检索结果-内蒙古大学图书馆

中国药理学与毒理学杂志 2018年第3期32卷 161-167页

作者：宋征马璟中国医药工业研究总院国家上海新药安全评价研究中心上海益诺思生物技术有限公司上海201203

近年来,肿瘤免疫调控机制逐渐清晰,随着嵌合抗原受体T细胞免疫疗法获美国FDA批准上市,揭开了肿瘤免疫治疗的新篇章。在肿瘤免疫治疗药物临床前评价过程中,传统的免疫缺陷动物模型存在较多的限制和缺陷,无法模拟人体内肿瘤微环境,也无法... 详细信息

近年来,肿瘤免疫调控机制逐渐清晰,随着嵌合抗原受体T细胞免疫疗法获美国FDA批准上市,揭开了肿瘤免疫治疗的新篇章。在肿瘤免疫治疗药物临床前评价过程中,传统的免疫缺陷动物模型存在较多的限制和缺陷,无法模拟人体内肿瘤微环境,也无法针对免疫治疗药物的作用机制反映出药物的靶点毒性。近年来,由于基因编辑技术及干细胞培养技术的不断进步,实验动物的人源化技术取得了巨大的进步。本文总结了目前可用于肿瘤免疫治疗药物研究的3种人源化动物模型(重建人免疫系统动物模型、重建人免疫系统+人源肿瘤组织异种移植动物模型和基因修饰的人源化动物模型)的特点和应用范围,希望为研究者在肿瘤免疫治疗药物临床前开发过程中选择合适的动物模型提供参考。

关键词：人源化动物模型肿瘤免疫治疗药物评价临床前

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人源化动物模型的研究进展

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吉林医药学院学报 2021年第1期42卷 42-44页

作者：胡锴克徐冶吉林医药学院肿瘤靶向治疗与转化医学实验室吉林吉林132013

实验动物为医学研究不断提供新模型、新技术、新方法。而伴随着实验技术与仪器的发展,原本孤立的学科也交叉融合,基因研究在动物中的实践诞生了基因工程动物。为了更好地模拟人类的性状,产生了人源化动物模型。本文旨在介绍当前几种主... 详细信息

实验动物为医学研究不断提供新模型、新技术、新方法。而伴随着实验技术与仪器的发展,原本孤立的学科也交叉融合,基因研究在动物中的实践诞生了基因工程动物。为了更好地模拟人类的性状,产生了人源化动物模型。本文旨在介绍当前几种主流的基因工程动物,以及人源化动物模型的研究进展。

关键词：基因工程动物人源化动物模型研究进展

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人源化动物模型在肿瘤免疫治疗药物临床前

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中国保健营养 2019年第26期29卷 145页

作者：雍金贵通用生物系统(安徽)有限公司 239000

目前,随着医药科技的不断进步,关于肿瘤治疗方面的技术也不断成熟,免疫调控机制在这个背景下也被逐渐梳理清楚,嵌合抗原受体 T 细胞治疗方法更是为肿瘤的免疫治疗开辟了一条新道路.在肿瘤免疫治疗评价体系中,传统的免疫缺陷动物模型,在... 详细信息

目前,随着医药科技的不断进步,关于肿瘤治疗方面的技术也不断成熟,免疫调控机制在这个背景下也被逐渐梳理清楚,嵌合抗原受体 T 细胞治疗方法更是为肿瘤的免疫治疗开辟了一条新道路.在肿瘤免疫治疗评价体系中,传统的免疫缺陷动物模型,在模拟环境下,存在着诸多限制和缺陷,无法与人类体内肿瘤的生存环境相匹配,因此不能真实反映治疗的机制与靶向毒性.但是这种情况随着科技的进步得到了改善.本文就实验动物人源化技术进行了详细的剖析,着重描述了这种技术的特点与应用范围,希望为相关科研工作者在肿瘤免疫研究中提供适合的动物模型以供真实的反应药物的作用机理.

