

作者：黄云剑王梓华张静波梁莉陈枫赵景宏第三军医大学新桥医院肾内科重庆400037

目的:观察Smad6和Smad7基因能否抑制TGF-β诱导肾小管上皮-间充质转分化。方法:构建产生表达Smad6和Smad7基因的无辅毒腺相关病毒载体,再将病毒颗粒分别转染入人肾小管上皮细胞(HKC),细胞随机分为正常对照、TGF-β1组、Smad7组、LacZ组... 详细信息

目的:观察Smad6和Smad7基因能否抑制TGF-β诱导肾小管上皮-间充质转分化。方法:构建产生表达Smad6和Smad7基因的无辅毒腺相关病毒载体,再将病毒颗粒分别转染入人肾小管上皮细胞(HKC),细胞随机分为正常对照、TGF-β1组、Smad7组、LacZ组、TGF-β1+Smad7或Smad6组、TGF-β1+LacZ组。10μg/LTGF-β1添加入培养液孵育15、30、60、120min和3d。Western blot测定TGF-β1和Smad6或Smad7基因转染对细胞p-Smad2、E-cadherin、α-smooth muscle actin(α-SMA)表达的影响,ELISA法测定培养上清羟脯氨酸的含量的变化,倒置显微镜观察细胞形态变化。结果:与未加TGF-β1细胞相比,添加TGF-β1后15、30、60、120min胞内Smad2磷酸化水平明显增加,30min时表现最大。10μg/LTGF-β1与HKC孵育72h后,细胞α-SMA和羟脯氨酸量合成增加,E-cadherin表达减少;细胞形态变长,呈纺锤状细胞,失去鹅卵石样的形状。Smad7基因转染可抑制TGF-β1诱导Smad2磷酸化,抑制细胞α-SMA和羟脯氨酸合成,增加E-cadherin表达,维持培养细胞的上皮样形态,相反,Smad6没有这样的作用。结论:Smad7而不是Smad6基因转染能抑制TGF-β1诱导肾小管上皮-间充质转分化,这些作用可能与Smad7阻断Smad2磷酸化有关。

关键词： Smad7 Smad6 上皮-间充质转分化 TGF-β 基因治疗

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α-酮戊二酸钠对转化生长因子β_1诱导的HK-2细胞上皮-间充质转分化的影响

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中国药理学与毒理学杂志 2012年第2期26卷 168-172页

作者：彭明丽韩春光高志清王琼高月刘永学北京放射与辐射医学研究所药理毒理研究室北京100850

目的探讨α-酮戊二酸钠对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的HK-2细胞上皮-间充质转分化(EMT)的影响。方法 TGF-β10.5,2和5μg.L-1分别作用于葡萄糖5和30 mmol.L-1培养的HK-2细胞72 h,通过RT-PCR法检测EMT标志物E-钙黏着糖蛋白和波形蛋白m... 详细信息

目的探讨α-酮戊二酸钠对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的HK-2细胞上皮-间充质转分化(EMT)的影响。方法 TGF-β10.5,2和5μg.L-1分别作用于葡萄糖5和30 mmol.L-1培养的HK-2细胞72 h,通过RT-PCR法检测EMT标志物E-钙黏着糖蛋白和波形蛋白mRNA表达的变化,以选择EMT病变模型的最佳诱导条件。在此基础上,观察α-酮戊二酸钠10,100和500μmol.L-1对HK-2细胞EMT病变及G蛋白偶联受体80(GPR80)mRNA表达的影响。结果①在葡萄糖5和30 mmol.L-1条件下,当TGF-β1为5μg.L-1时,与对照组比较,E-钙黏着糖蛋白mRNA的降低和波形蛋白mRNA的升高最明显(P<0.01),表明HK-2细胞发生了典型的EMT病变;②选择TGF-β15μg.L-1和葡萄糖30 mmol.L-1制备EMT病变模型,同时加入α-酮戊二酸钠100和500μmol.L-1作用72 h,与模型组比较,E-钙黏着糖蛋白mRNA明显升高,波形蛋白mRNA明显降低,GPR80 mRNA表达增加(P<0.01),表明α-酮戊二酸钠可逆转HK-2细胞EMT的发生。结论在葡萄糖5和30 mmol.L-1培养条件下,TGF-β15μg.L-1作用72 h,HK-2细胞可出现典型的EMT病变;α-酮戊二酸钠对该病变具有抑制作用。

