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动物医学进展 2016年第2期37卷 75-80页

作者：周晏丞郭玉洁陈露曹立亭马跃西南大学荣昌校区动物医学系重庆荣昌402460

体内诱导抗原技术(IVIAT)作为一种新兴的体内诱导基因筛选技术,相比其他筛选技术具有不需要动物模型的显著优势。大量试验证实体内诱导基因可能与病原微生物在机体内生存以及致病性相关,同时其表达产物也是良好的药物靶标和疫苗候选基... 详细信息

体内诱导抗原技术(IVIAT)作为一种新兴的体内诱导基因筛选技术,相比其他筛选技术具有不需要动物模型的显著优势。大量试验证实体内诱导基因可能与病原微生物在机体内生存以及致病性相关,同时其表达产物也是良好的药物靶标和疫苗候选基因。论文综述了IVIAT的原理、操作步骤及优缺点,由于现阶段该技术在寄生虫病上应用较少,因此分析了其在寄生虫病上所具有的优势和可能存在的问题。

关键词：体内诱导抗原技术体内诱导基因寄生虫病

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应用体内诱导抗原技术筛选结核分枝杆菌体内表达基因

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Acta Genetica Sinica 2005年第2期32卷 111-117页

作者：李霆高志勇王恒冯尔玲陈宗德李新月黄留玉黄翠芬军事医学科学院生物工程研究所北京100071 郑州大学医学院微生物与免疫学教研室郑州450052 郑州市第六人民医院参比室郑州450003

为寻找新型抗结核药物靶标 ,采用体内诱导抗原技术筛选结核分枝杆菌的体内诱导基因。首先构建了结核分枝杆菌基因组质粒表达文库 ,库容量为 1 0 2× 1 0 5CFU。再用经过结核分枝杆菌和大肠杆菌的裂解产物吸附过的结核病人血清 ,... 详细信息

为寻找新型抗结核药物靶标 ,采用体内诱导抗原技术筛选结核分枝杆菌的体内诱导基因。首先构建了结核分枝杆菌基因组质粒表达文库 ,库容量为 1 0 2× 1 0 5CFU。再用经过结核分枝杆菌和大肠杆菌的裂解产物吸附过的结核病人血清 ,通过原位免疫印迹来筛选基因组表达文库 ,共获得 1 6个阳性克隆。对阳性克隆进行测序和生物信息学分析 ,发现该 1 6个阳性克隆可能包含 2 2个开放阅读框 (ORF)。按照功能将其分为 7类基因 :脂类代谢 2个、信号途径 5个、PE/PPE蛋白家族 2个、中间产物与能量代谢 6个、细胞壁与细胞处理 1个、假想蛋白 4个和与牛型分枝杆菌定向进化同源的 2个 ,其中部分基因可能与毒力相关。

关键词：结核分枝杆菌体内诱导抗原技术药物靶标毒力

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体内诱导抗原技术筛选病原菌体内诱导抗原的研究进展

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微生物学免疫学进展 2023年第3期51卷 69-76页

作者：周洁(综述) 赵飞骏(审校) 南华大学衡阳医学院病原生物学研究所特殊病原体防控湖南省重点实验室湖南衡阳421001

体内诱导基因是病原菌在宿主体内能够表达而体外培养时却不能表达的功能基因,其对病原体在宿主体内的生存和致病具有重要意义。体内诱导抗原技术(in vivo induced antigen technology,IVIAT)已广泛应用于筛选病原体体内诱导基因,相较于... 详细信息

体内诱导基因是病原菌在宿主体内能够表达而体外培养时却不能表达的功能基因,其对病原体在宿主体内的生存和致病具有重要意义。体内诱导抗原技术(in vivo induced antigen technology,IVIAT)已广泛应用于筛选病原体体内诱导基因,相较于其他用于筛选体内诱导基因的技术,IVIAT具有无需动物模型、检测病原菌在不同感染阶段产生的抗原等独特优势。IVIAT鉴定出的体内诱导抗原对病原体在宿主中的毒力、代谢及存活具有重要意义。现就IVIAT的原理、IVIAT筛选出的人类疾病相关病原菌的体内诱导抗原及其功能研究等作一概述。

