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中国兽医杂志 2002年第9期38卷 3-6页

作者：秦卓明何叶峰贾强金维江张世栋高峰赵继勋谷红山东省农业科学院家禽研究所山东济南250100 中国农业大学动物医学院北京海淀100094

分离并鉴定出山东省不同地区的 IBV分离株 A、B、C、D和北京分离株 F,利用中和试验分别对各分离株及标准株M4 1 、T等进行血清分型。设计一对引物 ,分别对各毒株的 S1 基因进行 RT- PCR扩增 ,扩增片段长约 170 0 bp,利用其 PCR产物进行 ... 详细信息

分离并鉴定出山东省不同地区的 IBV分离株 A、B、C、D和北京分离株 F,利用中和试验分别对各分离株及标准株M4 1 、T等进行血清分型。设计一对引物 ,分别对各毒株的 S1 基因进行 RT- PCR扩增 ,扩增片段长约 170 0 bp,利用其 PCR产物进行 Hae 酶切 ,根据酶切图谱 ,进行基因分型。结果表明 :A、C、D和 M4 1 酶切图谱相同 ,属 Mass基因型 ,分别为 90 0、4 0 0和30 0 bp左右的片段 ;北京 F株有 4条酶切条带 ,与 4 /91基因型不同 ,分别为 10 0 0、30 0、2 0 0和小于 10 0 bp左右的片段 ;B株有4条酶切条带 ,理论推断与 T株相似 ,分别为 70 0、5 0 0、30 0和 180 bp左右的片段 ,可能为同一基因型。血清学分型结果与基因分型结果不符。

关键词：传染性支气管炎病毒血清型 RT-PCR RFLP 基因型山东株北京株

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传染性支气管炎病毒番鸭分离株的鉴定及N基因片段序列分析

传染性支气管炎病毒番鸭分离株的鉴定及N基因片段序列分析

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作者：潘书磊福建农林大学

学位级别：硕士

鸡传染性支气管炎（infectious bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（IBV）引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。病毒血清型复杂,所致疾病的临床表现差异很大,主要症状为呼吸困难、产蛋下降、肾炎和腺胃炎等。近年来,IB的流行... 详细信息