关键词： α-酮戊二酸盐转化生长因子β1 上皮-间充质转分化钙黏着糖蛋白波形蛋白 G蛋白偶联受体

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丹参酚酸B盐对TGF-β1诱导的HK-2上皮-间充质转分化的影响

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中国中药杂志 2010年第1期35卷 89-93页

作者：周娟王飞陆海英张悦上海中医药大学科技实验中心上海201203 上海中医药大学护理学院上海201203

目的:研究丹参酚酸B盐(salvianolic-acid B,SA-B)对转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)诱导的人肾小管上皮细胞HK2(human human renal proximal tubular cells)转分化的影响。方法:复苏并传代培养HK2细胞,应用不同剂量的TGF-β1或同一剂量作用不同时间诱导HK2细胞发生上皮-间充质转分化(epithelia-mesenchymal transition,EMT),同时给予骨形成蛋白7(BMP-7,阳性对照)(50μg.L-1)和SA-B(1×10-5mol.L-1)干预观察二者对EMT的影响。应用Western印迹法和免疫荧光法检测HK2细胞E-钙黏蛋白(E-cadherin),α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达。结果:BMP-7显著抑制了TGF-β1诱导的E-cadherin下调(P<0.05)和α-SMA上调(P<0.05);而SA-B显著抑制TGF-β1诱导的α-SMA表达增加(P<0.05),未见其抑制TGF-β1诱导的E-钙黏蛋白下调。结论:SA-B和BMP-7能够抑制TGF-β1诱导的HK2上皮-间充质转分化,其共同的作用是抑制了TGF-β1诱导的α-SMA上调,而SA-B对E-钙黏蛋白的调控作用有待进一步的研究。

关键词：上皮-间充质转分化丹参酚酸B盐转化生长因子β1 骨形成蛋白7 人肾小管上皮细胞

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Klotho对FGF2诱导的肾小管上皮细胞上皮-间充质转分化的抑制作用

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第三军医大学学报 2013年第13期35卷 1327-1330页

作者：管旭杨可肖堂利李艺何婷徐新丽赵景宏第三军医大学新桥医院肾内科重庆400037

目的探讨Klotho抑制成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor2,FGF2)诱导的肾小管上皮细胞(HK-2)上皮-间充质转分化(epithelia-mesenchymal transition,EMT)的作用及机制。方法重组人Klotho蛋白预孵育前后,倒置显微镜观察FGF2对HK-2细胞形态的影响,免疫荧光检测上皮细胞标志物cytokeratin和间充质细胞标志物vimentin的表达变化,Western blot检测α-SMA、E-cadherin和ERK1/2的表达变化。结果 100 ng/mL的FGF2作用于HK-2细胞48 h后,HK-2细胞变成长梭形,细胞间隙明显增大,上皮细胞标志物E-cadherin的表达明显下降,间充质细胞标志物α-SMA表达明显升高(P<0.05),提示FGF2可以诱导HK-2细胞发生EMT。而Klotho蛋白预孵育可以显著抑制FGF2诱导的EMT,并且FGF2/FGFR(FGFs受体)下游信号分子pERK1/2的表达明显减弱(P<0.05)。结论 Klotho可以通过减弱FGF2信号通路活化抑制FGF2诱导的HK-2细胞EMT,Klotho可能参与了肾间质纤维化的发生和发展。

关键词： Klotho FGF2 上皮-间充质转分化

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miRNA589在TGF-β1诱导人腹膜间皮细胞上皮—间充质转分化的作用及分子机制

miRNA589在TGF-β1诱导人腹膜间皮细胞上皮—间充质转分化的作用...

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作者：张柯中南大学

学位级别：博士

研究背景腹膜透析是终末期肾病重要的肾脏替代治疗方式之一,透析相关性腹膜纤维化导致的超滤衰竭已成为影响腹膜透析疗效,继而影响其预后的主要原因。腹膜间皮细胞上皮-间充质转分化(Epithelial Mesenchymal Transition, EMT)是启动和... 详细信息