关键词：人源化动物模型肿瘤免疫治疗药物评价

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基于灵长类特有基因BTN3A2人源化小鼠动物模型的建立和应用

基于灵长类特有基因BTN3A2人源化小鼠动物模型的建立和应用

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作者：唐杰中国科学院大学

学位级别：硕士

中枢神经系统发育是一严谨有序而又复杂的过程，这些发育调控过程的异常或紊乱会导致神经发育疾病，包括精神分裂症、自闭症、智力障碍、原发性癫痫等神经精神疾病。在进化过程中，人类大脑无论是形态还是结构等方面部具有其独特性，被... 详细信息

中枢神经系统发育是一严谨有序而又复杂的过程，这些发育调控过程的异常或紊乱会导致神经发育疾病，包括精神分裂症、自闭症、智力障碍、原发性癫痫等神经精神疾病。在进化过程中，人类大脑无论是形态还是结构等方面部具有其独特性，被认为是人类高级认知功能获得的物质基础，与此同时，人类也增加了罹患神经精神疾病和神经退行性疾病的风险，这些疾病通常也被认为是人类所特有。因此，认识和理解人类大脑进化与功能发挥，以及与神经疾病发生的内在联系，是神经生物学领域至关重要的科学问题。　　比较基因组学研究发现，人类上述独特表型的获得与其染色质序列的改变密切相关，如基因编码区序列改变、基因复制或截断导致的新基因产生、顺时调控元件的突变、新调控元件的获得等。宏观上，人类大脑形态结构在进化过程中发生显著性变化，关于其机制与大脑功能的研究，特别是灵长类特有基因，是神经生物学领域的热点。在微观层面，人类与小鼠的神经突触在结构和基本调控方面较为保守，但由于人类大脑细胞种类和数量有所增加，其相互之间的突触连接密度和调控效率有所差异。然而，关于灵长类特有基因在其中的遗传进化调控机制知之甚少。在前期工作中，鉴定出BTN3A2是与人类精神分裂症密切相关的灵长类特有基因，并且发现其参与突触传递的功能调控，但是其在大脑进化发育和功能调控中的作用和机制不清楚。另外，关于灵长类特有基因的研究大都基于体外或离体基因操作等手段，缺乏整体动物水平的行为学研究。　　在本论文中，将一个loxp-stop-loxp元件放在人类基因BTN3A2前，并利用CRISPR/Cas9技术将整个元件定向插入小鼠的H11通用位点，从而得到针对该灵长类特有基因的条件性基因敲入小鼠。待其成年后，使之与Nestin-Cre工具鼠杂交以获得针对该基因的人源化小鼠模型Nestin-Cre+/-::BTN3A2+/-，从而使得灵长类特有基因BTN3A2特异性在中枢神经系统表达。　　进一步，首先通过Western blotting检测和冰冻切片免疫荧光确定在该人源化小鼠的大脑尤其是在皮层中，灵长类特有基因BTN3A2特异性高表达。结合突触后致密体（postsynaptic density，PSD）特异性分离和Western blotting检测，发现BTN3A2分子在PSD中有定位分布，这与之前揭示的其参与突触功能调节相一致。其次，发现人源化小鼠相比野生型小鼠体重降低但大脑重量显著增加，提示BTN3A2分子的异位表达会对小鼠大脑发育造成一定影响。进一步利用一系列神经行为学实验（包括抑郁水平、焦虑水平和工作记忆）来探究该灵长类特有基因对大脑功能调控的影响。强迫游泳和糖水偏好是经典的检测小鼠抑郁水平的行为范式，发现该人源化小鼠在这两项行为学测试中与野生型小鼠相比没有明显差异，表明该小鼠模型没有呈现抑郁症相关症状。O迷宫、开放场和黑白箱实验通常用于检测小鼠焦虑水平的行为范式，与野生型对照相比，虽然该人源化小鼠在O迷宫和开放场实验中并没有表现出显著差异，但是在黑白箱实验中，人源化小鼠在白箱中的停留时间显著性增加，表明该人源化小鼠相对于野生型小鼠表现出更高的探索性行为，提示灵长类特有基因BTN3A2在小鼠中枢神经系统特异性表达具有一定的抗焦虑效果。在Y迷宫实验测试中，该人源化小鼠在新奇臂中停留时间显著低于野生型，而在熟悉臂中停留时间显著增加，表明其工作记忆受到损伤。　　综上，在此项研究中，建立了基于灵长类特有基因BTN3A2的人源化小鼠动物模型，神经行为学表明该人源化小鼠模型探索性行为增加，类焦虑行为减少，工作记忆受损，而这些都是双相情感障碍相关症状。因此，所构建的灵长类特有基因BTN3A2人源化小鼠可能作为一个新的假定性双相情感障碍小鼠动物模型，并为进一步深入研究大脑进化发育与神经发育疾病的内在联系提供很好的契机。

