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细胞与分子免疫学杂志 2006年第6期22卷 801-803页

作者：任倩刘拥军徐斌韩之波卢士红马凤霞陈钟韩忠朝中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所实验血液学国家重点实验室国家干细胞工程研究中心天津300020

目的:表达人促血液血管细胞生成素(hemangiopoi-etin,HAPO)蛋白并制备兔抗HAPO抗体。方法:利用硫氧还原蛋白TrxA融合表达载体(pET32c),表达可溶性HAPO。表达的HAPO融合蛋白经亲和层析快速纯化,并通过Westernblot进行鉴定。以纯化的人HAP... 详细信息

目的:表达人促血液血管细胞生成素(hemangiopoi-etin,HAPO)蛋白并制备兔抗HAPO抗体。方法:利用硫氧还原蛋白TrxA融合表达载体(pET32c),表达可溶性HAPO。表达的HAPO融合蛋白经亲和层析快速纯化,并通过Westernblot进行鉴定。以纯化的人HAPO免疫新西兰大白兔,制备抗体并测定其效价。结果:获得高效表达并纯化的HAPO蛋白。制备的兔抗人HAPO抗体的免疫双扩散的效价为1∶8。结论:建立了HAPO基因的原核表达载体和快速纯化体系并制备出兔抗HAPO的抗体,为研制检测HAPO的ELISA试剂盒奠定了基础。

关键词：人促血液血管细胞生成素 pET32C 抗体制备兔

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人促血液血管细胞生成素对内皮细胞粘附功能的影响

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中国医学科学院学报 2006年第3期28卷 364-367页

作者：王晓静刘拥军卢士红梁琳慧王晗韩忠朝中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所实验血液学国家重点实验室细胞产品国家工程研究所泰达生命科技中心天津300020

目的研究人促血液血管细胞生成素(HAPO)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)粘附功能的影响。方法采用结晶紫粘附实验、流式细胞术和半定量RT-PCR方法检测HUVEC的粘附性和粘附分子CD54、CD102、CD106、CD31、CD62E和CD62P的表达。结果HAPO以剂量... 详细信息

目的研究人促血液血管细胞生成素(HAPO)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)粘附功能的影响。方法采用结晶紫粘附实验、流式细胞术和半定量RT-PCR方法检测HUVEC的粘附性和粘附分子CD54、CD102、CD106、CD31、CD62E和CD62P的表达。结果HAPO以剂量依赖性方式增加HUVEC的总粘附性。HAPO能显著促进HUVEC表面粘附分子CD106和CD62E表达,并呈时间依赖性。HAPO作用HUVEC6h后,CD106和CD62E的阳性率分别为(80·83±2·22)%和(22·77±2·59)%,是各自对照组的2·10倍和5·84倍,且转录水平和蛋白质水平一致。CD106和CD62E的最高转录水平分别为对照组的1·86倍和6·16倍。结论HAPO可能对造血干/祖细胞归巢有一定促进作用。

关键词：人促血液血管细胞生成素粘附分子内皮细胞

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人促血液血管细胞生成素功能性受体的探索和靶向粘附斑激酶（FAK）的RNA干扰研究

人促血液血管细胞生成素功能性受体的探索和靶向粘附斑激酶（FAK...

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作者：梁琳慧北京协和医学院(清华大学医学部)&中国医学科学院

学位级别：博士

第一部分：人促血液血管细胞生成素的功能性受体nucleolin的鉴别人促血液血管细胞生成素(HAPO)是实验室首先报道的一种对血液血管干细胞有促增殖作用的细胞因子。对HAPO的生物学功能研究发现，HAPO体外可以促进成人骨髓细胞的增殖... 详细信息