鸡传染性支气管炎（infectious bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（IBV）引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。病毒血清型复杂,所致疾病的临床表现差异很大,主要症状为呼吸困难、产蛋下降、肾炎和腺胃炎等。近年来,IB的流行呈上升趋势,尤其是肾型、腺胃型鸡传染性支气管炎的发生,给养禽业造成巨大的经济损失。病毒基因组为线状、不分节段、单股正链RNA,全长27.6kb,主要结构蛋白为纤突（S）蛋白、膜（M）蛋白和核衣壳（N）蛋白,其中唯一位于膜内的由409个氨基酸组成的N蛋白,能特异性结合到引导RNA上,参与病毒RNA的复制、转录和翻译。以往,人们对IBV的研究主要集中在S1基因上,认为N基因在IBV的进化中高度保守;但近年研究发现,N基因也存在广泛的变异,并且这些变异分布于抗原表位和相关功能区域,预示不同毒株N基因变异可能导致病毒的某些生物特性发生改变。 2008年12月我省莆田某种番鸭养殖场发生疾病:产蛋高峰期番鸭产蛋锐减,产蛋率从85%降低到30%0%,经两个月后逐渐恢复至60%,蛋质量下降,软壳蛋、畸形蛋增多,孵化率降低,病番鸭伴有一过性呼吸道症状,死亡率极低,剖检发病番鸭发现卵泡膜充血,其它实质器官无明显病变。取病番鸭卵巢组织进行病毒分离（毒株命名为PTFY株）,经鸡胚传代、理化特性试验、血凝试验、电镜观察、测序对比等鉴定PTFY株为IBV,结果如下: 1、经9日龄SPF鸡胚传代,第5代开始出现侏儒胚、尿囊腔有大量白色絮状物沉积。理化特性试验,发现经氯仿、乙醚、去氧胆酸钠处理后的病毒,其感染力降低。经电镜负染观察发现病毒粒子直径为100nm,有囊膜,略呈球形,囊膜上可见花瓣样纤突,符合冠状病毒特性。 2、取第5代尿囊液,用1%胰酶处理不同时间后测血凝价,发现血凝价随胰酶消化时间的延长而提高,4h达到最高,随后处于稳定状态;取不同培养时间（36h、48h、72h、96h、120h）鸡胚尿囊液,用1%胰酶处理后测血凝价,发现血凝价随着培养时间的延长而增加。 3、将病毒液通过点眼、滴鼻感染SPF雏鸡,第3天开始出现呼吸困难、精神萎顿等临床症状。但是剖检并未有明显的特征病变。对照组无异常。后取肾脏组织经RT-PCR检测,证明其有IBV。 4、将PTFY株进行新城疫病毒干扰试验,发现PTFY株对新城疫病毒的复制有抑制作用。 5、取第5代尿囊液用气管环培养物进行病毒感染力测定,得出其TOC-ID50=10-5.413/0.1ml;将PTFY株与本实验室保存的PT株进行血清中和试验,得知两者抗原相关性低。 6、参考GenBank中IBV毒株（GenBank:DQ001338.1）,设计引物,经反转录聚合酶链式反应（Reverse-translation polymerase-chain reaction,RT-PCR）扩增得到600bp片段产物,通过测序比对发现与美国呼吸型强毒株Mass41的同源性为97.3%,与山东肾型毒株CK/CH/LSD/03I的同源性为99%,与H52的同源性为97.8%,证实PTFY株为IBV。 7、用DNAstar、DNAman等分析软件,将PTFY分离株N基因片段（345～945位）扩增产物序列与GenBank中14株国内外参考毒株进行核苷酸序列比较和同源性分析,绘制出核苷酸序列的系统进化树,得出核苷酸序列同源性、进化树中的分支地位与病毒亲嗜性、致病力没有必然的联系。本试验从番鸭卵巢中分离到一病毒株（命名PTFY）,后经鸡胚传代、理化特性研究、电镜观察、测序对比等鉴定为IBV,说明IBV能够感染水禽。可知IBV不仅对鸡、孔雀等陆生家禽有致病性,还对水禽（番鸭）具有感染性。

关键词：传染性支气管炎病毒番鸭 N基因分离鉴定

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传染性支气管炎病毒细胞适应株的培育及其分子生物学特征

传染性支气管炎病毒细胞适应株的培育及其分子生物学特征

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作者：秦亚平中国农业科学院

学位级别：硕士

传染性支气管炎（Infectiousbronchitis，IB）是严重危害养禽业的重要传染性疫病之一，具有传播迅速、发病率高等特点。该病的病原为传染性支气管炎病毒（Infectiousbronchitisvirus，IBV），IBV血清型众多，且不同血清型毒株之间几乎... 详细信息

