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低分子肝素钠调控miR-33a-3p、S1PR1表达促进不明原因反复妊娠丢失大鼠Treg细胞分化

中国药学杂志 2025年第1期60卷 47-54页

作者：耿旭景毛跟红项云改万利静王梦朱颖谭丽郑州大学第二附属医院生殖医学部

目的探究低分子肝素钠可否调控miR-33a-3p、1-磷酸鞘氨醇受体1（S1PR1）表达影响不明原因反复妊娠丢失（URPL）大鼠调节性T细胞（Treg）分化。方法 60只雌性大鼠随机分为空白对照组（Control）、阴性对照组（NC）、URPL组、低分子肝素... 详细信息

目的探究低分子肝素钠可否调控miR-33a-3p、1-磷酸鞘氨醇受体1（S1PR1）表达影响不明原因反复妊娠丢失（URPL）大鼠调节性T细胞（Treg）分化。方法 60只雌性大鼠随机分为空白对照组（Control）、阴性对照组（NC）、URPL组、低分子肝素钠组（LMWH）和芬戈莫德（FTY720）组，每组12只。妊娠第8天、第12天时，采用背部多部位皮下注射抗心磷脂抗体（ACA）-IgG诱导大鼠URPL模型；LMWH组、FTY720组在URPL组基础上给药。妊娠第0天至第15天，LMWH组大鼠皮下注射低分子肝素钠(420 IU·kg-1),FTY720组尾静脉注射FTY720(100μg·kg-1),Control组、NC组、URPL组大鼠尾静脉注射等量生理盐水。治疗结束后，胚胎称重并计算胚胎吸收率；苏木精-伊红（HE）染色观察胎盘组织病理学；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清白介素（IL）-10、转化生长因子-β1（TGF-β1）水平；实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）和蛋白印迹（Western blot）检测胎盘组织中miR-33a-3p、S1PR1、叉头框蛋白P3（FOXP3）、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）、糖皮质激素诱导肿瘤坏死因子受体（GITR）mRNA和蛋白水平；流式细胞术检测胎盘组织中Treg细胞数量。结果 Control组、NC组大鼠胎盘细胞排列整齐、结构清晰；与Control组相比，URPL组胚胎质量减轻，胚胎吸收率升高，胎盘组织存在大量炎症细胞浸润、细胞增生和水肿，血清IL-10、TGF-β1水平降低，胎盘组织miR-33a-3p、FOXP3、CTLA-4、GITR mRNA和蛋白水平降低，S1PR1 mRNA和蛋白水平升高，Treg细胞数量减少（P<0.05）;与URPL组相比，LMWH组、FTY720组胚胎质量增加，胚胎吸收率降低，胎盘组织病理损伤明显减轻，可见少量炎症细胞浸润和水肿，血清IL-10、TGF-β1水平升高，胎盘组织miR-33a-3p、FOXP3、CTLA-4、GITR mRNA和蛋白水平升高，S1PR1 mRNA和蛋白水平降低，Treg细胞数量增多（P<0.05）;LMWH组、FTY720组上述指标差异无统计学意义（P>0.05）。结论低分子肝素钠可能通过调控miR-33a-3p、S1PR1表达促进URPL大鼠Treg细胞分化。

关键词：低分子肝素钠 miR-33a-3p 1-磷酸鞘氨醇受体1 不明原因反复妊娠丢失调节性T细胞

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不明原因反复妊娠丢失的中西医病因研究进展与治疗现状

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大医生 2023年第3期8卷 140-144页

作者：邵含范小利上海市松江区中心医院中医科上海201600

反复妊娠丢失(RPL)是育龄期女性常见的临床疾病,而不明原因的反复妊娠丢失(URPL)由于病因不明更是临床治疗难点。西医认为,导致RPL的主要病因有解剖因素、感染性因素、内分泌因素、免疫学因素和遗传性因素。治疗多以补充孕激素、应用抗... 详细信息