研究背景腹膜透析是终末期肾病重要的肾脏替代治疗方式之一,透析相关性腹膜纤维化导致的超滤衰竭已成为影响腹膜透析疗效,继而影响其预后的主要原因。腹膜间皮细胞上皮-间充质转分化(Epithelial Mesenchymal Transition, EMT)是启动和维持腹膜纤维化的关键机制,TGF-β1在其中发挥关键作用。 microRNA (miRNA, miR)是近年来发现的一组非编码小RNA,通过特异性识别下游靶基因mRNA的3’非翻译区(UTR)抑制其翻译,或直接降解mRNA,在多种生理过程中发挥重要作用。新近关于乳腺癌、糖尿病肾病的研究表明,miRNA是参与调控EMT的重要因素之一,可能与其影响转录因子及参与调节TGF-β1下游信号通路等机制有关。但在腹膜纤维化领域尚无文献报道。我们前期的研究首次发现,长期腹膜透析患者(>12个月)腹透液脱落细胞中miRNA 194表达明显上调,且与E-cadherin表达水平呈负相关,与a-SMA表达呈正相关,提示miRNA 194与腹膜间皮细胞EMT有一定相关性。但发生EMT时腹膜间皮细胞的miRNA表达谱改变及miRNA参与EMT调控的机制尚不清楚。基于以上分析,我们认为经TGF-β1诱导发生EMT的腹膜间皮细胞可出现miRNA表达谱的特征性改变,调节特定miRNA的表达水平可以抑制TGF-β1诱导的腹膜间皮细胞EMT。第一章TGF-p1诱导人腹膜间皮细胞EMT及miRNA表达图谱分析目的分析经TGF-β1诱导发生EMT的腹膜间皮细胞miRNA表达图谱,筛查可能介导腹膜间皮细胞EMT的miRNA。方法常规培养腹膜间皮细胞,分对照组、TGF-β1刺激12h、24h、48h组。倒置显微镜观察各组细胞形态学变化;采用免疫荧光、Realtime PCR检测ZO-1、vimentin的表达,采用Realtime PCR、Westernblot检测E-cadherin mRNA和蛋白的表达。应用基因芯片法筛查对照组和TGF-p,刺激48h组腹膜间皮细胞miRNA表达图谱并进行差异分析。应用软件预测miRNA下游靶基因,筛查可能参与介导腹膜间皮细胞EMT的miRNA,并以Realtime PCR验证目的miRNA在对照组和TGF-β1刺激24h组腹膜间皮细胞的表达,分别计算2-ΔΔCT值。结果TGF-β1诱导腹膜间皮细胞形态出现成纤维细胞样改变,TGF-β1刺激后腹膜间皮细胞ZO-1、E-cadherin表达显著下调,vimentin表达明显七调,呈时间依赖性,与对照组比较有显著性差异,TGF-β1成功诱导腹膜间皮细胞发生EMT。基因芯片法筛查发现TGF-β1诱导48h后腹膜间皮细胞miRNA表达图谱出现特征性改变,hsa-miRPlus-E 1114、hsa-miRPlus-E1245表达上调,hsa-miR-589、hsa-miR-505*、hsa-miRPlus-F1147、hsa-miRPlus-E1033、hsa-miR-337-5p、hsa-miR-513a-5p、hsa-miRPlus-E1075、hsa-miR-891a、hsa-miR-1260、hsa-miR-1280、hsa-let-7e、hsa-miR-1255a表达下调。经软件预测靶基因,miR-589、miR-1260下游靶基因中均包括Ets-1(E-cadherin抑制转录子SIP1的上游调节因子)。选择miRNA589为研究对象,Realtime PCR结果提示,设对照组2-ΔΔCT值为1,TGF-p1刺激24h组miRNA589的2-ΔΔCT值为0.6992±0.0924(p<0.01). 结论TGF-β1可成功诱导腹膜间皮细胞发生EMT,同时miRNA表达图谱发生特征性改变。分析各miRNA表达量及预测下游靶基因,其中miR-589可能参与TGF-β1诱导的EMT调控。第二章miRNA-589介导人腹膜间皮细胞上皮-间充质转分化的分子机制目的探讨miRNA589对体外人腹膜间皮细胞株(HPMC)EMT的影响及分子机制。方法常规培养HPMC细胞,分为对照组(无血清DMEM/F12培养)、TGF-β1组(TGF-β15ng/m1诱导24h)、TGF-β1+pre-miR-589组(pre-miR-589预转染HPMC后以TGF-β15ng/ml诱导24h)。采用Realtime PCR检测miRNA589:应用Realtime *** blot分别检测E-cadherin、ZO-1、vimentin、Ets-1 mRNA和蛋白的表达;应用Realtime PCR检测SIP1 mRNA的表达。结果*** PCR结果显示,与对照组相比,TGF-β1组miRNA589水平明显