关键词：体内诱导抗原技术体内诱导基因体内诱导抗原细菌毒力基因基因组表达文库

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体内诱导抗原技术及其在病原性细菌毒力基因研究中的应用

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畜禽业 2009年第12期20卷 14-16页

作者：刘燕李继祥西南大学荣昌校区动物医学系重庆荣昌402460

体内诱导抗原技术是筛选病原性细菌毒力基因的重要方法,自2000年建立以来,不断应用于结核分支杆菌和沙门氏菌等多种病原性细菌的研究。该文对其原理及在病原性细菌毒力基因研究中的应用进行综述,并分析其优缺点。

关键词：体内诱导抗原技术病原性细菌毒力基因

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应用体内诱导抗原技术筛选Ⅰ型鸭疫里默氏杆菌体内特异性表达基因

应用体内诱导抗原技术筛选Ⅰ型鸭疫里默氏杆菌体内特异性表达基因

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中国畜牧兽医学会2009学术年会

作者：袁建丰覃宗华吕敏娜吴彩艳余劲术孙铭飞蔡建平谢明权广东省农科院兽医研究所广东省兽医公共卫生公共实验室

IVIAT是利用感染过目标病原的宿主血清来鉴定在宿主体内特异性表达的细菌毒力因子和抗原基因。其基本原理和技术步骤是采集已感染者的血清,以体外培养的病原菌吸附后,血清中存有针对感染过程中特异性表达的抗原的抗体。以此抗体对病原... 详细信息

IVIAT是利用感染过目标病原的宿主血清来鉴定在宿主体内特异性表达的细菌毒力因子和抗原基因。其基本原理和技术步骤是采集已感染者的血清,以体外培养的病原菌吸附后,血清中存有针对感染过程中特异性表达的抗原的抗体。以此抗体对病原菌的表达文库进行筛选,从而获得病原菌在体内诱导表达的毒力因子和抗原基因。本研究的目的旨在利用体内诱导抗原技术(in vivo induced antigentechnology,IVIAT)分析、鉴定RA的体内表达基因谱,试图初步鉴定RA的毒力因子及其表达产物,为进一步确定RA的致病机理和解析保护性抗原组(repertoir)提供实验和理论经验。材料与方法:7日龄雏鸭攻毒后每日采集血清用ELSIA测定其血清效价,确定最佳康复鸭血清采集时间。康复鸭血清经过与鸭疫里默氏杆菌和基因组表达文库宿主菌的全菌、超声裂解菌液以及热变性抗原的吸附后4℃保存备用。鸭疫里默氏杆菌基因组DNA部分酶切后选择500～2000bp片段参照分子克隆方法构建基因组表达文库。利用吸附后的康复鸭血清骤对基因组表达文库进行免疫筛选(具体步骤参考分子克隆)。重复筛选均为阳性的克隆送上海生工生物工程公司测序。序列相似性搜索分析采用NCBI BLASTN,基因预测和ORFs分析采用***、FGENESB和NCBI ORF Finder,ORFs推导氨基酸序列比对采用NCBI PSI-BLAST,初步鉴定获得基因的功能。结果与讨论:为确定采集阳性血清的时间窗口,连续采集攻毒后12 d的血清,ELISA检测结果表明抗体水平在攻毒后第5天降至最低,随后缓慢升高,在12d达到最高。康复鸭血清经过RA和表达宿主菌的全菌吸附、超声裂解菌液、吸附以及热变性抗原的吸附后,ELISA方法检测每个步骤的吸附效果,结果显示吸附后的血清与菌体裂解抗原的反应明性显降低,达到了IVIAT文库血清的要求。对转化后的基因组表达文库菌液进行倍比稀释铺板,37℃过夜培养后,对生长的转化克隆进行计数,结果显示库容量约为10000个CFU。随机挑选的50个可能含有重组质粒的菌落扩大培养后,PCR鉴定结果显示插入片段大小基本位于400～2000kb之间,且85%以上分布在1000bp以上。通过原位免疫印迹实验用吸附后的康复血清对RA基因组表达文库进行免疫筛选,共筛选到阳性克隆23个,反复多次筛选后得到了12个强阳性克隆。对12个阳性克隆进行测序,获得的DNA序列经BLAST相似性搜索分析,结果显示除了RIV2部分DNA序列与RA的ompA基因相似性较高外,其余均无明显相似的序列存在,从而表明筛选获得的序列基本为新发现的RA基因序列。对克隆片段进行ORFs搜索,并对其进行PSI-BLAST分析共发现20个有意义的ORF。对20个ORF按功能可初步分为5类:2个信号途径基因,9个中间产物与能量代谢基因,5个细胞膜相关基因,1个细胞分化基因,3个保守假想蛋白基因。