第一部分：人促血液血管细胞生成素的功能性受体nucleolin的鉴别人促血液血管细胞生成素(HAPO)是实验室首先报道的一种对血液血管干细胞有促增殖作用的细胞因子。对HAPO的生物学功能研究发现，HAPO体外可以促进成人骨髓细胞的增殖。对胎儿骨髓的培养中，我们发现HAPO可以促进骨髓的造血细胞(悬浮细胞)和基质细胞(贴壁细胞)的增殖，因而推测HAPO主要作用于早期的造血干细胞和内皮细胞。体外实验中还发现HAPO可以通过激活PI3K-Akt信号传导途径抑制白血病细胞系MO7e的凋亡。此外，稳定转染HAPO的小鼠骨髓基质细胞体外具有造血支持作用。虽然对HAPO的生物学功能和信号通路有了一定的理解，但是HAPO的受体还未知。在本研究中，在体外实验中发现HAPO可以促进人脐静脉来源的细胞系ECV304的粘附和迁移，并呈现剂量的依赖性。由于其他已经研究的细胞或者因为技术上的难度不容易获得或者需要依赖细胞因子生长从而代价昂贵，因此选择ECV304细胞作为研究HAPO受体的靶细胞。通过生物素标记的HAPO与ECV304细胞孵育发现HAPO确实可以结合在ECV304细胞上。进一步利用免疫共沉淀的方法发现HAPO组较对照组多了一条110KD的蛋白带，将该条带送到国家生物分析中心进行质谱测序，通过和基因库里的序列比较发现该蛋白是核仁蛋白(nucleolin)。由于核仁蛋白是主要表达于核内的蛋白质，所以首先检测了核仁蛋白在ECV304细胞膜上的表达。分别利用流式细胞术、提取膜蛋白的方法检测蛋白的表达，最终发现核仁蛋白确实表达在ECV304细胞的细胞膜上，这与已经报道的文献吻合。进一步实验中，利用蛋白质overlay的方法检测到在物理水平上HAPO与核仁蛋白确实可以互相结合。活细胞共定位实验进一步证明了HAPO在活细胞的水平上也可以与核仁蛋白相结合。为了证明核仁蛋白是HAPO的功能性受体，利用核仁蛋白的抗体进行了阻断实验，发现在有100倍摩尔浓度的核仁蛋白抗体存在的情况下，HAPO对ECV304细胞的促粘附作用受到了抑制，因此可以确定表达在细胞表面的核仁蛋白是HAPO的功能性受体。为了进一步确认这一点，构建了pcDNA3.1-nucleolin载体，并将其转染到细胞表面核仁蛋白阴性的人胚肾上皮细胞HEK293中，转染后16小时，利用流式细胞术的方法检测细胞表面的核仁蛋白的表达，发现16小时后293细胞表面确实表达了核仁蛋白。利用转染后的细胞进行迁移实验，发现与未转染细胞以及转染对照质粒的细胞相比，HAPO大大促进转染细胞的迁移。这些结果进一步说明了核仁蛋白是HAPO的功能性受体。总之，鉴定了核仁蛋白是HAPO的功能性受体，并发现它与HAPO的一些生物学功能相关，这值得进行进一步的研究以加深对HAPO生物学功能和作用机制的理解。第二部分FAK在人白血病细胞系k562中的表达与细胞的增殖、分化细胞周期、药物敏感性的关系研究背景：粘附集中点激酶(FAK)是一个粘附集中点激酶(FAK)是一个非受体型的酪氨酸激酶，定位在细胞与细胞外基质接触的地方，即粘附集中点(focaladhesion)。FAK可以协调来自整合素(integrin)、细胞因子、生长因子受体以及原癌基因的信号，从而调节细胞的很多活动，如：增殖、凋亡、迁移、细胞周期等。FAK在多种类型的肿瘤细胞中过表达或持续活化，并与肿瘤细胞的运动、浸润、增殖的增加有关。虽然FAK在实体瘤中的研究进展已经很多，但是关于FAK在正常骨髓细胞和白血病细胞中的表达和作用的研究还十分少。目的：利用Bcr-Abl阳性的慢粒细胞系k562，通过RNA干扰的方法来研究FAK对慢粒白血病细胞的功能的影响。方法：合成针对FAK序列的寡核苷酸，退火后，经酶切连接入可以表达短发夹RNA的pGE-1载体，将载体转染入人慢粒白血病细胞系k562中，经G418筛选，得到稳定转染载体的细胞株，经过RT-PCR、westernblot两种方法鉴定干扰的效率。随后采用MTT染色检测干扰FAK表达后，k562细胞的增殖情况。采用PI染色法，通过流氏检测和软件计算来检测干扰后细胞周期的变化。转染干扰质粒和对照质粒的细胞分别加入化疗药物阿糖胞苷孵育48小时，然后分别利用annexinv/PI染色法和联苯胺染色法来检测细胞对药物的敏感性以及分化的情况。结论：所选取的片段可以有效地干扰k562细胞中FAK的表达，干扰FAK表达后，细胞的增殖被抑制、细胞周期被推迟、对药物的敏感性增加，细胞的分化增多，结果显示，FAK有可能成为治疗慢粒白血病的一个新的靶目标。

关键词：人促血液血管细胞生成素核仁蛋白血管新生白血病肿瘤细胞 RNA干扰

来源：评论

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人促血液血管细胞生成素的高效表达和快速纯化

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实用心脑肺血管病杂志 2005年第6期13卷 321-325页

作者：任倩刘拥军徐斌韩之波卢士红马凤霞韩忠朝中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所实验血液学国家重点实验室天津300020

目的构建人促血液血管细胞生成素(HAPO)的表达载体,获得纯化的HAPO蛋白并研究其生物学功能。方法通过PCR方法扩增人HAPO基因,克隆于不同的原核表达载体,ITPG诱导融合蛋白表达。NTA层析柱纯化融合蛋白,再经肠激酶裂解融合蛋白,阳离子交... 详细信息

目的构建人促血液血管细胞生成素(HAPO)的表达载体,获得纯化的HAPO蛋白并研究其生物学功能。方法通过PCR方法扩增人HAPO基因,克隆于不同的原核表达载体,ITPG诱导融合蛋白表达。NTA层析柱纯化融合蛋白,再经肠激酶裂解融合蛋白,阳离子交换层析纯化,得到纯化的重组蛋白。用培养的MO7e和ECV-304细胞检测蛋白活性。结果HAPO可在pET32C中,获得稳定高效的可溶性表达。在E coli BL21(DE3)中,HAPO表达量可占菌体总蛋白的10%左右。重组蛋白80%是以可溶性蛋白形式存在。NTA层析柱纯化得到的HAPO融合蛋白,再经肠激酶裂解,阳离子交换层析纯化,得到90%以上纯度的重组HAPO蛋白,并且具有良好的生物学活性。结论得到具有90%以上纯度的重组HAPO蛋白,而且,对MO7e和ECV-304细胞具有促增殖的作用。我们获得了纯化的人重组HAPO蛋白,为进一步研究其功能及临床应用打下基础。

