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入胞抑制剂Myrcludex-B合成肽对HBV感染HepaRG细胞体外感染模型的抑制作用研究

中华肝脏病杂志 2020年第6期28卷 499-503页

作者：杨佳奇李红山西医科大学第一临床医学院太原030001 山西医科大学第一医院太原030001

目的建立乙型肝炎病毒(HBV)阳性血清体外感染人肝癌细胞(HepaRG)的实验模型,并探索入胞抑制剂Myrcludex-B在体外感染模型中对HBV的抑制作用。方法将诱导成熟的HepaRG细胞分成加聚乙二醇(PEG)的感染组和无PEG的感染组,再将两种感染组分... 详细信息

目的建立乙型肝炎病毒(HBV)阳性血清体外感染人肝癌细胞(HepaRG)的实验模型,并探索入胞抑制剂Myrcludex-B在体外感染模型中对HBV的抑制作用。方法将诱导成熟的HepaRG细胞分成加聚乙二醇(PEG)的感染组和无PEG的感染组,再将两种感染组分别分为添加Myrcludex-B肽段的处理组和不添加Myrcludex-B肽段的对照组,用HBV DNA阳性患者的血清对细胞进行感染。取细胞上清液,用荧光定量PCR检测上清液中HBV DNA的表达量,用化学荧光法检测细胞上清液中HBsAg、HBeAg的含量。两组间计量资料不服从正态分布的采用秩和检验,服从正态分布的采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果在处理组中,加PEG感染组和不加PEG感染组的病毒滴度分别为(103877.00±49013.24)拷贝/ml、(5050.09±631.26)拷贝/ml;在对照组中,加PEG感染组和不加PEG感染组的病毒滴度分别为(116188.57±50957.19)拷贝/ml、(5119.34±1102.43)拷贝/ml,两组中加PEG感染组的病毒滴度显著高于不加PEG感染组(P<0.05),差异有统计学意义。在加PEG的感染组中,加肽段处理组和无肽段对照组的病毒滴度分别为(103877.34±49013.24)拷贝/ml、(116188.57±50957.19)拷贝/ml,加肽段处理组病毒滴度明显下降(P<0.05),差异有统计学意义;该组0、1、2、3 d上清液中HBsAg的含量均为阳性,且0 d上清液中加肽段处理组的HBsAg较无肽段对照组呈明显下降趋势。结论用添加PEG的HBV DNA阳性血清体外感染HepaRG细胞的实验模型是可行的,且在该试验模型中,入胞抑制剂Myrcludex-B对HBV感染存在一定的抑制作用。

关键词：肝炎病毒,乙型入胞抑制剂Myrcludex-B HepaRG细胞体外感染模型

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乙型肝炎病毒体外感染模型的构建、优化及初步应用

乙型肝炎病毒体外感染模型的构建、优化及初步应用

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作者：赵菁华厦门大学

学位级别：博士

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是危害人类健康的重要公共卫生问题，尽管现有的预防性疫苗已显著减少了新发HBV感染，全球仍有约2.4亿的慢性HBV感染者需要得到有效的治疗。鉴于现有慢乙肝治疗药物只能控制病情发展而难以实... 详细信息

