检索结果-内蒙古大学图书馆

惠州学院学报 2022年第6期42卷 34-38页

作者：王玉俭代绍密李晓燕黄冰冰宋冠华钟平生惠州学院生命科学学院广东惠州516007

为探究长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)巨噬细胞移动抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor,MIF)基因(HlMIF)的功能,采用RT-PCR方法对HlMIF基因进行扩增,运用大肠杆菌表达体系对HlMIF基因进行体外重组表达,随后对纯化后的重组HlMIF蛋白进行互变异构梅活性分析。结果表明:HlMIF基因开放阅读框为351 bp,编码116个氨基酸,预测成熟蛋白的分子量为12.5 ku;HlMIF基因在大肠杆菌上清中成功表达,大小为17.4ku;重组HlMIF蛋白具有互变异构酶活性;利用大肠杆菌成功表达具有酶活力的重组HlMIF蛋白,为进一步明确该蛋白的生物学功能提供条件。

关键词：长角血蜱巨噬细胞移动抑制因子原核表达互变异构酶活性

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日本鳗鲡巨噬细胞移动抑制因子的基因鉴定及表达分析

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水产学报 2020年第9期44卷 1549-1560页

作者：武亚方黄文树段明珠李文星熊静梁英黄贝集美大学水产学院鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心福建省海洋生物资源开发利用协同创新中心

巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)是一类进化上古老的多功能细胞因子,广泛分布于细菌、植物和动物中。哺乳动物MIF兼具酶催化活性和趋化作用,在机体炎症反应中具有十分重要的作用。为探究MIF在鱼类免... 详细信息

巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)是一类进化上古老的多功能细胞因子,广泛分布于细菌、植物和动物中。哺乳动物MIF兼具酶催化活性和趋化作用,在机体炎症反应中具有十分重要的作用。为探究MIF在鱼类免疫系统中的作用,本实验利用PCR技术克隆获得了日本鳗鲡MIF基因(AjMIF)。预测的AjMIF前体肽含MIF特征性的硫醇蛋白氧化还原酶活性基序Cys57-Ala-Leu-Cys60,以及异构酶活性相关的保守氨基酸残基,如Pro2和Cys81等。荧光定量结果显示,AjMIF在日本鳗鲡不同组织中均有表达,且在肝脏中表达量最高,其次为中肾和肠。脂多糖刺激8 h后,头肾、中肾和鳔中AjMIF表达量显著上调;PolyI:C刺激8 h后,鳃、皮肤和肠中AjMIF表达量显著上调。迟缓爱德华氏菌人工感染8 h后,肠和鳃中AjMIF表达量极显著上调;感染16 h后,鳃组织中MIF表达量显著升高;感染24 h后皮肤和鳃中MIF基因表达量显著上调。此外,本研究构建了AjMIF原核表达质粒,在获得重组蛋白的基础上研究了rAjMIF异构酶活性。结果显示,1 nmol重组蛋白在pH 6.2时异构酶活性为2.6 U,而在pH 8.0,酶活性为36.6 U。本研究结果为进一步解析MIF在鱼类免疫系统中的作用奠定了基础。

关键词：日本鳗鲡巨噬细胞移动抑制因子组织表达互变异构酶活性

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以MIF为靶标的抑制剂药物高通量筛选模型的建立和应用

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生物技术通报 2016年第9期32卷 253-259页

作者：张晶孙瑞秋唐延婷刘祥天津科技大学生物工程学院天津300457 天津国际生物医药联合研究院天津300457

旨在以巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)为靶标,采用紫外-分光光度法建立高通量药物筛选体系。对目的基因进行分子克隆,利用大肠杆菌原核表达系统进行纯化得到高纯度的目的蛋白,利用紫外-分光光度法构建酶活体系,并优化体系条件,建立合适的高... 详细信息

旨在以巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)为靶标,采用紫外-分光光度法建立高通量药物筛选体系。对目的基因进行分子克隆,利用大肠杆菌原核表达系统进行纯化得到高纯度的目的蛋白,利用紫外-分光光度法构建酶活体系,并优化体系条件,建立合适的高通量药物筛选模型,最终从384种小分子中筛选出潜在的酶抑制剂。筛选模型构建成功,并筛选出酶活抑制率较高的小分子2种,测得半数抑制浓度IC50分别为59.07μmol/L、44.12μmol/L。针对MIF蛋白,建立了较理想的高通量药物筛选模型,适用于MIF蛋白酶活抑制剂的筛选,有利于后期的药物研发。

关键词：巨噬细胞迁移抑制因子高通量筛选互变异构酶活性抑制剂

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人源性抗巨噬细胞移动抑制因子单链抗体的筛选及初步鉴定

人源性抗巨噬细胞移动抑制因子单链抗体的筛选及初步鉴定

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作者：倪敏第三军医大学

学位级别：硕士

人巨噬细胞移动抑制因子(Human macrophage migration inhibitory factor,hMIF)是一种重要的免疫调控细胞因子,组成性表达于全身多种组织,垂体前叶细胞、活化的T淋巴细胞、单核巨噬细胞等是其主要来源。hMIF基因编码区为348bp,编码由11... 详细信息