关键词：人促血液血管细胞生成素 pET32C 融合蛋白纯化层析纯化细胞生成素高效表达 ECV-304细胞血管血液

来源：评论

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人促血液血管细胞生成素（Haemangiopoietin, HAPO）单克隆抗体的制备、鉴定及应用

人促血液血管细胞生成素（Haemangiopoietin, HAPO）单克隆抗体的...

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作者：秦迎松中国协和医科大学

学位级别：博士

人促血液血管细胞生成素（Hemangiopoietin，HAPO）是我实验室首次从再障病人尿中提取的一种新的蛋白因子。重组的HAPO具有明显的促进造血和放化疗保护作用。为了更好地进行HAPO的基础理论研究，我们通过杂交瘤方法制备了抗HAPO的单克... 详细信息

人促血液血管细胞生成素（Hemangiopoietin，HAPO）是我实验室首次从再障病人尿中提取的一种新的蛋白因子。重组的HAPO具有明显的促进造血和放化疗保护作用。为了更好地进行HAPO的基础理论研究，我们通过杂交瘤方法制备了抗HAPO的单克隆抗体，组建了检测HAPO含量的ELISA试剂盒，并通过免疫印记对人血清及胎肝中的天然HAPO进行了初步鉴定。所筛选的单抗中，三株为IgG1，二株为IgM，其轻链均为κ。三株IgG1的相对亲和力分别为3.06×10～9M-1，6.07×10～8M-1和1.71×1010M-1，对抗原表位的识别均为构象非依赖性且均可用于冰冻及石蜡切片的免疫组化研究。血清及胎肝中天然HAPO的SDS-PAGE和western blot结果表明，二者中阳性带的位置均接近重组的HAPO。ELISA检测结果表明：正常成人血清中HAPO的含量为57.27±17.01ng／ml，重再患者血清中HAPO的含量为44.05±32.09ng／ml（P＜0.05），慢再为79.32±55.67ng／ml（P＜0.01），特发性血小板减少性紫癜为77.10±34.41ng／ml（P＜0.01），淋巴细胞白血病为60.73±36.81ng／ml（P＞0.05），非淋巴细胞白血病为69.30±40.87ng／ml（P＜0.01），骨髓移植患者为42.85±30.00ng／ml（P＜0.05），除淋巴细胞白血病外，均与正常水平有显著性差异。在非淋巴细胞白血病患者中，慢性髓细胞性白血病为65.97±35.20ng／ml，急性髓细胞性白血病为70.59±43.01ng／ml，其中M2为66.82±32.85ng／ml，M3为84.33±62.26ng／ml，M4为64.58±29.27ng／ml，M5为64.93±29.96ng／ml，

关键词：人促血液血管细胞生成素单克隆抗体酶联免疫吸附分析免疫印记

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pET22b(+)-HAPO原核表达载体的构建及鉴定

pET22b(+)-HAPO原核表达载体的构建及鉴定

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第十一届中国细胞生物学学术大会暨2009西安细胞生物学国际会议

作者：胡蓉华李彬庞天翔中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所实验血液学国家重点实验室

目的:人促血液血管细胞生成素(HAPO)是对巨核细胞增殖有促进作用的蛋白,研究表明HAPO能刺激人骨髓细胞和血管内皮细胞增殖,在细胞抗凋亡研究中证实,其参与PI3K-Akt信号传导途径。构建含HAPO基因片段的pET22b(+)表达载体,得到可溶性表达

关键词：人促血液血管细胞生成素可溶性表达人脐静脉内皮细胞

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人促血液血管细胞生成素及其制造方法

人促血液血管细胞生成素及其制造方法

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该发明专利涉及一种新的对造血干袓细胞，以及血管内皮细胞的生长有促进作用的刺激因子，即人促血液血管生成素(HAPO)。其特征是根据已知序列，设计多对引物进行PCR扩增获得一系列基因片段，通过双酶切位点，克隆至原核表达载体，其中87... 详细信息

标准号: 0500550110

该发明专利涉及一种新的对造血干袓细胞，以及血管内皮细胞的生长有促进作用的刺激因子，即人促血液血管生成素(HAPO)。其特征是根据已知序列，设计多对引物进行PCR扩增获得一系列基因片段，通过双酶切位点，克隆至原核表达载体，其中879bp和558bp两片段在工程菌中表达，经酶切得到分子量为31.8KD和20.1KD的HAPO(分别为292和186氨基酸)，经纯化后免疫家兔，获得特异性抗体，为临床诊治造血及血管疾病提供了工具。

关键词：人促血液血管细胞生成素生产工艺血液系统药物造血系统药物

来源：评论

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