传染性支气管炎（Infectiousbronchitis，IB）是严重危害养禽业的重要传染性疫病之一，具有传播迅速、发病率高等特点。该病的病原为传染性支气管炎病毒（Infectiousbronchitisvirus，IBV），IBV血清型众多，且不同血清型毒株之间几乎无交叉保护，给该病的防控增加了难度。由于IBV在体外进行细胞培养比较困难，致使基于细胞培养的致病机制研究受到阻滞，同时也对IBV疫苗的生产造成了一定限制，凸显了建立鸡传染性支气管炎病毒细胞培养平台的重要性。　　本研究以肾型IBVtl/CH/LDT3/03为亲本病毒，培育鸡胚成纤维细胞（CEF）适应株和非洲绿猴肾细胞（Vero）适应株。通过在CEF和Vero细胞上连续传代，获得了可以在CEF和Vero细胞上具有良好增殖能力的细胞适应株CEALDT3/03和VEALDT3/03。对适应株每5代进行RT-PCR和间接免疫荧光检测，结果表明CEALDT3/03和VEALDT3/03适应株能在CEF和Vero细胞中稳定复制和传代。对细胞适应株进行复制动力学评价，结果显示，细胞适应株随着在细胞中培养时间的增加，病毒滴度随之增高，在培养后60h~72h，病毒滴度达到高峰。病毒经过连续传代后，在细胞上的适应能力逐渐增强，产生病变所需时间逐渐缩短，病毒滴度逐渐升高。　　通过对EEA（亲本病毒）、CEAP20和VEAP25全基因组序列测定，细胞适应株与EEA（亲本病毒）在基因组序列上存在较大差异。与EEA（亲本病毒）相比，CEAP20和VEAP25在基因组3′端缺失197bp，导致基因7的缺失;CEAP20和VEAP25基因组中编码蛋白的氨基酸有不同程度突变，CEAP20的pp1ab蛋白有25个氨基酸替换位点，S蛋白有15个氨基酸替换，E蛋白有2个氨基酸替换，M蛋白有1个氨基酸替换;VEAP25的pp1ab蛋白总计产生29个氨基酸替换位点，S蛋白有13个氨基酸替换，E蛋白有2个氨基酸替换，M有2个氨基酸替换，N蛋白有1个氨基酸替换。从编码蛋白突变分析，VEAP25适应株的基因组变化更大，这些变化可能与病毒的细胞嗜性和致病力有关。　　为了评价2株细胞适应株的致病性是否发生变化，本研究用1日龄SPF鸡进行致病性评价。2株细胞适应株在人工感染后3d出现甩头、挠鼻子、腹泻等症状，与亲本病毒组相比症状轻微，不引起鸡只死亡。感染后排毒检测，亲本病毒在感染后32d仍可从鸡泄殖腔拭子中分离到病毒，而CEAP20组在鸡只感染后20d就检测不到排毒，VEAP25组未从感染鸡中检测到排毒。感染后5d，每组剖杀5只鸡，检测病毒在鸡体内的分布情况。亲本病毒在感染鸡的各组织中广泛存在，且肾脏和气管中的病毒载量相对较高;CEAP20主要在鸡的气管（3/5）和肾脏（2/5）中存在，但病毒载量低于亲本病毒;VEAP25主要在鸡的气管（3/5）和肾脏（2/5）中存在，但病毒载量低于亲本病毒和CEAP20。中和试验证明，CEAP20与亲本病毒抗原性差异较小，而VEAP25与亲本病毒和CEAP20存在抗原性差异。上述结果提示，与亲本病毒相比，CEAP20和VEAP25对1日龄SPF鸡的致病力明显下降;CEAP20和VEAP25的组织嗜性发生改变，对气管和肾脏有一定的嗜性，但亲和性明显下降;CEAP20的抗原性未发生明显改变，但是VEAP25的抗原性发生明显改变。　　综上所述，本试验获得了可以在CEF和Vero细胞上具有良好增殖能力的IBV细胞适应株，建立了IBV细胞培养的技术平台。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒细胞适应分子生物学特性致病性

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传染性支气管炎病毒地方分离株的RFLP和序列分析

传染性支气管炎病毒地方分离株的RFLP和序列分析

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作者：王宪文河南农业大学

学位级别：硕士

用扩增片段为0.2kb、0.6kb、1.7kb的三对引物分别对传染性支气管炎病毒6株标准株：M41、Holte、Arka、Conn、Gray、T和8株地方分离株：宜、138、广32、云、SAIBV14呼、Am、J7、张IBV进行RT-PCR，结果以0.6kb片段引物扩出的毒株最多：6... 详细信息