人巨噬细胞移动抑制因子(Human macrophage migration inhibitory factor,hMIF)是一种重要的免疫调控细胞因子,组成性表达于全身多种组织,垂体前叶细胞、活化的T淋巴细胞、单核巨噬细胞等是其主要来源。hMIF基因编码区为348bp,编码由115个氨基酸组成分子量约为12.5KD的非糖基化蛋白。hMIF除细胞因子的基本功能外,还具有类似激素、生长因子、应激反应蛋白及糖基化抑制因子(GIF)等的多重作用,并可调节机体的免疫应答。已有的研究表明,MIF异常高表达是引起脓毒症、糖皮质激素拮抗、类风湿性关节炎、某些肿瘤的重要原因之一。以具有中和作用的MIF单克隆抗体治疗脓毒症小鼠,发现可显著提高其存活率,提示阻断MIF的作用可抑制MIF高表达所引起的相关病理过程。研究还揭示MIF在人鼠之间高度保守,其抗体制备困难;且抗体进入临床应用,人源化问题也是一大障碍。随着抗体库技术的出现,为人源抗体的制备提供了新的有效途径。本研究拟先制备具有生物学活性的重组hMIF再从大容量的全合成的人源性单链抗体库中筛选抗hMIF的单链抗体,并进行初步鉴定;为进一步获得一种具有潜在临床治疗前景的MIF特异性抗体抑制剂奠定基础。　　主要研究内容和结果　　 1.功能性hMIF的制备与鉴定　　 1)构建了PET11b-hMIF,PET32a-Trx-MIF重组质粒,酶切测序正确后,转化BL21,IPTG诱导表达后,与预期的结果一致,SDS-PAGE显示PET11b-hMIF在12.5KD,而PET32a-Trx-MIF在30KD处出现了一条表达条带,两者的表达量约占菌体总蛋白30％,且为可溶性表达。　　 2)应用SP Sepharose FF阳离子交换层析和Hitrap26/60 sephacryl S-300分子筛纯化诱导表达的hMIF;应用His亲和层析柱纯化诱导表达的Trx-MIF。SDS-PAGE灰度扫描显示hMIF纯度为95％,Trx-MIF纯度为85％。Western Blot鉴定证明hMIF和Trx-MIF均能与特异性的MIF抗体结合。　　 3)用L-3,4-二羟基苯丙氨酸甲酯作为底物对hMIF,Trx-MIF互变异构酶的活性进行检测。hMIF具有明显的互变异构酶的活性(0.49±0.01),Trx-MIF(0.01±0.01)与无关阴性对照PreS1(0.02±0.02)无互变异构酶的活性,结果具有显著性差异(P＜0.01)。　　 4)通过hMIF,Trx-MIF刺激RAW264.7细胞释放NO,TNF-α,IL-6检测其细胞因子活性。结果显示hMIF在体外能剂量依赖性地刺激RAW264.7细胞释放NO和TNF-α,IL-6,而Trx-MIF不能刺激这些炎性细胞因子的释放。　　 5)盲肠结扎穿孔术(CLP)小鼠在术后12小时,分别腹腔注射5mg/kg重组hMIF和Trx-MIF,对比观察对生存率的影响。MIF组较CLP对照组生存率明显降低(p＜0.05),Trx-MIF组生存率与CLP对照组相比无明显变化。　　 2.人源性MIF单链抗体的筛选及初步鉴定　　 1)用纯化的有生物学活性的hMIF作为抗原对全合成人源性单链抗体库(库容为1.35×1010)进行了3轮筛选,3轮抗原包被的浓度依次为10μg/ml,5μg/ml,2.5μg/ml。　　 2)从第3轮筛选后的平板上,随机挑取共24个单菌落制备噬菌体抗体,经Phage-ELISA检测有9株与hMIF结合呈阳性,取其中4株强阳性的克隆(OD值＞2.0),通过噬菌体展示与hMIF,Trx-MIF,B型脑钠肽(Trx-BNP),降钙素基因相关肽(CGRP)进行结合特异性的检测。结果显示这4株均能与hMIF,TrxMIF特异性结合,而与无关Trx-BNP,CGRP无反应。　　 3)将这4株阳性克隆的单克隆细菌提取质粒,经SfiⅠ和NotⅠ双酶切,结果经1％凝胶电泳可见酶切产物大小约为750bp,与单链抗体的大小一致。用Vector NTI软件,以及NCBI的Igblast数据库,比对发现A2-1与B2-3共用一套框架系统,基因属于λ1H3家族;C14与M2H7共用一套框架系统,基因属于λ3H3家族。同时发现B2-1,C1-4,M2H7轻链CDR3区中出现了TAG琥珀终止密码子,由于我们的噬菌体展示载体上它能够20％通读为Q(CAG),若要进行其他系统表达,TAG琥珀终止子就要进行突变改造。利用重叠延伸PCR对B2-3,C1-4,M2H7三株scFv基因中的TAG终止子进行了突变,并把其基因克隆进原核表达载体PTIG-rrx,测序结果显示三株的TAG都成功突变为CAG。　　 4)选取序列中无终止子的A2-1噬粒,经SfiⅠ和NotⅠ双酶切,克隆