关键词： miRNA 上皮-间充质转分化腹膜透析 TGF-β1 miRNA589 Ets-1

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波形蛋白在实验性肾间质纤维化上皮-间充质转分化中的表达及意义

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中国组织化学与细胞化学杂志 2009年第1期18卷 9-14页

作者：周娟张悦陆海英刘煜敏上海中医药大学科技实验中心上海201203 上海中医药大学护理学院上海201203

目的明确肾脏纤维化中波形蛋白表达在上皮-间充质转分化观察中的意义。方法雄性SD大鼠12只,随机分成假手术组和模型组,模型组行单侧输尿管梗阻术。造模后14天处死大鼠,分别采用免疫组织化学染色和Western印迹法对梗阻侧肾组织波形蛋白... 详细信息

目的明确肾脏纤维化中波形蛋白表达在上皮-间充质转分化观察中的意义。方法雄性SD大鼠12只,随机分成假手术组和模型组,模型组行单侧输尿管梗阻术。造模后14天处死大鼠,分别采用免疫组织化学染色和Western印迹法对梗阻侧肾组织波形蛋白和α平滑肌肌动蛋白作定性和定量检测。并通过体外实验用TGF-β1刺激诱导人近端小管上皮细胞株(HK-2)发生上皮-间充质转分化。采用间接免疫荧光法对E-钙粘蛋白和波形蛋白进行染色,采用激光共聚焦显微镜观察细胞形态改变,并用蛋白印迹法定量检测HK-2细胞波形蛋白和α平滑肌肌动蛋白表达水平。结果萎缩和扩张的肾小管上皮细胞出现波形蛋白和α平滑肌肌动蛋白表达,肾组织中波形蛋白和α平滑肌肌动蛋白表达量显著增加;正常的HK-2细胞,细胞形态为不规则圆形,TGF-β1刺激后细胞伸展成长梭形;细胞α平滑肌肌动蛋白表达水平显著增加,波形蛋白表达水平无显著变化。结论体内实验研究上皮-间充质转分化,将波形蛋白作为间充质细胞标志物具有较好的参考价值,而体外研究中,其标志作用尚存在争议。

关键词：上皮-间充质转分化波形蛋白单侧输尿管梗阻转化生长因子-β1

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硫化氢抑制腹膜间皮细胞上皮—间充质转分化（EMT）机制的研究

硫化氢抑制腹膜间皮细胞上皮—间充质转分化（EMT）机制的研究

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作者：程胜男苏州大学

学位级别：硕士

目的:探讨硫化氢(H2S)抑制大鼠腹膜纤维化腹膜间皮细胞EMT的分子机制。方法:1.体内实验:20只SD大鼠(雄性)随机分成4组:(1)对照组:生理盐水20 m L/d腹腔注射;(2)H2S组:Na HS 1μmol/kg*d加入生理盐水中腹腔注射;(3)建模组:4.25%高糖腹膜... 详细信息

