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冷暴露诱导TLR2和TLR4小鼠腹腔原代中性粒细胞形成NETs的初步研究

黑龙江八一农垦大学学报 2022年第4期34卷 53-58页

作者：鞠憬徐彬刘洋曹禹胡亚捷周万慧杨玉英李士泽黑龙江八一农垦大学动物科技学院大庆163319

中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)是中性粒细胞活化后释放到胞外的一种纤维网状结构,此过程被称为嗜中性粒细胞病(NETosis),近年来被广泛关注。研究目的旨在探讨TLR2和TLR4基因敲除小鼠腹腔原代中性粒细胞(Po... 详细信息

中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)是中性粒细胞活化后释放到胞外的一种纤维网状结构,此过程被称为嗜中性粒细胞病(NETosis),近年来被广泛关注。研究目的旨在探讨TLR2和TLR4基因敲除小鼠腹腔原代中性粒细胞(Polymorp honuclears,PMNs)在冷暴露条件下形成NETs的能力。将8只基因敲除小鼠随机平均分为常温对照组(n=4)和4℃冷暴露组(n=4),并将此组小鼠置于4℃人工气候室中饲养3 h·d^(-1),连续一周后处死,提取腹腔原代PMNs。首先采用普通PCR法鉴定小鼠TLR2、TLR4基因成功敲除后,再通过扫描电镜的方法对PMNs形态结构的变化进行定性分析。PicoGreen核酸定量分析试剂盒检测细胞上清液中胞外DNA(Cell free DNA,cfDNA)的浓度,蛋白质免疫印迹方法检测瓜氨酸化的组蛋白(Citrullinated Histone 3,CitH3)和髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)的蛋白表达水平进行定量分析。结果显示:冷暴露组的PMNs表面有明显的皱缩变形,且有类似于伪足结构的NETs生成;NETs的组件蛋白CitH3、MPO的表达水平和cfDNA的浓度均显著升高。冷暴露能够诱导TLR2和TLR4基因敲除小鼠腹腔原代中性粒细胞形成NETs。

关键词：中性粒细胞中性粒细胞诱捕网冷应激 TLR2 TLR4

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Fgl2-MCOLN3-自噬轴介导NETs释放加重暴发性病毒性肝炎的机制研究

Fgl2-MCOLN3-自噬轴介导NETs释放加重暴发性病毒性肝炎的机制研究

引用

作者：李玺堂华中科技大学

学位级别：博士

目的:本研究主要探讨中性粒细胞诱捕网（Neutrophil Extracellular Traps,NETs）在急性肝衰竭（Acute Liver Failure,ALF）中的作用及调控NETs释放的相关机制。方法:腹腔注射3型鼠肝炎病毒（Murine Hepatitis Virus Strain-3,MHV-3）构建暴发性病毒性肝炎（Fulminant Viral Hepatitis,FVH）小鼠模型,腹腔注射对乙酰氨基酚（Acetaminophen,APAP）构建药物性肝衰竭模型。提取野生型（Wild Type,WT）小鼠感染MHV-3前及感染后的肝脏非实质细胞进行单细胞测序。腹腔注射脱氧核糖核酸酶I（Deoxyribonuelease 1,DNase 1）耗竭NETs,腹腔注射LY6G抗体（克隆号1A8）耗竭中性粒细胞;提取WT小鼠及fgl2敲除(fgl2-/-)小鼠骨髓中性粒细胞进行体外实验;临床上,检测乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus,HBV）导致的急性肝损伤（Acute Liver Injury,ALI）或ALF患者（HBV-ALI/ALF）、慢乙肝（Chronic Hepatitis B,CHB）患者及健康者（Healthy Control,HC）三组人群血浆及肝组织NETs相关指标并与临床指标进行相关性分析。结果:单细胞测序结果表明,病毒感染后小鼠肝脏中性粒细胞数量增加,全转录组数据提示病毒感染后肝脏NETs通路显著上调,并在肝组织中观察到NETs大量沉积。耗竭NETs后小鼠生存率显著提高（从4%提高到29%）,且促炎因子和肝组织纤维素沉积明显降低,肝脏病理损伤显著改善。而在APAP导致的肝衰竭中,未观察到肝组织中NETs的释放,且NETs相关标志物下降。MHV-3感染后,肝脏中性粒细胞FGL2表达上调,fgl2敲除后肝脏NETs减少,中性粒细胞释放NETs的能力显著降低。在过继实验中发现,与过继fgl2-/-中性粒细胞的fgl2-/-小鼠相比,过继WT中性粒细胞的fgl2-/-小鼠肝脏NETs释放明显增多,同时肝脏纤维素沉积增加,炎症因子水平升高,肝损伤加重。进一步机制研究发现,FGL2可与粘脂蛋白3（Mucolipin3,MCOLN3）结合,调控中性粒细胞钙离子内流,进而调控自噬及下游NETs释放。临床研究表明,与慢乙肝患者和健康对照相比,HBV-ALI/ALF患者血浆及肝脏NETs水平显著升高,且血浆NETs标志物髓过氧化物酶（Myeloperoxidase,MPO）水平与凝血酶原时间、国际标准化比值呈正相关,与凝血酶原活动度呈负相关;HBV-ALI/ALF患者中性粒细胞FGL2与MCOLN3表达上调,且FGL2阳性中性粒细胞较FGL2阴性中性粒细胞NETs释放增多。除此之外,我们在HBV-ALI/ALF患者肝组织中,观察到NETs、FGL2与纤维素共定位与肝损伤密切相关。结论:在病毒感染导致的急性肝衰竭中,NETs大量释放,加重肝脏病理损伤;在APAP导致的急性肝衰竭中,未观察到NETs的释放。在暴发性病毒性肝炎疾病进展过程中,中性粒细胞特异性FGL2可通过与MCOLN3相互作用激活自噬,从而促进NETs释放,介导纤维素沉积和炎症反应,加重肝组织损伤。