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是危害人类健康的重要公共卫生问题，尽管现有的预防性疫苗已显著减少了新发HBV感染，全球仍有约2.4亿的慢性HBV感染者需要得到有效的治疗。鉴于现有慢乙肝治疗药物只能控制病情发展而难以实现临床治愈，发展更加有效的Anti-HBV新药是当前HBV的研究重点方向。建立和发展能实现HBV完整生命周期的细胞和动物模型对Anti-HBV治疗新技术的发展至关重要。其中，支持HBV感染和复制的细胞模型是研究HBV与宿主相互作用、筛选和评估HBV感染治疗药物、评估抗体中和活性的重要工具。除原代肝细胞外，分化的HepaRG细胞与外源表达HBV功能性受体人钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白（Sodium taurocholate cotransportingpolypeptide，NTCP）的HepG2细胞(HepG2-NTCP)是目前最为常用的两种HBV易感细胞，但现有基于上述两种细胞的体外HBV感染系统尚存在感染效率低、操作繁琐等不足，有待进一步改进。本研究拟通过构建新的HBV易感细胞株、筛选能增强HBV感染的小分子促进剂和优化感染条件等手段建立更为高效的HBV细胞感染模型，并初步应用于Anti-HBV药物的筛选评估和慢性乙肝病人血清病毒感染性与其治疗应答相关性的探索。\n 本研究分为两个部分，分别对基于HepG2-NTCP和HepaRG的HBV体外感染模型进行系统优化和应用探索。其中第一部分针对是HepG2-NTCP细胞模型的构建、优化和应用。人钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白是HepG2细胞中缺少的HBV功能性受体。2012年，Huan Yan等最早发现在HepG2、Huh7等人肝癌细胞株中外源性表达NTCP可使其获得HBV易感性，为构建新的HBV体外感染模型奠定了基础。但此前报道的基于HepG2-NTCP细胞株的体外感染模型感染效率较低，仅为10-20％左右，且对病人血清HBV的易感性较差。本研究从下述三个方面对基于HepG2-NTCP细胞的感染模型进行了系统优化，包括:(1)构建了四环素诱导表达型的HepG2-NTCP细胞株，将NTCP编码序列与IRES驱动的红色荧光蛋白(mCherry)构建于四环素诱导启动子调控的双顺反子表达框中，利用慢病毒系统将该表达框稳定整合至HepG2-TetOn细胞，通过流式细胞分选和细胞克隆化获得了稳定整合的HepG2-2B1细胞株。该细胞株在Doxycycline(Dox)诱导后，能高水平表达NTCP，并支持HBV感染，感染率为30％左右。(2)评估了系列小分子化合物对HBV体外感染的作用。发现采用9-cis-RA和CD437两种维甲酸受体(Retinoic acid receptors，RAR)激动剂类药物处理HepG2-2B1细胞，能显著提高其对HBV的易感性。其中，9-cis-RA需要与DMSO联合使用，而CD437则无需DMSO协同即可大幅提高感染后细胞的HBV抗原(HBeAg和HBsAg)表达水平、HBcAg免疫荧光染色阳性率及细胞内外病毒DNA/RNA水平。(3)优化了感染程序，发现在细胞处于悬浮状态时进行HBV孵育（悬浮感染）可显著提高易感性，并可与药物处理产生协同增强作用。通过以上三个方面的改进，我们建立了基于HepG2-NTCP的HBV高效感染体系，其中CD437处理的悬浮感染条件，可将HBV感染HepG2-2B1细胞的感染率（感染后第12天细胞HBcAg免疫荧光染色阳性率）从34.5％提升到98.3％，同时显著提高（＞5倍以上）感染后细胞的HBsAg、HBeAg分泌水平及胞内HBV RNA（包括pgRNA和total HBV RNA）、HBV DNA（包括core DNA和cccDNA）水平。\n 为研究优化感染条件促进HBV感染的分子机制，笔者采用报告基因方法和mRNA转录组测序分析了药物处理对外源及内源基因表达水平的影响。结果显示，CD437处理可显著增强多种外源启动子活性(CMV、CAG、SV40、CMVTRE3G)，从而增强其下游基因表达水平。此外，研究还发现CD437处理能同时增强转染了HBV1.3倍基因组克隆的HepG2细胞的HBeAg和HBsAg表达水平，表明其对HBV启动子也有促进作用。对DMSO、DMSO+9-cis-RA、CD437处理后HepG2-HepG2-2B1细胞进行mRNA转录组测序，结果显示相比于未处理细胞，DMSO、CD437处理均可显著增强包括NTCP在内的多个与HBV感染及早期复制相关的宿主基因的转录水平。笔者构建了药物处理后显著上调的14个基因的cDNA表达质粒，转染HepG2-HepG2-2B1细胞进行感染验证，结果发现其中9个基因(BCL2A1、BCL2L1、NUP155、CHORD