关键词：中枢神经系统发育机制人源化动物模型 BTN3A2基因

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血脑屏障动物模型的研究进展

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海军军医大学学报 2022年第3期43卷 314-319页

作者：王晓航陈洋戚中田朱勇喆海军军医大学(第二军医大学)海军医学系生物医学防护教研室上海200433 海军军医大学(第二军医大学)基础医学院上海200433

血脑屏障(BBB)是中枢神经血管单元的重要结构,通过紧密连接及转运蛋白阻止神经毒性物质与病原体入侵,维护中枢神经系统内环境稳定。相较于体外模型,理想的动物模型可更好地模拟BBB生理机制,在血流动力学、屏障完整性、信号转导和物质交... 详细信息

血脑屏障(BBB)是中枢神经血管单元的重要结构,通过紧密连接及转运蛋白阻止神经毒性物质与病原体入侵,维护中枢神经系统内环境稳定。相较于体外模型,理想的动物模型可更好地模拟BBB生理机制,在血流动力学、屏障完整性、信号转导和物质交换等研究中起重要作用。在BBB动物模型评价方法的研究中,减少创伤、动态评估成为评价方法的重要需求;BBB动物模型的构建由经典模型动物(果蝇、非人灵长类动物)转变为转基因、人源化动物(斑马鱼、小鼠),说明在新技术发展下,与人类蛋白表达相近、适合高通量筛选的BBB动物模型是该领域的主流发展趋势。

关键词：血脑屏障动物模型评价方法转基因动物模型人源化动物模型

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国内外实验动物模型概览

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科技导报 2017年第24期35卷 27-31页

作者：张连峰崔韶中国医学科学院医学实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心卫生部人类疾病比较医学重点实验室北京100021

实验动物主要分为3类,即常规实验动物,自发突变实验动物和基因工程实验动物。实验动物模型对生命科学、医学等相关学科的发展具有重要的支撑作用。中国实验动物科学起步较晚,但随着国家科研经费投入的增加,中国逐步形成了自己的研发体... 详细信息

实验动物主要分为3类,即常规实验动物,自发突变实验动物和基因工程实验动物。实验动物模型对生命科学、医学等相关学科的发展具有重要的支撑作用。中国实验动物科学起步较晚,但随着国家科研经费投入的增加,中国逐步形成了自己的研发体系和实验动物资源,在特定领域有超过美日的趋势。本文概括介绍了国内外常见实验动物模型,旨在为促进中国实验动物学科的发展提供参考。

关键词：实验动物基因工程动物疾病动物模型人源化动物模型

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安全免疫耐受型人胚胎干细胞的建立及其潜在应用

安全免疫耐受型人胚胎干细胞的建立及其潜在应用

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作者：何景进南方医科大学

学位级别：博士

人胚胎干细胞(Human Embryonic Stem Cells,hESCs)拥有无限的自我复制与更新能力且能保持其分化成任何一种体细胞的多能性,在再生医学中具有广阔的应用前景。宿主对来源于hESCs的移植物的免疫排斥是阻碍其发展的关键性瓶颈之一。另一方... 详细信息