关键词：暴发性病毒性肝炎中性粒细胞诱捕网纤维介素蛋白2 粘脂蛋白3 自噬

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Slit2-Robo信号通路在烟草相关性肺气肿形成中的作用及机制研究

Slit2-Robo信号通路在烟草相关性肺气肿形成中的作用及机制研究

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作者：林媛珍广西医科大学

学位级别：博士

第一部分通过生物信息学分析发现Slit2-Robo信号通路可能参与了慢性阻塞性肺疾病的发病过程目的:探索重度慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者与健康吸烟者肺组织转录组之间的差异表达基因并进一步探讨COPD可能的发病机制。方法:通过检索GEO公... 详细信息

第一部分通过生物信息学分析发现Slit2-Robo信号通路可能参与了慢性阻塞性肺疾病的发病过程目的:探索重度慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者与健康吸烟者肺组织转录组之间的差异表达基因并进一步探讨COPD可能的发病机制。方法:通过检索GEO公共数据库获取包含有不伴肺癌的重度COPD患者及健康吸烟者的肺组织转录组表达谱的数据集,分别使用GEO2R在线分析网站进行每个数据集差异表达基因(DEGs)的筛选,随后使用R语言的Robust排序整合(RRA)程序包对不同数据集的DEGs进行整合分析,得到最终的整合DEGs,使用STRING在线数据库对整合的DEGs进行蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络分析,最后使用DAVID在线数据库分析网站对整合的DEGs进行GO功能富集及KEGG通路富集分析。结果:(1)在GEO数据库中筛选出来3个数据集:GSE1650、GSE38974及GSE76925,纳入了135例重度COPD患者及52例肺功能正常吸烟者,最终筛选出了314个整合DEGs,其中119个基因上调,195个基因下调。(2)通过PPI分析筛选出来20个关键的hub基因,这些基因主要与B细胞信号通路、炎症反应和肺泡破坏相关。(3)GO及KEGG分析显示炎症反应、细胞外基质的降解、免疫反应、凋亡信号通路、泛素化、Roundabout信号通路在COPD的发生发展中均发挥着重要的作用。(4)在GSE38974数据集中,与健康吸烟者相比,Slit2及Robo2在COPD患者中的表达是显著下调的、并且与COPD的GOLD分级呈显著负相关,其下游分子Rac2及Cdc42在COPD中显著上调、与COPD的GOLD分级呈显著正相关。结论:Slit2-Robo信号通路可能参与了COPD的发病过程。第二部分Slit2-Robo信号通路在烟草相关性肺气肿小鼠模型中的表达情况目的:探讨Slit2-Robo信号通路在烟草相关性肺气肿小鼠模型中的表达情况及Slit2与气道中中性粒细胞的表达之间的关系。方法:由广西医科大学动物实验中心提供的16只6-8周鼠龄的雄性C57BL/6J小鼠,随机分为空气暴露(AIR)组及慢性烟草烟雾暴露(CS)组,CS组进行24周的慢性烟草烟雾暴露,而AIR组则进行24周的空气伪暴露。