关键词：巨噬细胞移动抑制因子脓毒症互变异构酶活性阻断剂噬菌体抗体库单链抗体

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ISO-1对大肠癌细胞侵袭的影响

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广东医学 2008年第5期29卷 734-737页

作者：陈萌何兴祥刘成勇苏杭郭海波广州医学院第二附属医院消化科广州510260 广东药学院临床医学院内科教研室广州510330 广州医学院第二附属医院临床分子医学实验中心广州510260

目的研究选择性MIF互变异构酶活性抑制剂ISO-1对人大肠癌细胞侵袭的影响并探讨其可能的机制。方法实验组用0．01-100μmol／L的ISO-1作用于大肠癌细胞Lovo，对照组为相应浓度的DMSO处理；MIF互变异构酶活性通过L-多巴色素甲酯测定；微... 详细信息

目的研究选择性MIF互变异构酶活性抑制剂ISO-1对人大肠癌细胞侵袭的影响并探讨其可能的机制。方法实验组用0．01-100μmol／L的ISO-1作用于大肠癌细胞Lovo，对照组为相应浓度的DMSO处理；MIF互变异构酶活性通过L-多巴色素甲酯测定；微孔迁移法检测ISO-1对Lovo细胞体外侵袭的影响；ELISA法测定ISO-1作用后培养上清中MIF蛋白水平；逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测ISO-1对Lovo细胞MMP-9和IL-8 mRNA表达的影响。结果较高浓度ISO-1（10-100μmol／L）均能明显抑制MIF互变异构酶活性，但不影响细胞外分泌MIF蛋白水平；100μmol／L ISO-1作用24h Lovo细胞穿透聚碳酸酯膜显著减少，与对照组比较差异有显著性（153±13vs204±10，P〈0．05）；100μmol／L ISO-1作用24h Lovo细胞表达MMP-9和IL-8 mRNA水平显著降低，与对照组比较差异有显著性（MMP-9 mRNA：0．5187±0．072vs0．6757±0．026．P〈0．05；IL-8 mRNA：0．1541±0．019vs0．2081±0．030，P〈0．05）。结论选择性MIF活性抑制剂ISO-1降低了Lovo细胞的侵袭，其可能机制为ISO-1抑制了MIF互变异构酶活性并下调MMP-9和IL-8的表达。

关键词：大肠肿瘤巨噬细胞移动抑制因子互变异构酶活性 ISO-1 RT-PCR

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ISO-1对大肠癌细胞增殖的影响

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湖北民族学院学报（医学版） 2008年第2期25卷 1-5页

作者：何兴祥陈萌刘成勇郭海波彭侠彪全华斌广东药学院临床医学院内科学教研室广东广州510330 广州医学院第二附属医院广东广州510260 中山市人民医院消化科广东中山528403

目的研究选择性MIF互变异构酶活性抑制剂ISO-1对大肠癌细胞增殖的影响并探讨其可能机制。方法不同浓度的ISO-1（0.01-100μmol/L）作用于人大肠癌细胞Lovo、SW116和鼠大肠癌细胞CT26,对照组以相应浓度的DMSO处理。MTT法观察ISO-1对大肠... 详细信息

目的研究选择性MIF互变异构酶活性抑制剂ISO-1对大肠癌细胞增殖的影响并探讨其可能机制。方法不同浓度的ISO-1（0.01-100μmol/L）作用于人大肠癌细胞Lovo、SW116和鼠大肠癌细胞CT26,对照组以相应浓度的DMSO处理。MTT法观察ISO-1对大肠癌细胞增殖的影响。通过L-多巴色素甲酯测定MIF互变异构酶活性。ELISA法测定ISO-1作用后大肠癌细胞MIF蛋白水平。RT-PCR检测ISO-1作用后大肠癌细胞IL-8 mR-NA的表达。结果ISO-1抑制了Lovo细胞的增殖,且呈剂量和时间依赖性;ISO-1同样抑制了SW116（F=800.694,P〈0.01）和CT26细胞的增殖（F=879.544,P〈0.01）。ISO-1抑制了Lovo和SW116细胞内MIF互变异构酶活性,并且与抑制大肠癌细胞增殖程度呈正相关性（Lovo：r=0.54,P=0.005;SW116：r=0.683,P〈0.01）;ISO-1降低了Lovo和SW116细胞IL-8 mRNA表达水平（Lovo：0.1541±0.0.019 vs.0.2081±0.030,P〈0.05;SW116：0.1509±0.017vs.0.2354±0.01.P〈0.05）。结论ISO-1不仅抑制人大肠癌细胞Lovo和SW116的增殖,而且也抑制鼠大肠癌细胞CT26的增殖,其可能机制为ISO-1抑制了MIF的互变异构酶活性并下调IL-8的表达。

关键词：大肠癌巨噬细胞移动抑制因子互变异构酶活性 ISO-1 RT-PCR

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