目的:探讨硫化氢(H2S)抑制大鼠腹膜纤维化腹膜间皮细胞EMT的分子机制。方法:1.体内实验:20只SD大鼠(雄性)随机分成4组:(1)对照组:生理盐水20 m L/d腹腔注射;(2)H2S组:Na HS 1μmol/kg*d加入生理盐水中腹腔注射;(3)建模组:4.25%高糖腹膜透析液20m L/d腹腔注射,第1,3,5,7天加入脂多糖(LPS)0.6mg/kg腹腔注射;(4)H2S治疗组:4.25%高糖腹膜透析液20m L/d腹腔注射,第1,3,5,7天加入脂多糖(LPS)0.6mg/kg腹腔注射+Na HS 1μmol/kg*d腹腔注射。28天后取壁层腹膜组织行Masson染色观察腹膜和胶原纤维厚度。2.体外实验:无菌条件下获取大鼠腹膜,消化处理后获得大鼠原代腹膜细胞,体外培养。待细胞生长2-3代时,将同步化后的大鼠原代腹膜间皮细胞随机分为6组:(1)对照组:无处理;(2)建模组:4.25%葡萄糖腹膜透析液:15%FBS完全培养液(V:V)=1:1;(3)50μmol/L H2S治疗组:4.25%葡萄糖腹膜透析液:15%FBS完全培养液(V:V)=1:1+50μmol/L Na HS;(4)100μmol/L H2S治疗组:4.25%葡萄糖腹膜透析液:15%FBS完全培养液(V:V)=1:1+100μmol/L Na HS;(5)300μmol/L H2S治疗组:4.25%高糖腹膜透析液:15%FBS完全培养液(V:V)=1:1+300μmol/L Na HS;(6)H2S组:无处理细胞+300μmol/L Na HS。其中Na HS提前预处理30min。通过RT-PCR检测细胞内IL-6和MCP-1的表达,Western Blot法检测细胞纤维化相关蛋白及TGF-β1信号通路中Smad3、Smad2/3及磷酸化蛋白的表达水平。结果:1.体内实验:Masson染色示:与对照组比较,建模组大鼠腹膜间皮细胞下胶原纤维沉积量明显增加,致密层明显增厚,腹膜厚度显著增加(P<0.001),给予H2S治疗后,胶原纤维沉积量、腹膜厚度等明显降低(P<0.01)。2.体外实验:与对照组比较,建模组腹膜间皮细胞炎症因子IL-6和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达明显增加,紧密连接蛋白ZO-1和细胞角蛋白(cytokeratin)表达显著降低,α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)、纤维黏连蛋白(FN)及磷酸化Smad3和Smad2/3蛋白表达显著增加;予Na HS干预后,与建模组比较,上述炎症因子表达明显减少,ZO-1和cytokeratin蛋白表达增加,α-SMA、PAI-1、FN及磷酸化Smad3和Smad2/3蛋白表达显著降低,差异有统计学意义。结论:1.外源性H2S可抑制高糖腹膜透析液与LPS所致的慢性腹膜炎大鼠腹膜纤维化。2.H2S可以通过影响腹膜间皮细胞EMT改善腹膜纤维化。3.H2S的抗EMT机制与其调控TGF-β1-Smad信号通路及抑制炎症有关。综上所述,H2S能够抑制大鼠腹膜间皮细胞EMT过程从而改善腹膜纤维化。H2S的抗腹膜间皮细胞EMT机制与其调控TGF-β1-Smad信号通路及抑制炎症有关。

关键词：腹膜纤维化硫化氢上皮-间充质转分化 TGF-β1

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23KD ALR对高糖处理的HK-2细胞上皮-间充质转分化的影响

23KD ALR对高糖处理的HK-2细胞上皮-间充质转分化的影响

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作者：廖田田遵义医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨上调和下调23k D ALR表达对高糖作用下的HK-2细胞EMT的影响。方法:1.应用sh RNA/ALR慢病毒和对应空载慢病毒转染HK-2细胞,建立稳定下调ALR表达的HK-2细胞株及对应空载病毒对照细胞株,分别用ALR低表达组(sh RNA/ALR)和空载病毒... 详细信息

目的:探讨上调和下调23k D ALR表达对高糖作用下的HK-2细胞EMT的影响。方法:1.应用sh RNA/ALR慢病毒和对应空载慢病毒转染HK-2细胞,建立稳定下调ALR表达的HK-2细胞株及对应空载病毒对照细胞株,分别用ALR低表达组(sh RNA/ALR)和空载病毒组(sh RNA/ALR-con)表示。应用慢病毒过表达技术过表达ALR,转染HK-2细胞,建立稳定上调ALR表达的HK-2细胞株及对应空载病毒对照细胞株,分别用ALR过表达组(ALR overexpression,ALR-OE)和空载病毒组(empty vector,EV)表示。用Western blot和RT-q PCR法验证转染效果。CCK8法检测ALR低表达组、ALR过表达组和正常HK-2细胞的增殖能力的差异。2.高糖培养基(30m M的葡萄糖)处理正常HK-2细胞、稳定下调23k D ALR的HK-2细胞、稳定上调23k D ALR的HK-2细胞72小时,分别作为高糖组(即HG组)、sh RNA/ALR-HG组、ALR OE-HG组,甘露醇处理正常HK-2细胞72小时作为对照组(即Mannitol组),用Western blot检测各组上皮细胞标记物E-cadherin、间充质标记物α-SMA、TGF-β1通路关键蛋白Smad3表达情况,免疫荧光检测α-SMA表达情况,ELISA检测各组间质基质成分Col I和FN的变化情况。结果:1.通过慢病毒载体成功构建稳定低表达及过表达23k D ALR的HK-2细胞模型。ALR低表达的HK-2细胞活性在48h时较正常HK-2细胞低,ALR过表达组HK-2细胞活性在24h时较正常组HK-2细胞高,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.高糖刺激各组72h后,Western blot结果显示,与正常组比较,HG组和sh RNA/ALR组E-cadherin表达明显减少,α-SMA和Smad3表达明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05),而ALR-OE组E-cadherin表达增多,α-SMA、Smad3表达明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);与HG组比较,sh RNA/ALR组E-cadherin、α-SMA、Smad3表达无明显差异,sh RNA/ALR-HG组E-cadherin表达明显减少,α-SMA、Smad3表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),而ALR-OE组和ALR-OE-HG组E-cadherin表达增多,α-SMA、Smad3表达明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);与ALR OE组比较,ALR OE-HG组E-cadherin表达降低,α-SMA、Smad3表达升高,差异有统计学意义(P<0.05);ELISA检测显示,与HG组相比,sh RNA/ALR-HG组的Col I、FN浓度更高,差异有统计学意义(P<0.05),ALR-OE-HG组的Col I、FN浓度更低,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光检测显示,与HG组相比,sh RNA/ALR-HG组α-SMA表达上调,ALR-OE-HG组α-SMA表达下降。结论:1.23k D ALR影响了HK-2细胞的活性,高糖培养参与了HK-2细胞EMT过程。2.与单纯高糖处理相比,下调HK-2细胞23k D ALR表达可使高糖处理后的HK-2细胞EMT相关因子,如α-SMA、Smad3蛋白表达及细胞外基质浓度升高更显著,而E-cadherin蛋白表达下降更明显,上调HK-2细胞23k D ALR表达则结果呈现相反趋势,从两方面论证23k D ALR可抑制高糖处理的HK-2细胞上皮-间充质转分化过程。