用扩增片段为0.2kb、0.6kb、1.7kb的三对引物分别对传染性支气管炎病毒6株标准株：M41、Holte、Arka、Conn、Gray、T和8株地方分离株：宜、138、广32、云、SAIBV14呼、Am、J7、张IBV进行RT-PCR，结果以0.6kb片段引物扩出的毒株最多：6株标准株中的5株：M41、Arka、Conn、Gray、T；8株地方分离株中的6株：广32株、J7株、张IBV株、Am株、宜株、138株。0.2kb片段长度的引物可扩增出2株标准株：M41株和Connecticut株和2株地方分离株：SAIBV14#呼和Am株；而1.7kb长度片段的引物只扩增出了标准株M41和地方分离株138株。取各毒株0.6kb片段PCR产物，分别用三种限制性内切酶AluⅠ、TaqⅠ和AfaⅠ进行酶切，然后根据标准株的酶切模式对各地方分离株进行RFLP分型（AfaⅠ酶切均为阳性），可将参考株分为如下三种模型①M41模式：AluⅠ酶切、TaqⅠ酶切均有特异的条带；②Ark株、G株、C株模式：AluⅠ酶切阳性而TaqⅠ酶切阴性；③T株模式：AluⅠ酶切阴性而TaqⅠ酶切阳性。然后根据标准株的酶切模式对各地方分离株进行RFLP分型，可将各地方分离株分为①M41模式有：广32株、J7株、张IBV株、Am株②Ark株、G株、C株模式有138株、宜株。这表明我国IBV血清型众多，但以M41为代表的呼吸型传支占比例最大（50％），宜株为代表的肾型传支也有一定数量（25％）。将地方分离株宜株的0.6kb片段的扩增产物进行测序并与标准株Ark株、G株、C株和标准株M41的相应序列进行分析比较，认为该地方分离株是以点突变为主并可能伴有基因插入、基因缺失和基因重组的新的IBV变异株，氨基酸同源性的分析显示三株呼吸性毒株M41、H52、H120同源性极高分别为95.8％、97％、98.8％；宜毒株与同一酶切类型的Ark株、G株、 C株的同源性分别为91．6％、SS％、85％，其中与Ark－1529－29株氨基酸同源性最高，为 gi．6见与不同酶切类型的 M。l、、H。卜 H；。。三毒株氨基酸同源性较低分别为85．6巩86．2卧86．2趴因而推测宜株是由 Ark、《9型株变异而来。本研究对IBV的快速诊断和分型有较大的实用价值，可为IBV的防制和地方制苗株的选择提供参考依据。

关键词：传染性支气管炎病毒 RT-PCR 限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP) 点突变同源性分析

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传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

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作者：耿玥郑州大学

学位级别：硕士

传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的禽类的一种急性、高度接触性传染病,是严重危害养鸡业的重大传染病之一。IBV是禽类一种变异性很强的冠状病毒,传播迅速、血清型... 详细信息

传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的禽类的一种急性、高度接触性传染病,是严重危害养鸡业的重大传染病之一。IBV是禽类一种变异性很强的冠状病毒,传播迅速、血清型众多,不同的血清型之间缺乏交叉保护。IBV的蔓延对全球家禽业造成了严重的损失。N蛋白是诱导机体免疫应答的重要免疫原蛋白,N基因具有高度的保守性。本研究以IBV N蛋白为研究对象,制备了针对N蛋白的单克隆抗体,对IBV的预防、诊断及控制具有一定的意义。本实验将IBV H120毒株通过接种鸡胚的方法扩繁,从含病毒的尿囊液中提取总RNA,反转录为cDNA。设计一对特异性引物对N基因进行扩增,片段大小为1230bp,将其与克隆载体pMD19-T连接并转入DH5α感受态细胞并保存菌种,将其与表达载体pGEX-6p-1连接并转入Transetta(DE3)感受态细胞,进行诱导表达。SDS-PAGE电泳分析重组N蛋白大小约为79kD,用GST柱纯化重组N蛋白,加入PreScission Protease切除GST标签,Western-blot检测N蛋白的抗原性,结果显示N蛋白有较好的抗原性。采用纯化的N蛋白对BALB/c小鼠进行免疫,通过间接ELISA方法检测,选取免疫效果最好的小鼠B淋巴细胞进行细胞融合。通过间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经过三轮亚克隆获得了13株能稳定分泌抗N蛋白抗体的杂交瘤细胞株,其中8株能与IBV结合。选择效价高且能与IBV结合的1A12C5细胞株,通过小鼠体内诱生腹水法大量制备抗N蛋白的单克隆抗体,收集腹水用正辛酸-硫酸铵法对其进行纯化,SDS-PAGE电泳结果表明该单抗纯度比较高。1A12C5单克隆抗体重链为IgG2b,轻链κ型。纯化后的1A12C5单抗效价可以达到1:1.64×10～6,亲和力常数为1.87×10～7 L/mol。特异性鉴定结果表明1A12C5仅与IBV特异性结合。1A12C5单克隆抗体能与不同血清型的IBV反应。稳定性鉴定表明1A12C5单克隆抗体具有良好的传代稳定性。本试验成功制备了13株抗IBV N蛋白单克隆抗体其中8株可以与IBV结合,为进一步研制IBV诊断试剂奠定了基础。