右肺下叶组织固定、包埋、切片后进行HE染色并计算肺泡平均内衬间隔(Lm)评估肺气肿建模情况,免疫组化染色检测Slit2在肺组织中的表达情况。实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测肺组织中Slit2、Robo1、Robo2、Rac2及Cdc42的m RNA表达情况,Western blot方法检测肺组织中Slit2、Robo1及Robo2的蛋白表达情况,流式细胞术检测肺泡灌洗液(BALF)中的中性粒细胞的比例并与Slit2蛋白表达水平进行相关性分析。结果:(1)CS组的肺泡Lm较AIR组明显升高,免疫组化结果显示Slit2主要表达于支气管上皮细胞中,CS组小鼠肺组织中Slit2的表达较AIR组显著低下,并且与肺泡Lm呈显著负相关。(2)RT-PCR结果显示,与AIR组相比,CS组小鼠肺组织中Slit2、Robo1及Robo2的表达显著下调,而Rac2及Cdc42的表达无统计学差异。(3)Western blot结果显示,与AIR组相比,CS组小鼠肺组织中Slit2、Robo1及Robo2的蛋白表达水平明显下降,差异具有统计学意义。(4)流式细胞术结果显示,CS组小鼠BALF中中性粒细胞的比例较AIR组明显升高,并且Slit2的蛋白表达水平与BALF中中性粒细胞的比例呈显著负相关,差异具有统计学意义。结论:慢性烟草烟雾暴露下,小鼠肺组织中Slit2-Robo信号通路表达是显著下调的,并且Slit2的表达与肺气肿的程度及气道中的中性粒细胞的表达水平均呈显著负相关。Slit2-Robo信号通路参与了烟草相关性肺气肿的形成过程。第三部分烟草暴露对人支气管上皮细胞Slit2表达的作用及Slit2对烟草提取物诱导的中性粒细胞迁移运动的作用研究目的:探讨烟草暴露对人支气管上皮细胞Slit2表达的直接作用及Slit2能否调控烟草状态下的中性粒细胞的迁移运动。方法:1.通过GEO公共数据库中4个数据集(GSE7895、GSE20250、GSE37147及GSE97010)的转录组芯片表达数据分析急性吸烟前后、不吸烟者、正在吸烟者、曾经吸烟者及COPD患者体内气道上皮细胞Slit2表达的差异。2.采用人支气管上皮细胞BEAS-2B为主要研究对象,实验分组:(1)空白对照组;(2)烟草提取物(CSE)干预组。使用CCK8检测法测定不同CSE干预浓度下支气管上皮细胞的存活率。使用不同浓度的CSE干预细胞后,Western blot检测各组细胞Slit2的蛋白表达情况。3.使用新鲜提取的健

关键词：慢性阻塞性肺疾病 GEO数据库 Roundabout信号通路 Slit2 Slit2 Robo 烟草相关性肺气肿中性粒细胞烟草暴露支气管上皮细胞 Slit2 GEO公共数据库中性粒细胞 Slit2 烟草相关性肺气肿中性粒细胞中性粒细胞诱捕网

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FGF21与STEMI患者急诊PCI术后预后的相关性及其抑制心肌I/R损伤诱导的NETs形成的机制研究

FGF21与STEMI患者急诊PCI术后预后的相关性及其抑制心肌I/R损伤诱...