反复妊娠丢失(RPL)是育龄期女性常见的临床疾病,而不明原因的反复妊娠丢失(URPL)由于病因不明更是临床治疗难点。西医认为,导致RPL的主要病因有解剖因素、感染性因素、内分泌因素、免疫学因素和遗传性因素。治疗多以补充孕激素、应用抗血栓药物及免疫治疗等为主。中医理论认为,此病归属于“滑胎”“数堕胎”的疾病范畴,其病机多以肾虚为本,涉及肝、脾、肾等脏腑,气血失调、损伤冲任是其发病机制;以“预培其损”为治疗原则,主张预培其损、未孕先防,结合西医辨病及中医辨证的治疗方法,用药方面以补肾健脾、益气养血、调理冲任为主,同时灵活辅以针灸治疗,临床效果显著。本文分别从中医和西医的视角,对URPL的研究进展和治疗现状进行综述,以期为临床提供参考。

关键词：反复妊娠丢失不明原因反复妊娠丢失免疫性不孕 Th1/Th2细胞因子滑胎预培其损针灸

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MiRNA表达异常靶向S1PR1抑制Treg细胞分化导致不明原因反复妊娠丢失的机制研究

MiRNA表达异常靶向S1PR1抑制Treg细胞分化导致不明原因反复妊娠丢...

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作者：耿旭景郑州大学

学位级别：博士

背景和目的：　　反复妊娠丢失(Recurrent pregnancy loss,RPL)是指妊娠24周之前连续两次次及以上临床确诊的自然妊娠丢失。统计数据表明，全球约有1％-2％的孕龄妇女患有RPL，大约15％临床确诊的妊娠最终以自然流产为结局。目前发现，... 详细信息