关键词：传染性支气管炎病毒 N蛋白原核表达单克隆抗体

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传染性支气管炎病毒N蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

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中国动物传染病学报 2024年第4期32卷 179-187页

作者：刘清艳王欢丁铲钱琨廖瑛方守国长江大学动物科学学院荆州434025 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 江苏省人兽共患病学重点实验室、江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225000

本研究以IBV Beaudette株基因组为模板获得N基因片段,构建重组原核表达质粒pET-32a-His-IBV-N,在大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,纯化后获得带有His标签的N重组蛋白。将其与等体积的弗氏完全佐剂混匀乳化后免疫BALB/c小鼠3次,收集血清,得到... 详细信息

本研究以IBV Beaudette株基因组为模板获得N基因片段,构建重组原核表达质粒pET-32a-His-IBV-N,在大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,纯化后获得带有His标签的N重组蛋白。将其与等体积的弗氏完全佐剂混匀乳化后免疫BALB/c小鼠3次,收集血清,得到鼠源抗N蛋白多克隆抗体。利用间接免疫荧光试验和Western blot鉴定多克隆抗体的特异性。结果显示,N蛋白多克隆抗体能特异性识别转染表达的Flag-N蛋白和IBV感染表达的N蛋白,说明此抗体能识别N蛋白的线性表位和空间表位,可应用于Western blot和间接免疫荧光实验。本研究为进一步研究N蛋白的功能和IB的诊断提供了技术支撑。

关键词：传染性支气管炎病毒 N蛋白多克隆抗体

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传染性支气管炎病毒和大肠杆菌混合感染三黄鸡的诊断

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中国畜牧兽医 2013年第1期40卷 196-198页

作者：陈珍施少华林甦朱春华刘斌琼蔡国漳林羽黄瑜福建省农科院畜牧兽医研究所福建福州350013 福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福建福州350013

传染性支气管炎病毒和大肠杆菌是严重危害养鸡业的2种传染病原。2011年春夏之交,福州闽候某养鸡场饲养一批三黄鸡突然发病,经症状观察、病理剖检、病原分离鉴定确诊为传染性支气管炎病毒和O78型大肠杆菌混合感染。对传染性支气管炎病毒... 详细信息

传染性支气管炎病毒和大肠杆菌是严重危害养鸡业的2种传染病原。2011年春夏之交,福州闽候某养鸡场饲养一批三黄鸡突然发病,经症状观察、病理剖检、病原分离鉴定确诊为传染性支气管炎病毒和O78型大肠杆菌混合感染。对传染性支气管炎病毒分离株FJ/11/05 M基因测序后分析表明,分离株FJ/11/05与M41株(美国呼吸型)、美国分离株Beaudette的亲缘关系较近;而与疫苗株H120、D41遗传进化关系较远。

关键词：三黄鸡传染性支气管炎病毒大肠杆菌

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传染性支气管炎病毒S1基因真核表达质粒的构建及其在CEF中的转染

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中国兽医杂志 2004年第12期40卷 17-18页

作者：姜世金刘兆球常维山张兴晓山东农业大学动物科技学院山东泰安271018 山东省博莱威生物技术研究所山东滨州256618

传染性支气管炎病毒(IBV)为冠状病毒的代表种,其S蛋白是IBV在免疫学上最重要的蛋白,与该病毒的致病性和抗原性有密切关系.该蛋白合成后在病毒成熟过程中被水解为S1、S2两个片段.S1片段由520～538个氨基酸残基构成,能诱发产生病毒中和抗... 详细信息

传染性支气管炎病毒(IBV)为冠状病毒的代表种,其S蛋白是IBV在免疫学上最重要的蛋白,与该病毒的致病性和抗原性有密切关系.该蛋白合成后在病毒成熟过程中被水解为S1、S2两个片段.S1片段由520～538个氨基酸残基构成,能诱发产生病毒中和抗体和血凝抑制抗体,并且还是免疫保护的主要诱导物.本研究通过将IBV S1基因插入真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO,阳性克隆鉴定后,在脂质体作用下转染CEF细胞,用间接免疫荧光试验检测证明S1蛋白可大量表达,为下一步进行生物学活性研究及核酸疫苗的研制奠定基础.