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作者：谷凌云东南大学

学位级别：博士

第一部分血清FGF21水平升高预测急诊PCI治疗后STEMI患者住院期间的心力衰竭研究目的:探讨血清成纤维细胞生长因子21(Fibroblast growth factor 21,FGF21)水平与接受急诊经皮冠状动脉介入治疗(Percutaneous coronary intervention,PCI)... 详细信息

第一部分血清FGF21水平升高预测急诊PCI治疗后STEMI患者住院期间的心力衰竭研究目的:探讨血清成纤维细胞生长因子21(Fibroblast growth factor 21,FGF21)水平与接受急诊经皮冠状动脉介入治疗(Percutaneous coronary intervention,PCI)后ST段抬高型心肌梗死(ST segment elevation myocardial infarction,STEMI)患者住院期间发生心力衰竭的相关性。方法:在2016年1月至2018年12月共纳入348例接受急诊PCI治疗的STEMI患者。通过中心实验室检测相关生化指标,ELISA法测定血清FGF21水平。记录患者住院期间心力衰竭的发生情况,通过二维超声心动图评估患者心功能。结果:发生心力衰竭的STEMI组的血清FGF21水平明显高于无心力衰竭组(249.95±25.52 vs 209.98±36.35,P<0.001)。血清FGF21水平与N末端B型利钠肽前体(N-terminal precursor B-type natriuretic peptide,NT-pro BNP)呈强正相关(r=0.749,P<0.001)。通过二元Logistic回归分析发现,FGF21是STEMI患者住院期间发生心力衰竭的独立危险因素。根据受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic,ROC)分析,FGF21预测STEMI患者住院期间发生心力衰竭的曲线下面积(Area under curve,AUC)为0.816(95%CI:0.770-0.863)。结论:血清FGF21水平升高被证明是急诊PCI术后STEMI患者住院期间发生心力衰竭的有力预测因子。第二部分血清FGF21水平升高预测急诊PCI治疗后STEMI患者的主要不良心血管事件研究目的:尽管已有多项研究发现血清FGF21水平和急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)有关,但FGF21在急诊PCI后STEMI患者中的预测价值尚未被研究过。方法:在2016年1月至2018年12月共纳入348例接受急诊PCI治疗的STEMI患者。80例稳定型心绞痛(Stable angina,SA)患者作为对照组。研究的终点事件是首次发生的主要不良心血管事件(Major adverse cardiovascular events,MACE),中位随访24个月。通过ELISA法测定血清FGF21水平。结果:STEMI组的血清FGF21水平显著高于SA组(225.03±37.98 vs 135.51±34.48,P<0.001)。随访期间,30名患者失访,观察到106名患者首次出现了MACE,其中包括6名患者死亡,100名患者因心绞痛、心力衰竭或再发AMI住院。排除失访病例后,STEMI患者被分为MACE组和无MACE组,MACE组的血清FGF21水平明显高于无MACE组(247.24±22.96 vs 208.56±35.62,P<0.001)。根据ROC分析,FGF21、NT-pro BNP、肌钙蛋白I的AUC分别为0.812、0.865、0.773。三者联合的AUC为0.897(95%CI:0.859-0.928),其预测MACE的价值高于任何一个因子,差异具有统计学差异(P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲线显示血清FGF21水平较低的STEMI患者MACE发生率低。Cox分析显示,基线血清FGF21水平(HR:2.011,95%CI:1.160-3.489)升高被证明是急诊PCI后STEMI患者发生MACE的有力预测因子。结论:基线血清FGF21水平升高被证明是急诊PCI术后STEMI患者发生MACE的有力预测因子。第三部分FGF21通过AMPK抑制心肌I/R损伤诱导的NETs形成研究目的:既往研究发现FGF21具有抗炎作用,但FGF21是否能够通过抑制中性粒细胞诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)形成,发挥抗炎作用以减轻心肌I/R损伤尚未被研究过。方法:小鼠被随机分为对照组、I/R组和I/R+FGF21组,建立I/R损伤模型。通过免疫荧光染色检测心肌组织中的NETs,通过Pico Green试剂盒检测血清NETs水平。通过Western blot检测AMPK的表达水平。为进一步探讨FGF21和AMPK的关系,AMPK的抑制剂和激动剂预处理H9c2细胞后建立H/R模型,通过Western blot检测FGF21的表达水平。结果:与对照组相比,I/R组心肌组织中大量NETs形成,血清NETs水平明显升高(97.63±11.45 vs 69.