人胚胎干细胞(Human Embryonic Stem Cells,hESCs)拥有无限的自我复制与更新能力且能保持其分化成任何一种体细胞的多能性,在再生医学中具有广阔的应用前景。宿主对来源于hESCs的移植物的免疫排斥是阻碍其发展的关键性瓶颈之一。另一方面,当前抑制宿主免疫排斥的各种策略均会不可避免地增加hESCs及其移植物的癌变风险。为了解决上述问题,本论文的研究目的是建立一株耐受宿主免疫排斥、癌变风险安全可控的人胚胎干细胞株,并初步探讨这种胚胎细胞潜在应用于心梗治疗中的可行性。我们利用细菌人工染色体同源重组基因编辑技术在hESCs的HPRT1位点上敲入CTLA4-Ig、PD-L1和TK这3个基因,建立了 hESCs-CPTK。CTLA4-Ig和PD-L1的共同表达能诱导hESCs-CPTK及其衍生而来的细胞耐受免疫排斥,自杀基因TK的表达能使得hESCs-CPTK及其衍生而来的细胞可以在体外或体内被美国FDA批准的基因治疗药物更昔洛韦(Ganciclovir,GCV)所清除。我们在一种具有人免疫系统的小鼠模型上验证了 hESCs-CPTK的相关功能。流式细胞术和免疫荧光染色法的结果显示hESCs-CPTK在人源化小鼠体内形成的畸胎瘤的T淋巴细胞浸润率显著低于野生型hESCs形成的畸胎瘤,提示hESCs能耐受人源化小鼠的免疫排斥;小鼠体内来源于hESCs-CPTK的畸胎瘤能被腹腔注射的GCV所消除,表明hESCs-CPTK癌变风险安全可控。荧光定量PCR和流式细胞术结果表明hESCs-CPTK具有胚胎干细胞的多能性,且能在体外被诱导分化生成心肌细胞。免疫荧光染色法验证了人源化小鼠体内来源于hESCs-CPTK的心肌细胞耐受人源化小鼠免疫排斥的同时能通过腹腔注射GCV被消除。相对于小鼠,大鼠具有更大的体型,在心跳频率上与人类更接近,更适合应用于心梗研究。因此,我们建立了具有人免疫系统的大鼠模型、严重免疫缺陷的大鼠心梗模型及成功在心梗大鼠模型的心脏中移植了 hESCs分化而来的心肌细胞,为后续进一步研究hESCs-CPTK对心梗的治疗作用奠定了基础。本论文通过基因编辑技术,在诱导hESCs免疫耐受的同时降低了 hESCs的癌变风险,并在具有人免疫系统的人源化小鼠上验证了这两种作用。hESCs-CPTK具有分化成为心肌细胞的能力,可以作为细胞来源潜在应用于心梗治疗。我们建立的相关大鼠模型将促进hESCs-CPTK治疗心梗的进一步研究发展。

关键词：人胚胎干细胞人源化动物模型免疫耐受自杀基因心梗

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具有高水平人造血免疫细胞长期重建的人源化猪模型的构建和评价研究

具有高水平人造血免疫细胞长期重建的人源化猪模型的构建和评价研...