关键词：转染真核表达质粒传染性支气管炎病毒 CEF S蛋白诱发中和抗体 IBV S1基因间接免疫荧光试验

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传染性支气管炎病毒核蛋白粘膜免疫及ELISA检测方法的研究

传染性支气管炎病毒核蛋白粘膜免疫及ELISA检测方法的研究

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作者：杨德全华中农业大学

学位级别：硕士

传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由传染性支气管炎病毒（Infectiousbronchitis virus,IBV）引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。IBV的N蛋白在进化上较为保守,主要与基因组核酸的包裹、RNA的合成和细胞免疫有关,含有... 详细信息

传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由传染性支气管炎病毒（Infectiousbronchitis virus,IBV）引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。IBV的N蛋白在进化上较为保守,主要与基因组核酸的包裹、RNA的合成和细胞免疫有关,含有大量抗原决定簇,免疫原性仅次于S蛋白,能诱导机体产生交叉保护性抗体。本研究克隆表达了具有高度保守性的N蛋白基因,并将其作为免疫原制备多克隆抗体,建立检测IBV抗原的夹心ELISA法,为该病的早期诊断和控制提供了良好工具。IBV血清型较多,新的变异株在不断出现,且不同型毒株间缺乏交叉保护或仅有部分交叉保护,给免疫防治带来很大困难。本研究尝试利用霍乱毒素B亚基（Cholera toxin B subunit,CTB）的粘膜佐剂作用,将IBV N基因的表达产物与CTB混合或将N基因与CTB融合表达后,鼻腔免疫7日龄肉鸡,以期提高鸡鼻腔、气管和肠粘膜表面抗IBV sIgA的抗体水平,从而达到预防和控制IB的目的。本研究主要研究内容和研究结果如下: ***核蛋白基因（np）与霍乱毒素B亚基基因（ctb）的融合表达将ctb基因和np基因融合后,在大肠杆菌BL21（DE3）中获得了成功表达,产物命名为rCTB-NP。复性后的表达产物经SDS-PAGE检测,出现了分子量大小为72.0kDa和92.0kDa的两条带。Western blot分析表明,融合蛋白rCTB-NP中的N蛋白具有良好的免疫反应性。GM1-ELISA实验结果表明,融合蛋白rCTB-NP中的CTB蛋白具有良好的免疫学活性。 2.传染性支气管炎病毒重组核蛋白粘膜免疫效果研究将融合蛋白rCTB-NP,rNP、rNP+rCTB分别免疫7日龄肉鸡,用ELISA法检测血清中的IgG-NP、IgA-NP及鼻、气管和肠粘膜部位的sIgA-NP。结果发现,二免和三免后,血清中均能产生较高水平的IgG-NP抗体,但IgA-NP抗体水平较低;鼻、气管和肠粘膜部位rCTB+rNP组和rCTB-NP组的sIgA-NP抗体水平与NP组比较,前两组显著高于NP组（p＜0.05）;气管粘膜部位sIgA-NP水平表现为rCTB-NP组＞rCTB+rNP组＞rNP组。结果表明,CTB与IBV N蛋白融合表达产物或与该蛋白混合进行鼻腔免疫时,能显著提高鸡鼻腔、气管和肠粘膜表面sIgA的抗体水平。 3.检测传染性支气管炎病毒的夹心ELISA方法的建立以鸡抗NP IgG为包被抗体,兔抗IBV IgG为二抗,建立了检测IBV的夹心ELISA法。结果表明,鸡抗IBV IgG的最佳包被浓度为2.5μg/mL,兔抗IBV IgG的最适工作浓度为5μg/mL;该方法比血球凝集试验敏感性高8倍以上,与NDV、AIV、EDS-76V、IBDV等无交叉反应,说明该法特异性和敏感性较高。