关键词：成纤维细胞生长因子21 ST段抬高型心肌梗死心力衰竭成纤维细胞生长因子21 ST段抬高型心肌梗死主要不良心血管事件成纤维细胞生长因子21 I/R损伤中性粒细胞诱捕网

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绿原酸联合头孢他啶对肺部铜绿假单胞菌生物被膜感染的作用及机制研究

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世界最新医学信息文摘 2023年第29期23卷 114-119页

作者：刘六媛孔晋亮杨婷谭政刘冬梅广西医科大学第一附属医院呼吸与危重症医学科，广西南宁 530021 广西医科大学第一附属医院呼吸与危重症医学科，广西南宁 530021 广西医科大学第一附属医院呼吸与危重症医学科，广西南宁 530021 广西医科大学第一附属医院呼吸与危重症医学科，广西南宁 530021 广西医科大学第一附属医院呼吸与危重症医学科，广西南宁 530021

目的探讨绿原酸联合头孢他啶对铜绿假单菌生物被膜感染的作用及免疫调控机制。方法将50只SPF级SD大鼠随机分对照组、模型组、绿原酸组、头孢他啶组、药物联用组。观察大鼠药物干预前后的状况;采用连续稀释活菌计数法评估肺组织细菌... 详细信息

目的探讨绿原酸联合头孢他啶对铜绿假单菌生物被膜感染的作用及免疫调控机制。方法将50只SPF级SD大鼠随机分对照组、模型组、绿原酸组、头孢他啶组、药物联用组。观察大鼠药物干预前后的状况;采用连续稀释活菌计数法评估肺组织细菌负荷量;苏木精-伊红染色观察大鼠肺部组织病理学变化;免疫荧光染色法观察肺部组织中性粒细胞诱捕网（NETs）的形态;Picoogreen法定量NET-DNA浓度。结果药物联用组菌落负荷量低于药物单用组，且P<0.05;病理学提示：药物联用组炎症程度明显低于药物单用组;绿原酸组NE

关键词：铜绿假单菌生物被膜绿原酸头孢他啶中性粒细胞诱捕网 NETosis

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痛风的自发缓解与NETs

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东南大学学报（医学版） 2022年第1期41卷 154-158页

作者：李志岭张剑勇贾二涛广州中医药大学第四临床医学院广东深圳518000 深圳市中医院广东深圳518000

急性痛风的自发缓解机制仍存在很多未知,中性粒细胞程序性死亡后形成中性粒细胞诱捕网(NETs)继续参与炎症反应。随着研究的深入,研究者对NETs的认识逐渐清晰,NETs并非绝对抗炎,而是可能通过NETs密度的增加以及维持NETs平衡等机制协助酶... 详细信息

急性痛风的自发缓解机制仍存在很多未知,中性粒细胞程序性死亡后形成中性粒细胞诱捕网(NETs)继续参与炎症反应。随着研究的深入,研究者对NETs的认识逐渐清晰,NETs并非绝对抗炎,而是可能通过NETs密度的增加以及维持NETs平衡等机制协助酶水解炎症因子而发挥抗炎作用。

关键词：痛风炎症自发缓解中性粒细胞中性粒细胞诱捕网综述

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细胞外游离组蛋白在脓毒症发生发展及治疗中的作用研究进展

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山东医药 2023年第33期63卷 88-91页

作者：耿凡毅刘虹山西医科大学第一临床医学院太原030000 山西医科大学第一医院重症医学科

在脓毒症发生发展期间,中性粒细胞诱捕网(NETs)的形成及细胞凋亡坏死会导致组蛋白释放至细胞外,形成细胞外游离组蛋白(CFHs)。CFHs从多个方面参与脓毒症的发生发展,CFHs具有一定抗菌效果、会破坏细胞膜产生细胞毒性、参与炎症反应、损... 详细信息

在脓毒症发生发展期间,中性粒细胞诱捕网(NETs)的形成及细胞凋亡坏死会导致组蛋白释放至细胞外,形成细胞外游离组蛋白(CFHs)。CFHs从多个方面参与脓毒症的发生发展,CFHs具有一定抗菌效果、会破坏细胞膜产生细胞毒性、参与炎症反应、损伤内皮细胞、影响凝血功能,以此延长脓毒症的病程,加重病情。CFHs作为脓毒症潜在治疗靶点也得到了很大的发展,出现了抑制CFHs的产生、降低循环中的CFHs的含量或降低CFHs细胞毒性等治疗方法,有望成为治疗脓毒症的新策略。

关键词：组蛋白细胞外游离组蛋白脓毒症中性粒细胞中性粒细胞诱捕网

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