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作者：邹俊吉林大学

学位级别：博士

研究背景与目的:动物模型在现代生物医学的发展过程中发挥着不可替代的作用。然而,回顾性研究显示,由于动物与人类的免疫及代谢差异,在动物实验有效的药物,超过90%在临床试验失败。因此,科学家们在过去的30年里开发了新的动物模型,以更... 详细信息

研究背景与目的: 动物模型在现代生物医学的发展过程中发挥着不可替代的作用。然而,回顾性研究显示,由于动物与人类的免疫及代谢差异,在动物实验有效的药物,超过90%在临床试验失败。因此,科学家们在过去的30年里开发了新的动物模型,以更好地反映人类的生理和病理特征。其中,人源化猪模型是最有前途的,尽管它仍处于探索阶段。然而,人源化小鼠模型已被成功重建并广泛应用于生物医学研究。人源化小鼠模型构建的基础是使用合适的免疫缺陷小鼠。免疫缺陷小鼠是评价正常人类造血干/祖细胞功能和研究异常人类造血细胞(如白血病细胞)特征的最佳动物模型。人造血干/祖细胞移植到NOD/SCID Il2rg-/-等免疫缺陷小鼠体内可分化为几乎所有类型的人造血免疫细胞,联合人胸腺移植可进一步增强人源化小鼠中的人免疫系统功能。人源化小鼠模型已广泛的应用于人类干细胞再生、微生物感染、肿瘤、移植以及自身免疫病等领域,有效地促进了这些领域生物医学的进步。尽管人源化小鼠功能完备,但是因为小鼠存在寿命较短(2～3年),与人类器官大小及功能差异显著,以及在扩大器官移植规模、药物评估和生产临床相关人类细胞产品方面存在挑战等缺陷,阻碍了其更广泛的应用。在过去的十年里,这些限制激发了人们对开发人源化大动物模型的兴趣。相较于小鼠,猪具有寿命长(15～20年),与人器官大小及功能接近,是理想的异种器官供体等优势,因此猪被公认为是构建人源化大动物模型的理想受体。尽管人源化小鼠模型为人源化猪模型的开发提供了宝贵的见解,但进展缓慢,人源细胞的最高嵌合率仅为0.58%。关键的挑战主要在于:1)设计适合人类造血免疫系统移植的基因编辑免疫缺陷猪;2)实现基因编辑重症免疫缺陷猪的长期存活(目前国际记录仅为34天);3)人造血干/祖细胞在免疫缺陷猪体内的高效植入和重建;4)确定人源化猪体内分化的人免疫细胞的功能。因此,本人的博士研究旨在解决这些瓶颈问题。主要研究内容包括:1)利用CRISPR-Cas9和体细胞核移植技术,制备T、B和NK细胞联合缺陷且巨噬细胞对人源细胞耐受的免疫缺陷猪;2)通过无菌剖宫产和在无病原体屏障系统中基于隔离器的人工饲养,实现这些猪的长期存活;3)优化在免疫缺陷猪体内高效植入人造血干/祖细胞的预处理及移植方案;和4)系统分析人源化猪体内分化的人类造血免疫细胞的组成、表型、分布以及功能特征。研究方法: (1)采用CRISPR-Cas9技术对巴马猪成纤维细胞进行基因编辑,再通过体细胞核移植和胚胎移植技术制备RAG1-/-IL2RG-/Y(RG)和RAG1-/-IL2RG-/Y CD47-/-(RGD)免疫缺陷猪。 (2)在代孕母猪妊娠112天时,通过剖宫产在无菌条件剥离仔猪,并转至屏障系统内隔离器中进行人工饲养。 (3)利用硬X射线辐照或化疗药注射等方案进行预处理,联合骨髓腔内人造血干/祖细胞移植探索造血免疫系统人源化猪模型的理想构建方案。 (4)利用流式细胞术追踪外周血中人造血免疫细胞的动态变化;利用H&E染色、免疫组化及单细胞RNA测序技术评价人源化猪免疫细胞的分化和功能。 (5)通过将人造血干细胞再移植给NOD/SCID Il2rg-/-小鼠和体外免疫功能测定,包括抗体分泌和肿瘤杀伤实验,进行人免疫细胞的功能评估。研究结果: (1)RG及RGD免疫缺陷猪外周血和脾脏表现为T、B和NK细胞完全缺失;RGD猪不表达CD47;RG及RGD猪的胸腺严重萎缩,未见典型皮髓质结构,脾脏未见白髓结构。 (2)RG及RGD猪,在DPF屏障系统隔离器中可高比例、长期生存(最长超过500天)。 (3)5/7的RG猪在全身辐照后于4周内死亡,在此基础上探索出相对安全的6 mg/kg白舒非预处理方案。 (4)巴马猪巨噬细胞SIRPα与人CD47无交叉反应,猪巨噬细胞可快速清除人红细胞。 (5)RG人源化猪骨髓中存在11.1%～45.1%的人CD45+细胞嵌合,且检测到人造血干/祖、髓系-巨核前体、红系前体及B细胞等的分化发育,但是在外周血及脾脏中几乎检测不到人造血免疫细胞。 (6)造血免疫系统人源化重建水平最高的RGD猪,在人源化6周时,外周血中即可检测到77.6%的人CD45+细胞嵌合,此后长期稳定在90%以上;胸腺发育出经典的皮髓质结构,人CD45+细胞占93.4%,其中CD3为弥散性表达,CD4+CD8+双阳性T细胞占67.0%;脾脏重现白髓样结构。 (7)单细胞测序分析人造血免疫分化: 1)骨髓、胸腺及脾脏等淋巴器官,都检测到人B细胞和NK细胞等多系人免疫细胞发育; 2)RGD人源化猪胸腺和脾脏中检测到人TCR α和β基因座的广泛V(D)J重排元件,猪胸腺中87%以上的T细胞是单克隆; 3)RGD人源化猪骨髓和脾脏中检测到广泛的免疫球蛋白(I