关键词：传染性支气管炎病毒核蛋白 CTB 粘膜免疫 sIgA ELISA

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传染性支气管炎病毒对雉鸡的感染性研究

传染性支气管炎病毒对雉鸡的感染性研究

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作者：徐晓晨中国农业科学院

学位级别：硕士

近年来,雉鸡冠状病毒(Pheasant coronavirus,PhCoV)在中国商品雉鸡养殖场感染严重,给养殖场造成了严重的经济损失,也给养殖生态带来了严峻挑战,然而目前没有专门针对PhCoV的疫苗可用。PhCoV与鸡传染性支气管炎病毒(Avian Infectious bro... 详细信息

近年来,雉鸡冠状病毒(Pheasant coronavirus,PhCoV)在中国商品雉鸡养殖场感染严重,给养殖场造成了严重的经济损失,也给养殖生态带来了严峻挑战,然而目前没有专门针对PhCoV的疫苗可用。PhCoV与鸡传染性支气管炎病毒(Avian Infectious bronchitis virus,IBV)之间基因组结构相似,基因序列高度一致,其抗原可能存在交叉反应。对于PhCoV的起源,有研究提出PhCoV可能来源于IBV,因此传染性支气管炎疫苗可能成为预防PhCoV的潜在有效疫苗。为了有效防控这类禽冠状病毒病,明确不同宿主之间的冠状病毒感染情况显得尤为必要。鉴于此,本实验以雉鸡作为研究模型,探讨IBV活疫苗对PhCoV的防控以及不同血清型/致病性IBV对雉鸡的感染情况。本研究首先探究的是鸡的IBV常用疫苗H120株对雉鸡接种IBV强毒M41株和PhCoV I0623/17株后的免疫保护作用。试验结果表明:H120疫苗株和M41株可在大部分接种雉鸡体内低水平、短时间复制,而PhCoV I0623/17株可在雉鸡体内高水平、长时间复制。H120疫苗株能够诱导雉鸡产生体液免疫反应,且能够部分限制同源的M41株的复制,表现为H120疫苗株接种后,组织内M41株的病毒滴度降低,且肺脏和肾脏中检不到病毒,口咽拭子病毒分离阳性率下降。然而H120疫苗株对异源的PhCoV I0623/17株保护能力较差,H120疫苗株接种后,各组织内I0623/17株的病毒滴度仅略有降低,口咽拭子病毒分离阳性率并未整体下降。可能是由H120疫苗株在雉鸡体内的复制能力低,且H120和I0623/17株S蛋白的S1亚基氨基酸同源性低,抗原交叉反应小引起。提示不同血清型/致病型的IBV可能在雉鸡体内的复制能力存在差异。为证明上述假设,分别用代表3个血清型/致病型的IBV毒株CK/CH/LSD/190305、CK/CH/LDL/140520和CK/CH/LDL/091021接种雉鸡并在雉鸡体内传代,以分析不同IBV在雉鸡体内的感染情况及传代后的适应和复制能力。结果显示:不同血清型/致病型的IBV接种雉鸡后,病毒在不同组织中的分离率和滴度不同、经呼吸道和消化道排毒的雉鸡数量和排毒时间不同、不同组织中基因组的变异程度不同。说明不同血清型/致病型的IBV在雉鸡体内的复制能力存在明显差异。经雉鸡体内传代后,其在雉鸡体内的适应性明显增加,表现为:接种后组织中病毒分离率和滴度升高、经呼吸道和消化道排毒的雉鸡数量增加、排毒时间延长、病毒在不同组织中的基因组更加稳定。比较而言,LDL/140520毒株和其适应毒株的复制能力强于其他毒株,诱导产生的中和抗体滴度也较高。因此,随着传代,IBV在雉鸡体内的适应性和复制能力逐步增加。综上所述,本研究证明了IBV H120疫苗对PhCoV的防控效果有限,还需探索其他潜在的防控疫苗;不同血清型/致病性IBV均能在雉鸡体内复制,但复制能力不同,且在雉鸡体内传代后复制能力明显增强;一定程度上支持了PhCoV来源于IBV这一假说。

关键词：传染性支气管炎病毒雉鸡冠状病毒复制能力基因组

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