关键词：体内诱导抗原技术抗原基因毒力因子鸭疫里默氏杆菌基因组表达文库特异性表达

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利用体内诱导抗原技术检测胸膜肺炎放杆菌体内表达基因

利用体内诱导抗原技术检测胸膜肺炎放杆菌体内表达基因

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第三届猪病防控学术研讨会

作者：刘慧芳刘思国王春来司微王聃杜艳芬赫明雷常月红中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨 150001

本研究利用体内诱导抗原技术(IVIAT)对胸膜肺炎放线杆菌体内表达的基因进行了研究.首先将我们收集到的5份感染了APP1的猪血清混合,分别吸附体外培养的.APP1和大肠杆菌DE3的全菌及全菌的裂解物,以充分去除体外表达蛋白的抗体,经过该吸附... 详细信息

本研究利用体内诱导抗原技术(IVIAT)对胸膜肺炎放线杆菌体内表达的基因进行了研究.首先将我们收集到的5份感染了APP1的猪血清混合,分别吸附体外培养的.APP1和大肠杆菌DE3的全菌及全菌的裂解物,以充分去除体外表达蛋白的抗体,经过该吸附过程后OD405分别由原来的0.927和0.239降低为0.196和0.078,表明混合血清得到了很好的吸附.同时,将APP1 基因组DNA以Bsp1431进行酶切,回收500bp-2000bp的片段,与经过BamHI酶切的ET30a/b/c进行连接,构建了APP1基因组质粒表达文库,库容量为2.0×105CFU,用吸附后的血清通过菌落原位免疫杂交来筛选该基因组表达文库,筛选了3000个菌落初步获得16个阳性克隆,通过再次筛选最后确定获得12个阳性克隆.本研究为抗病原菌药物、疫苗乃至新的诊断试剂的开发提供依据.

关键词：猪病胸膜肺炎放线杆菌体内诱导抗原技术菌落原位免疫杂交

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利用体内诱导抗原技术检测胸膜肺炎放线杆菌体内表达基因

利用体内诱导抗原技术检测胸膜肺炎放线杆菌体内表达基因

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第三届猪病防控学术研讨会

作者：刘慧芳刘思国王春来司微王聃杜艳芬赫明雷常月红中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室

本研究利用体内诱导抗原技术(IVIAT)对胸膜肺炎放线杆菌体内表达的基因进行了研究。首先将我们收集到的5份感染了APP1的猪血清混合,分别吸附体外培养的APP1和大肠杆菌DE3的全菌及全菌的裂解物,以充分去除体外表达蛋白的抗体,经过该吸附... 详细信息

本研究利用体内诱导抗原技术(IVIAT)对胸膜肺炎放线杆菌体内表达的基因进行了研究。首先将我们收集到的5份感染了APP1的猪血清混合,分别吸附体外培养的APP1和大肠杆菌DE3的全菌及全菌的裂解物,以充分去除体外表达蛋白的抗体,经过该吸附过程后OD405分别由原来的0.927和0.239降低为0.196和0.078,表明混合血清得到了很好的吸附。同时,将APP1基因组DNA以Bsp1431进行酶切,回收500bp-2000bp的片段,与经过Bam HI酶切的pET30a/b/c进行连接,构建了APP1基因组质粒表达文库,库容量为2.0×10～5CFU,用吸附后的血清通过菌落原位免疫杂交来筛选该基因组表达文库,筛选了3000个菌落初步获得16个阳性克隆,通过再次筛选最后确定获得12个阳性克隆。本研究为抗病原菌药物、疫苗乃至新的诊断试剂的开发提供依据。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌体内诱导抗原技术菌落原位免疫杂交

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利用体内诱导抗原技术检测胸膜肺炎放线杆菌体内表达基因

利用体内诱导抗原技术检测胸膜肺炎放线杆菌体内表达基因

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：刘慧芳刘思国王春来司微王聃杜艳芬赫明雷常月红中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室