关键词：免疫缺陷猪人源化动物模型再生医学造血干细胞移植生物反应器

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利用细菌人工染色体（BAC）构建hSIRPα转基因兔模型

利用细菌人工染色体（BAC）构建hSIRPα转基因兔模型

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作者：杨素杰东北农业大学

学位级别：硕士

动物模型在人类疾病的发病机制和治疗等生物医学研究中是必不可少的。由于人类与动物在生理特征、遗传背景和免疫系统等方面存在差异,动物免疫系统会对移植的人源细胞或组织产生免疫反应,极大的限制了实验动物的应用和人类相关疾病的研... 详细信息

动物模型在人类疾病的发病机制和治疗等生物医学研究中是必不可少的。由于人类与动物在生理特征、遗传背景和免疫系统等方面存在差异,动物免疫系统会对移植的人源细胞或组织产生免疫反应,极大的限制了实验动物的应用和人类相关疾病的研究,因此构建免疫缺陷动物及其人源化研究将拓宽动物模型的应用范围并促进相关疾病的研究。2007年,Takenaka首次报道NOD小鼠的Sirpα基因的多态性有利于人类造血干细胞的植入,其在小鼠巨噬细胞上的表达能增强宿主对外源移植物的耐受能力。随着研究的深入,越来越多的证据表明SIRPα（Signal regulatory proteinα,SIRPα）蛋白与CD47蛋白结合会产生不要吃我（Don’t eat me）的抑制性信号,从而避免吞噬细胞对外源移植物的吞噬作用。SIRPα蛋白与人类CD47（h CD47）蛋白的亲和力大小决定移植效果,目前通常利用构建有人SIRPα（hSIRPα）基因的BAC质粒在免疫缺陷动物模型中进行人源化研究,hSIRPα蛋白的表达有利于人源细胞或组织在动物体内的移植效果,促进了人源化动物模型的发展,但还未见到hSIRPα转基因兔的相关报道。细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome,BAC）能携带150-300 kb的基因组片段,插入的序列通常包括基因的增强子及其他调控元件,使转入的基因保持稳定表达。本课题通过显微操作技术将含有hSIRPα基因的BAC质粒注射到兔受精卵原核中,再通过胚胎移植技术将注射后的受精卵移植到兔的输卵管中,由此构建的基因人源化兔模型,我们称之为类NOD兔,并对其各项指标进行检测。结果如下:1)通过各物种中SIRPα蛋白IgV结构域与CD47蛋白IgSF结构域的氨基酸序列比对结果可知:兔与NOD小鼠和人的SIRPαIgV结构域氨基酸序列同源性分别为62%、68%;CD47IgSF结构域的氨基酸序列同源性分别为60%、63%,其同源性均较低,因此推测rb SIRPα蛋白与h CD47蛋白结合的亲和力较低;2)在本实验中,将79枚受精卵移植到三只受体兔中,其中两只妊娠,共产下14只仔兔。