背景和目的：　　反复妊娠丢失(Recurrent pregnancy loss,RPL)是指妊娠24周之前连续两次次及以上临床确诊的自然妊娠丢失。统计数据表明，全球约有1％-2％的孕龄妇女患有RPL，大约15％临床确诊的妊娠最终以自然流产为结局。目前发现，多种因素可导致RPL的发生，其中包括母体生殖道异常、内分泌和免疫功能紊乱、精子质量不佳、感染、血栓形成和染色体异常等。然而，至今仍有超过50％的RPL患者病因不明，称为不明原因反复妊娠丢失(Unexplained recurrent pregnancy loss,URPL)，即URPL。　　人类的正常妊娠过程是一个受到精密调控的复杂生理过程。母-胎界面的免疫耐受调节，特别是各种免疫细胞及相关分子间的相互调节在妊娠过程中起着决定性的作用。调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)是一类表达FOXP3转录因子的CD4+T细胞，在维持免疫耐受和预防自身免疫中发挥重要作用。研究发现，RPL患者蜕膜中Treg细胞数量减少，提示Treg数量异常是导致流产的重要因素之一。然而，导致RPL患者Treg细胞数量减少的分子机制尚不明确。　　1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate，S1P)是一种生物活性大分子，可与免疫细胞表面的S1P受体(S1Preceptors,S1PRs)结合，调节免疫细胞的迁移、增殖和细胞因子的释放。鞘氨醇激酶(Sphingosine kinase,SPHK)是催化磷酸化鞘氨醇生成S1P的关键酶。SPHK1和SPHK2是鞘氨醇激酶的两种主要形式。据报道，PI3K-AKT-mTOR轴在Treg细胞体内外分化过程中发挥抑制作用。S1PR1信号通路通过选择性激活PI3K-AKT-mTOR激酶通路，传递一种内在的负调控信号来抑制胸腺Treg细胞生成、外周维持，抑制Treg细胞活性。但是，S1P、S1PR1在RPL患者中的表达如何？是否参与Treg细胞的调控从而导致RPL尚不清楚。　　MiRNA是一类内源性非编码RNA，碱基长度20-25bp，主要通过与靶基因mRNA的3''非编码区(3''UTR)结合，导致靶基因mRNA的降解或翻译抑制，从而实现对靶基因的表达抑制。研究发现，多种非编码RNA参与了整个妊娠过程,而部分非编码RNA，特别是多种miRNA的表达异常被认为与RPL的发生相关。研究表明，某些特定的miRNA,例如miR-19a、miR-181a、miR-542、miR-125b、miR-149等可直接通过靶向S1PR1、S1PR2等关键基因的表达，调节S1P信号通路。同时，S1P信号通路也可直接调控多个miRNA的表达，如miR-17、miR-1、miR-206、miR-486等。MiRNA-S1P信号间的相互作用异常发生于多种病理过程中。然而，其在URPL过程中是否存在异常，尚不明确。　　本研究主要探讨S1P和S1PR1在URPL患者中的表达情况，明确S1P-S1PR1信号通路主要成员对URPL患者Treg细胞分化的影响，揭示S1P-S1PR1信号通路在URPL患者中的可能调控机制，从而为URPL治疗提供新的方向或治疗靶标。　　第一部分 URPL患者Treg细胞亚群的变化研究　　方法：　　1.临床资料:URPL组:36例，经过临床筛查，排除了已知的RPL病因，包括染色体异常、子宫结构异常、内分泌和免疫功能异常、生殖道感染、男性因素等。对照组:40例，自愿终止妊娠的健康受试者。　　2.胎盘组织中原代T细胞的分离:收集URPL患者和对照组流产排出物中胎盘母体侧组织，分离其中的免疫细胞。　　3.流式细胞仪检测Treg细胞亚群的比例:对分离获得的原代胎盘细胞进行染色，流式细胞术对其中的T细胞亚群进行分析。　　结果：　　***患者胎盘组织中CD4+T细胞比例并无显著改变。　　***患者胎盘组织中CTLA4+CD4+T细胞比例无显著改变，但Tim3+CD4+T细胞比例显著降低。　　***患者胎盘组织中Treg细胞比例显著降低，特别是Tim3+Treg细胞。　　第二部分 S1P-S1PR1通路主要成员在URPL患者中差异表达的研究　　方法：　　1.血浆S1P含量检测:收集URPL患者和对照组外周血，分离血浆。利用ELISA方法检测血浆中S1P的含量。　　2.胎盘组织中SPHK1和SPHK2表达量的检测:分别提取两组胎盘组织中总蛋白，利用免疫印迹方法检测SPHK1和SPHK2的表达量。　　3.检测胎盘T细胞中S1PR1的表达量变化:利用免疫印迹方法检测T细胞中S1PR1蛋白水平的变化，流式细胞术检测T细胞表面S1PR1水平的变化。　　4.检测胎盘T细胞S1PR1转录水平的变化:提取胎盘T细胞总RNA，利用RT-qPCR方法检测S

关键词：不明原因反复妊娠丢失内源性非编码RNA S1PR1信号通路调节性T细胞细胞分化病理机制

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生长分化因子15（GDF15）通过调控滋养层细胞侵袭参与反复妊娠丢失发生的功能机制研究

生长分化因子15（GDF15）通过调控滋养层细胞侵袭参与反复妊娠丢...

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作者：吕椿子山东大学

学位级别：博士

研究背景:反复妊娠丢失(Recurrentpregnancyloss,RPL)指妊娠20周前发生两次或者两次以上的临床妊娠失败,发病率为1%-5%,严重影响女性身心健康,是亟待解决的辅助生殖领域难题。非整倍体胚胎是导致反复妊娠丢失的最常见原因,除此类遗传因... 详细信息