本研究利用体内诱导抗原技术(IVIAT)对胸膜肺炎放线杆菌(APP)体内表达的基因进行了研究。.将收集到的5份感染了APP1的猪血清混合,分别吸附体外培养的APP1和大肠杆菌DE3的全菌及全菌

关键词：体内诱导抗原技术胸膜肺炎放线杆菌阳性克隆体内表达

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应用体内诱导抗原技术筛选I型鸭疫里默氏杆菌体内特异性表达基因

应用体内诱导抗原技术筛选I型鸭疫里默氏杆菌体内特异性表达基因

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第二届全国禽病分子生物技术青年学者论坛

作者：袁建丰覃宗华蔡建平谢明权广东省农科院兽医研究所广东省兽医公共卫生公共实验室广州 510640

目的：利用体内诱导抗原技术(IVIAT)分析、鉴定RA的体内表达基因谱，初步鉴定RA的毒力因子及其表达产物。方法：7日龄雏鸭攻毒后每日采集血清用ELSIA测定其血清效价，确定最佳康复鸭血清采集时间。康复鸭血清经过与鸭疫里默氏杆菌和基... 详细信息

目的：利用体内诱导抗原技术(IVIAT)分析、鉴定RA的体内表达基因谱，初步鉴定RA的毒力因子及其表达产物。方法：7日龄雏鸭攻毒后每日采集血清用ELSIA测定其血清效价，确定最佳康复鸭血清采集时间。康复鸭血清经过与鸭疫里默氏杆菌和基因组表达文库宿主菌的全菌、超声裂解菌液以及热变性抗原的吸附后4℃保存备用。鸭疫里默氏杆菌基因组DNA部分酶切后选择500-2000bp片段参照分子克隆方法构建基因组表达文库。利用吸附后的康复鸭血清对基因组表达文库进行免疫筛选。重复筛选均为阳性的克隆基因，初步鉴定获得基因的功能。结果：ELISA检测结果表明抗体水平在攻毒后第5d降至最低，随后缓慢升高，在12d达到最高;吸附后的血清与菌体裂解抗原的反应明显降低，达到了IVIAT文库血清的要求。结论：筛选获得的序列基本为新发现的RA基因序列。研究结果为进一步确定RA的致病机理和解析保护性抗原组(repertoir)提供了实验和理论经验。

关键词：鸭疫里默氏杆菌毒力因子基因序列体内诱导抗原技术

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利用IVIAT技术筛选鸡白痢沙门菌体内感染相关因子及pSPI12质粒的鉴定与IpaJ蛋白的功能分析

利用IVIAT技术筛选鸡白痢沙门菌体内感染相关因子及pSPI12质粒的...

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作者：李求春扬州大学

学位级别：博士

鸡白痢沙门菌多侵害20日龄以内的幼雏,引起白色下痢,病死率极高。成年鸡感染后虽然不会出现典型的临床症状,但是长期处于带菌状态。在成年鸡的脾脏和生殖道内,细菌可以存活40周以上。在性成熟时期,细菌能侵入卵巢和输卵管,垂直传播给下... 详细信息