受体R001产仔5只,受体R002产仔9只,其中R002受体产的仔兔有5只陆续死亡;目前存活仔兔共9只;3)由于BAC-hSIRPα（208kb）质粒易断裂,因此在胚胎移植之前利用PCR方法对通过体外培养方式获得的注射BAC-hSIRPα质粒的囊胚（编号No.1-10）进行基因完整性鉴定。本实验共设计6对引物对囊胚进行鉴定,其中在No.3,4,7-9囊胚中检测到5对连续的引物PCR结果呈阳性,表明注入的hSIRPα基因完整性较好;4)跨越hSIRPα基因（46 kb）设计9对引物对新生仔兔的耳组织进行基因完整性检测,结果表明:14只仔兔中hSIRPα基因整合程度各不相同,其中R002-6和R002-9仔兔中9对引物均呈阳性。同时本实验采用绝对定量PCR法检测了外源基因拷贝数,在14只转基因兔中R002-9转基因兔的拷贝数最高为1.75±0.44;R002-7转基因兔的拷贝数最低为0.42±0.05,与PCR结果相印证;5)采用相对定量PCR法检测hSIRPα在各组织中mRNA水平上的表达情况,结果显示hSIRPα基因在回肠中的表达量最高,胃和脾脏次之,肝脏组织中的表达量最低。在回肠、胃和脾脏中,转基因兔hSIRPα基因的mRNA表达水平显著高于野生型兔（P<0.05）;6)为检测hSIRPα转基因对于兔自身免疫组分的影响,我们对转基因兔的外周血细胞组分进行了分析。结果显示淋巴细胞、单核细胞等免疫细胞的数量及其占比与野生型兔无显著性差异（P>0.05）,表明hSIRPα基因的插入不影响兔免疫组分的发育。另外通过流式细胞法检测了hSIRPα的表达情况,结果表明hSIRPα基因在转基因兔中具有不同程度的表达,其中R001-2仔兔的表达水平最高;本研究结果表明:在获得的14只仔兔中,hSIRPα基因均有不同程度的整合,其中R002-9和R002-6转基因兔的整合程度最高,目前存活的转基因兔体内T、B细胞等免疫组分与野生型兔相比无显著性差异（P>0.05）,其中R001-2仔兔的hSIRPα蛋白表达水平最高。随着基因编辑技术的出现,各种免疫缺陷(PRKDC-/-、RAG1/2-/-、IL2Rγ-/-)兔模型已经成功构建,若与hSIRPα转基因兔模型繁殖,则可获得类似于NOG、NRG、NSG小鼠品系的兔模型,极大的丰富可用于人源化研究的兔疾病模型的种类,从而更好的模拟人体内环境,获得更真实的生理病理反应。

关键词： hSIRPα基因 BAC质粒人源化动物模型

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利用DNA同源重组工程和CRISPR/Cas9构建SCN9A人源化小鼠

利用DNA同源重组工程和CRISPR/Cas9构建SCN9A人源化小鼠

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作者：段秋月山东大学

学位级别：硕士

随着Nav1.7成为治疗疼痛而无副作用的新靶点,开发出该钠离子通道特异性的镇痛药成为许多制药企业的研究热点。小鼠基因组与人类基因组具有较高的同源性,因此,小鼠一直是人类疾病治疗药物临床前研究阶段主要的动物模型之一。但由于人源... 详细信息