关键词：乙型肝炎病毒体外感染模型小分子化合物维甲酸受体激动剂基因表达免疫应答

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H CM V 兔胚肺细胞体外感染模型的建立

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山东医科大学学报 1999年第2期37卷 109-111页

作者：孟红刘菊华石永玉王健魏海明山东省医学科学院基础医学研究所微生物学研究室

为探讨人巨细胞病毒（ＨｕｍａｎＣｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ，ＨＣＭＷ）ＡＤ１６９毒株体外感染兔胚肺细胞（ＲａｂｂｉｔＥｍｂｒｙｏＬｕｎｇｃｅｌ，ＲＥＬ）的敏感性，建立ＨＣＭＶＡＤ１６９毒株感染模型，将ＨＣＭＶＡＤ１... 详细信息

为探讨人巨细胞病毒（ＨｕｍａｎＣｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ，ＨＣＭＷ）ＡＤ１６９毒株体外感染兔胚肺细胞（ＲａｂｂｉｔＥｍｂｒｙｏＬｕｎｇｃｅｌ，ＲＥＬ）的敏感性，建立ＨＣＭＶＡＤ１６９毒株感染模型，将ＨＣＭＶＡＤ１６９毒株定量接种于ＲＥＬ，观察细胞病理变化；用单克隆抗体－免疫组化方法检测细胞内ＨＣＭＶ抗原；电镜检测细胞内病毒颗粒，用ＥＬＩＳＡ方法检测经ＲＥＬ增殖病毒培养物ＨＣＭＶ抗原滴度，用人胚肺细胞（ＨｕｍａｎＥｍｂｒｙｏＬｕｎｇｃｅｌ，ＨＥＬ）滴定病毒毒力变化。结果表明，接种病毒后，ＲＥＬ于４８ｈ出现细胞肿胀，胞浆内出现折光性颗粒，逐渐变圆、脱落，其病变特征与该病毒在ＨＥＬ增殖出现的病变一致；用免疫组化法在胞浆及其核内查到ＨＣＭＶ抗原；用透射电镜观察，在细胞核内查到大量病毒颗粒；用ＥＬＩＳＡ方法在ＲＥＬ病毒培养物中查到ＨＣＭＶ抗原，抗原滴度与ＨＥＬ增殖的病毒一致；与ＨＥＬ增殖物比较，经ＲＥＬ增殖的病毒培养物毒力降低１００ＴＣＩＤ５０。表明ＲＥＬ是ＨＣＭＶＡＤ１６９毒株的敏感宿主细胞。

关键词：巨细胞病毒感染胚胎肺纤维体外感染模型 REL

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乙型肝炎病毒体外感染模型建立及抗病毒药物评价

乙型肝炎病毒体外感染模型建立及抗病毒药物评价

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作者：龚作炯黄砚青张全荣罗顺德杨丽华武汉大学

该研究部分工作系主要完成者在国外留学期间完成，部分内容为回国后原课题的继续与延伸。国外完成部分已获得原单位知识产权的授权许可。项目主要涉及乙型病毒性肝炎研究热点-体外感染模型的建立及抗病毒药物评价。研究的主要内容：该... 详细信息