关键词：人肾小管上皮细胞肝再生增强因子上皮-间充质转分化糖尿病肾病

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microRNA-31对高糖条件下人足细胞上皮-间充质转分化的影响

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国际内分泌代谢杂志 2022年第5期42卷 354-359页

作者：乐颖蒋科威薛萌张秀珍袁凤易深圳市人民医院、暨南大学第二临床医学院、南方科技大学第一附属医院内分泌科 518020 深圳市人民医院、暨南大学第二临床医学院、南方科技大学第一附属医院老年病科 518020

目的探讨microRNA-31(miR-31)在高糖诱导足细胞上皮-间充质转分化(EMT)中的机制。方法将体外培养的人肾小球足细胞按不同糖浓度分为低糖组(LG)、高渗组(HM)和高糖组(HG);按是否转染过表达miR-31(miR-31 mimics)分为miR-31过表达组(miR-... 详细信息

目的探讨microRNA-31(miR-31)在高糖诱导足细胞上皮-间充质转分化(EMT)中的机制。方法将体外培养的人肾小球足细胞按不同糖浓度分为低糖组(LG)、高渗组(HM)和高糖组(HG);按是否转染过表达miR-31(miR-31 mimics)分为miR-31过表达组(miR-31m组)、阴性对照组(miR-NC组)和脂质体组(Mock组);按照是否转染沉默低氧诱导因子-1抑制剂(FIH-1)及沉默miR-31(miR-31 inhibitor)分为FIH-1沉默组(si-FIH-1组)、miR-31沉默组(miR-31i组)、FIH-1沉默+miR-31沉默组(si-FIH-1+miR-31i组)及阴性对照组(NC组)。采用实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)和Western blot检测各组细胞低氧诱导因子-1抑制剂(FIH-1)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA和蛋白表达水平;采用双荧光素酶靶标实验验证miR-31与FIH-1基因的靶向关系。结果与LG和HM组比较,HG组miR-31表达水平显著升高(F=146.8,P<0.01),FIH-1蛋白表达水平明显下降(F=54.23,P<0.01),而TGF-β1及α-SMA蛋白表达水平均显著升高(F=360.6,P<0.01;F=193.7,P<0.01)。双荧光素酶报告基因实验分析结果显示,FIH-1是miR-31的靶基因。si-FIH-1与miR-31i共同转染时,可以恢复si-FIH-1或miR-31i单独转染导致的FIH-1、TGF-β1、α-SMA的mRNA及蛋白表达变化。结论miR-31靶向调控FIH-1促进足细胞EMT,抑制miR-31的表达可减轻高糖诱导的足细胞EMT。

关键词： miR-31 低氧诱导因子-1抑制剂糖尿病肾脏病足细胞上皮-间充质转分化

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