鸡白痢沙门菌多侵害20日龄以内的幼雏,引起白色下痢,病死率极高。成年鸡感染后虽然不会出现典型的临床症状,但是长期处于带菌状态。在成年鸡的脾脏和生殖道内,细菌可以存活40周以上。在性成熟时期,细菌能侵入卵巢和输卵管,垂直传播给下一代。由于该菌能水平传播和垂直传播,对养禽业可造成极大的危害。目前,在西方发达国家该病已经被消灭或基本消灭,然而在个别小的禽群中仍有发生,国内禽群鸡白痢的爆发仍较多。寻求鸡白痢沙门菌的致病基因对于了解其致病机理及有效地防治鸡白痢具有重要的意义。本研究运用IVIAT(in vivo induced antigen technology)筛选和鉴定了鸡白痢沙门菌的感染相关因子,为全面认识鸡白痢沙门菌的致病机理提供了基础。沙门菌毒力质粒在细菌致病过程中发挥着重要的作用,本研究从鸡白痢沙门菌分离鉴定了一个新的质粒pSPI12,并分析了该质粒上唯一的毒力相关基因ipaJ的功能,为深入了解细菌早期的感染机制提供了有利的材料。 1.鸡白痢沙门菌S06004基因组表达文库的构建作为禽的主要病原菌之一,鸡白痢沙门菌的致病机理仍不是很清楚。本实验采用IVIAT(体内抗原诱导技术)筛选鸡白痢沙门菌的体内感染相关因子,以了解细菌体内的基因表达情况。首先,要构建鸡白痢沙门菌的基因组表达文库。将S06004的基因组用Sau3AI酶切后,回收大小在0.1 kb-4 kb的片段。同时用BamHI酶切原核系列表达载体(pET30a,b,c),去磷酸化后,回收线性载体片段。将基因组酶切的片段按适当的比例与原核表达载体连接后,转化大肠杆菌DH5α,挑取部分转化子,液体培养后提取质粒,用载体特异性引物分析插入片段的大小分布和片段的插入率。然后从平板上提取质粒,并将其转化大肠杆菌BL21(DE3),构建了S06004基因组的原核表达文库。 2.利用IVIAT技术筛选鸡白痢沙门菌的感染相关因子获取了十份感染了鸡白痢沙门菌的阳性血清,混合后分步与S06004体外培养状态下表达的抗原结合去除相应的抗体,同时利用间接ELISA检测吸附效果。然后将经过吸附处理的血清与S06004基因组表达文库进行免疫筛选,经初次筛选和二次筛选以后,共筛选出45个阳性克隆。对阳性克隆测序后,分析其中所包含的蛋白序列。筛选获得的蛋白涉及生物大分子合成和代谢、转运蛋白、调控因子、能量代谢相关蛋白及功能未知蛋白等,反映了细菌在体内感染过程中,除毒力基因的表达外,细菌需要表达相关蛋白维持正常的生长代谢和应对体内不断变化的体内环境,为揭示细菌的体内活动提供了依据。 3.实时荧光定量PCR检测鸡白痢沙门菌S06004感染相关因子的体内外表达差异根据IVIAT筛选获得的阳性克隆的序列和蛋白序列同源比对结果,设计了11对S06004感染相关因子(traV、gatD、pbpC、stbC、deoR、emrB、dapA、phoQ、trkH、adhE、yhaN)的检测引物,同时以鸡伤寒沙门菌gmk基因作为内参。提取鸡白痢沙门菌S06004体外液体LB培养的总RNA,反转录成cDNA;以SPF鸡为动物模型,采用静脉注射的方式将体外培养的S06004细菌免疫,感染后在不同时间段采血,从血液中收集细菌,提取总RNA,反转录成cDNA,利用荧光定量PCR比较感染因子在体内外培养时mRNA的表达水平差异。结果表明:个别基因表现出很高的表达量,如phoQ;部分基因表达呈持续上升趋势如gatD;traV、dapA、deoR、emrB和trkH呈先升后降趋势;adhE、pbpC和stbC呈下降趋势;yhaN呈先降后升趋势。反映了各感染相关因子在体内感染不同时间段mRNA水平并不一致,其表达水平相对于体外培养时有不同程度的上调。 4.鸡白痢沙门菌pSPI12质粒的分离与序列分析利用抑制差减杂交的方法,构建了鸡白痢沙门菌与肠炎沙门菌的差减文库,筛选获得了鸡白痢沙门菌的特异核苷酸序列。部分序列拼接形成ipaJ基因与猪霍乱沙门菌C500减毒株质粒pSFD10中的ipaJ高度同源。为了验证鸡白痢沙门菌ipaJ基因是否存在于类似的质粒上,我们将卡那霉素抗性基因插入鸡白痢沙门菌S06004株的ipaJ基因中,构建了插入突变株SIM12。从突变株中提取质粒,转化大肠杆菌DH5α,卡那霉素抗性筛选阳性克隆,从中提取质粒获得了携带ipaJ基因的质粒pSPI12,将质粒构建到pMD18T载体上测序分析获得了pSPI12的完整序列和图谱。同源性分析显示pSPI12和pSFD10高度同源,两者都含有一个毒力相关基因ipaJ。PCR鉴定结果显示本室保存的105株鸡白痢沙门菌分离株都含有该基因,除了猪霍乱沙门菌C500疫苗株外,其它猪霍乱沙门菌

关键词：鸡白痢沙门菌 pSPI12 ipaJ 体内诱导抗原技术感染相关因子实时荧光定量PCR

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