研究背景:反复妊娠丢失(Recurrentpregnancyloss,RPL)指妊娠20周前发生两次或者两次以上的临床妊娠失败,发病率为1%-5%,严重影响女性身心健康,是亟待解决的辅助生殖领域难题。非整倍体胚胎是导致反复妊娠丢失的最常见原因,除此类遗传因素外,仍有近60%的反复妊娠丢失患者病因无法明确,称为不明原因反复妊娠丢失(Unexplained recurrent pregnancy loss,URPL),给临床诊断和治疗带来困境,亟待明确病因及机制,以指导临床开展精准诊疗。胎盘界面的建立是维持早期妊娠的关键环节。妊娠期间包括底蜕膜、壁蜕膜和滋养层细胞在内的子宫内膜和胚外组织构成母胎界面,是母体与胎儿直接“对话”的界面,涉及胎盘早期发育、子宫内膜蜕膜化等一系列复杂的生理过程。在胎盘早期发育过程中,绒毛外滋养层细胞(Extravillous trophoblast,EVT)是位于绒毛外并具有侵袭性的一类细胞,其侵袭力异常可导致子宫蜕膜螺旋动脉改造不足,引起RPL发生进展。然而,此过程的调控因子及其在RPL发生中的分子作用机制尚未完全揭示。生长分化因子15(Growth differentiation factor 15,GDF15)作为转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)超家族成员,在人类胎盘组织中表达丰富。GDF15表达变化与包括妊娠丢失、子痫前期和妊娠剧吐等妊娠并发症相关。既往已有学者提出GDF15调控滋养层细胞侵袭,但GDF15在调控母胎界面EVT侵袭和妊娠维持中的作用及分子机制尚不清楚。研究目的:明确不明原因反复妊娠丢失患者绒毛组织的转录组表达谱,深入探讨母胎界面建立过程中差异表达基因GDF15发挥的功能和相关分子机制,阐述GDF15参与URPL发生发展的相关机制,为其临床诊疗提供研究基础。研究方法:对正常妊娠孕早期行人工流产妇女和URPL患者的绒毛组织及血清标本分别进行转录组测序和ELISA检测分析筛选差异表达基因。使用小干扰RNA介导的GDF15敲降处理绒毛外植体、HTR-8/SVneo细胞系和人原代EVT细胞,采用包括TranswellTM侵袭实验、划痕实验和TranswellTM迁移实验在内的多种实验手段进行绒毛外滋养层细胞的功能研究。对小干扰RNA介导的GDF15敲降处理的HTR-8/SVneo细胞进行转录组测序筛选下游潜在靶基因,并采用包括Western blot、RT-qPCR等实验进行相关分子机制研究。采用经典的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导流产小鼠模型进行体内验证。研究结果:本研究依据正常妊娠孕早期行人工流产妇女和URPL患者的绒毛组织转录组测序结果筛选差异基因GDF15。与早期正常妊娠相比,URPL患者的绒毛组织和血清样本中GDF15水平显著降低。小干扰RNA介导GDF15敲降绒毛外植体能抑制绒毛外植体侵袭功能,小干扰RNA介导GDF15敲降HTR-8/SVneo细胞系和人原代EVT细胞抑制滋养层细胞侵袭和迁移功能,并且不受滋养层细胞增殖和凋亡功能影响。对小干扰RNA介导GDF15敲降处理的HTR-8/SVneo细胞进行转录组测序,结合生物信息学分析筛选出下游潜在靶基因JAG1。后续研究发现人绒毛外滋养层细胞中采用小干扰RNA敲降GDF15能够通过降低β-catenin表达,阻碍β-catenin与TCF4相互作用,下调齿状蛋白1(jagge-1,JAG1)表达,进而抑制NOTCH3/HES1通路激活,从而阻碍人绒毛外滋养层细胞侵袭。值得注意的是,JAG1过表达可以挽救由于GDF15敲降抑制绒毛外滋养层细胞侵袭的现象。此外,在LPS诱导流产的小鼠模型中,血清和胎盘中GDF15表达水平降低,体内补充重组鼠GDF15蛋白能够挽救LPS导致的小鼠胚胎吸收,且重组鼠GDF15蛋白可能通过介导滋养层细胞侵袭降低LPS导致的小鼠胚胎吸收情况。结论:妊娠早期母胎界面中GDF15表达不足能够通过抑制JAG1/NOTCH3/HES1通路激活导致EVT侵袭力下降,进而影响子宫内膜重塑并参与URPL发生进展,此发现提示GDF15可作为URPL临床诊断和治疗靶点。

关键词：绒毛外滋养层生长分化因子15(GDF15) 齿状蛋白1(JAG1) 绒毛外滋养层细胞侵袭不明原因反复妊娠丢失

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