随着Nav1.7成为治疗疼痛而无副作用的新靶点,开发出该钠离子通道特异性的镇痛药成为许多制药企业的研究热点。小鼠基因组与人类基因组具有较高的同源性,因此,小鼠一直是人类疾病治疗药物临床前研究阶段主要的动物模型之一。但由于人源和鼠源蛋白之间存在种属差异,会使试验结果之间产生数据偏差,导致许多药物在进入临床研究阶段后,面临很高的失败风险。人SCN9A基因编码Nav1.7的功能性亚基,研发以Nav1.7为靶标的镇痛药物,亟需SCN9A人源化小鼠的构建。人SCN9A基因约180 kb,人类基因组细菌人工染色体(BAC)文库中没有单一的BAC将其完全涵盖,具有完整基因BAC载体的缝合成为SCN9A人源化小鼠构建的前提。本文利用DNA同源重组工程进行人SCN9A基因的缝合,获得了一个308 kb的BAC,同时将Sleeping Beauty(SB)转座酶识别的反向重复序列(IRs)添加至这个BAC载体的两侧,使得该超大BAC转基因载体在进行转座时,不会转座BAC载体的序列。在进行BAC修饰时,将Venus荧光蛋白与人SCN9A蛋白用2A自剪切多肽序列相连,作为报告基因,可以示踪人SCN9A蛋白在小鼠体内不同细胞或组织中的表达。通过脂质体转染的方法,将修饰后的BAC与SB转座酶表达质粒共转染进mESCs中,成功将约300 kb的片段整合在小鼠胚胎干细胞(mESCs)基因组上。利用DNA同源重组工程,将用于小鼠Scn9α基因打靶的同源臂直接从mESCs基因组中克隆下来,构建了具有长同源臂的基因打靶载体。将长同源臂介导的同源重组与CRISPR/Cas9技术相结合,将荧光蛋白表达基因置于小鼠Scn9a基因启动子之下,同时通过敲除关键外显子使目的基因失活。荧光蛋白Cherry可以对小鼠SCN9A蛋白的表达进行定位。将PCR和ExoCET技术相结合对基因打靶细胞进行基因型分型,更加准确和可靠。结果显示,已经成功获得了Scn9 基因单等位基因敲除和双等位基因敲除的mESCs。其中,单等位基因敲除的mESCs将被用于人源化小鼠的构建,双等位基因敲除的mESCs可以诱导成神经干细胞,在细胞水平研究SCN9A蛋白的功能。SCN9A突变与不同疼痛疾病密切相关,如先天性无痛症(CIP)、红斑性肢痛症(IEM)、阵发性剧痛症(PEPD)、小纤维神经病(SFN)等。其中,G856D和A1632E突变体的临床表型和电生理特性最为复杂,分别表现出IEM与SFN、IEM与PEPD的综合症状。因此,SCN9A G856D和A1632E突变人源化小鼠的构建更具有研究意义与应用价值。本文将DNA同源重组工程与ccdB反向筛选策略相结合,成功实现了G856D和A1632E的疼痛超敏感点突变。本研究首次利用缝合的超大BAC进行mESCs转座,将人SCN9A基因整合在小鼠基因组上,为研究SCN9A蛋白的功能和疼痛的分子机制创造了有利条件。小鼠Scn9α基因打靶载体和人SCN9A基因转座BAC的设计应用了不同的荧光蛋白报告基因,可以显示人源和鼠源SCN9A蛋白在小鼠体内的组织分布,作为疼痛药物筛选的依据。利用SCN9A人源化小鼠或者具有SCN9A G856D和A1632E疼痛超敏感突变的人源化小鼠筛选镇痛药物,可以降低蛋白差异带来的数据偏差,从而增加候选药物进入临床试验后的成功率。

关键词： SCN9A DNA同源重组工程基因打靶 BAC转座人源化动物模型

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