标准号: 0701420947

该研究部分工作系主要完成者在国外留学期间完成，部分内容为回国后原课题的继续与延伸。国外完成部分已获得原单位知识产权的授权许可。项目主要涉及乙型病毒性肝炎研究热点-体外感染模型的建立及抗病毒药物评价。研究的主要内容：该研究应用分子生物学技术建立了评价乙型肝炎病毒(HBV)是否存在活动性复制的系列检测方法；建立了HBV体外急性和慢性感染模型；并应用HBV体外感染模型进行了抗病毒药物评价，如：更昔洛韦、阿地福韦、病毒唑、EICAR等；应用该系统对免疫抑制剂(如：地塞米松、环孢素A、霉酚酸酯)对HBV复制的影响进行了评价；在国际上首次证实霉酚酸酯作为免疫抑制剂，具有抑制HBV复制的作用。特点：应用永生化的人肝细胞建立了HBV体外急性和慢性感染模型，该模型具有重复性好，病毒复制环节完整，复制水平高等特点。特别是慢性感染模型的建立，为研究HBV的发病机理，抗病毒药物的筛选、抗病毒药物治疗后病毒变异的发生机理、变异位点的分析，病毒整合机理的研究提供了实验工具。该模型的建立还为抗HBV药物的选择，联合抗病毒策略的制定，HBV基因变异对抗病毒治疗疗效的影响等研究提供了实验体系。应用该HBV体外感染模型，该研究进行了系列抗病毒药物的评价，如：更昔洛韦、阿地福韦、病毒唑、EICAR等；证实了更昔洛韦、阿地福韦、病毒唑抗HBV的活性；评价了免疫抑制剂如：地塞米松、环孢素A、霉酚酸酯对HBV复制的影响；在国际上首次证实霉酚酸酯作为免疫抑制剂，具有抑制HBV复制的作用，为慢性乙肝患者器官移植术后免疫抑制剂的应用提供了新的选择。应用推广情况：近年来该系列研究结果在国内、外学术刊物上及国际会议上发表论文17篇，论文主要集中在本专业权威杂志 Hepatology，***和J. Viral Hepatitis上，其国际影响因子分别为7.304,3.761和2.157。有8篇论文被SCI收录，研究结果频繁被国外其他作者引用，达39次。

关键词：乙型病毒性肝炎抗病毒药物体外感染模型免疫抑制剂

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奈诺沙星在肺炎链球菌体外感染模型中的药动学/药效学研究

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中国感染与化疗杂志 2014年第2期14卷 152-152页

作者：赵苗张菁

奈诺沙旱是·种新型无氟喹诺酮类药物，对革兰阳性菌和革兰阴性菌、厌氧菌及非典型病原体，包括多重耐药的肺炎链球菌和甲氧西林耐药金葡菌均有抗菌作用。

关键词：肺炎链球菌体外感染模型药效学药动学甲氧西林耐药金葡菌氟喹诺酮类药物沙星非典型病原体

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EBV感染树鼩外周血单个核细胞体外模型的研究

EBV感染树鼩外周血单个核细胞体外模型的研究

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作者：冯清源广西医科大学

学位级别：硕士

EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)目前已知与多种恶性肿瘤如霍奇金病、鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,NPC)以及Burkitt淋巴瘤密切相关,然而目前为止仍缺乏相关的典型且理想的实验动物模型,因此对于EBV的特性研究,尤其是EBV在肿瘤发生... 详细信息

EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)目前已知与多种恶性肿瘤如霍奇金病、鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,NPC)以及Burkitt淋巴瘤密切相关,然而目前为止仍缺乏相关的典型且理想的实验动物模型,因此对于EBV的特性研究,尤其是EBV在肿瘤发生发展过程中的情况仍有待进一步探究,这些对于疾病的发生发展以及药物治疗的开发和应用等都有着重要的意义。目前已有研究表明EBV能够在体外感染正常人类B淋巴细胞并可以将他们转化为永生化的类淋巴母细胞系(Lymphoblastoid cell lines,LCLs),本研究基于EBV的这种特性,通过研究EBV体外感染树鼩、家兔、大鼠的外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)情况进行对比,旨在探究EBV感染树鼩体外模型的潜力,为进一步研究EBV感染特点、致病机制等奠定基础。目的:本研究通过EBV体外感染树鼩外周血单个核细胞,研究其感染情况及特点,探究体外研究方面树鼩作为EBV感染模型的可行性,为进一步研究EBV感染特点、致病机制等奠定基础。方法:选取成年树鼩20只,通过清醒状态下股静脉取血2.5ml;使用外周血单个核细胞分离液分别分离树鼩外周血单个核细胞。调整细胞密度约1×10～6/ml培养,实验组加入EBV的病毒悬液,调节终浓度为1×10～9copies/ml;空白组加入等量RPMI1640培养液。加入EBV后,定期使用显微镜观察PBMCs的细胞形态等变化、完成细胞计数、实时荧光定量PCR技术检测细胞中EBV拷贝数的变化、RT-PCR检测EBV相关基因的表达、免疫荧光检测EBV相关蛋白表达情况,透射电子显微镜观察细胞中是否含有病毒颗粒。结果:EBV感染后,大部分树鼩PBMCs能够被EBV成功感染。EBV成功感染的树鼩PBMCs呈聚集成团、形态变大变圆等表现;EBV感染后的树鼩PBMCs细胞数目增多,细胞重新开始增殖,增长率在2小时达到最高值;感染后细胞中EBV病毒载量拷贝数上升,呈波动趋势,最后维持一定浓度;感染后的树鼩PBMCs能够检测到EBV相关基因及相关蛋白的表达。透射电子显微镜能够在感染后的细胞中观察到疱疹样病毒颗粒存在。结论:EB病毒体外能够感染树鼩外周血单个核细胞,感染后细胞具备成为EBV相关体外模型潜力;感染后的细胞体外生存时间延长,并具备LCLs部分特征。

关键词： EB病毒树鼩外周血单个核细胞体外感染模型

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入胞抑制剂依折麦布对乙型肝炎病毒抑制作用的体外研究

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中华肝脏病杂志 2021年第11期29卷 1041-1045页

作者：杨佳奇李红任姣龙张玲荣赵晓青山西医科大学第一医院太原030001

目的在乙型肝炎病毒(HBV)阳性人血清体外感染人肝癌细胞株(HepaRG)的实验模型中进行依折麦布对HBV的抑制作用研究。方法将成熟HepaRG细胞分成加药物的处理组和不加药物的对照组。在依折麦布预防实验中, 处理组均是在感染前2 h及感染24 ... 详细信息

目的在乙型肝炎病毒(HBV)阳性人血清体外感染人肝癌细胞株(HepaRG)的实验模型中进行依折麦布对HBV的抑制作用研究。方法将成熟HepaRG细胞分成加药物的处理组和不加药物的对照组。在依折麦布预防实验中, 处理组均是在感染前2 h及感染24 h期间对细胞进行药物处理;在依折麦布治疗实验中, 处理组均是在细胞被HBV感染24 h后, 立即用药物对其进行连续6~10 d的处理。用荧光定量PCR方法检测上清液中HBV DNA及细胞内cccDNA的表达量, 用化学发光法检测细胞上清液中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)的含量。多组间差异比较用方差分析, 组间两两对比中服从正态分布的采用t检验, 以P < 0.05为差异有统计学意义。结果依折麦布预防实验显示感染前及感染时加20、60、100 μmol/L依折麦布的处理组与对照组相比, 处理组前2 d上清液HBV DNA含量明显下降(P < 0.05);60 μmol/L依折麦布处理组与对照组相比, 前2 d上清液中HBsAg表达水平明显下降(P < 0.05);100 μmol/L依折麦布处理组与对照组相比, 10 d后细胞内cccDNA表达水平明显降低(P < 0.05)。依折麦布治疗实验显示细胞被感染24 h后, 立即添加60 μmol/L依折麦布处理10 d, 细胞中cccDNA含量明显低于对照组(P < 0.05)。结论无论是在预防实验还是治疗实验中, 入胞抑制剂依折麦布对HBV的感染均存在一定的抑制作用。

关键词：乙型肝炎病毒依折麦布入胞抑制剂体外感染模型

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介绍一种新的肺组织体外固定液

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中华病理学杂志 2008年第11期37卷 787-788页

作者：夏靖燕徐峰傅燕飚浙江大学医学院附属第二医院放疗科杭州310009 浙江大学医学院附属第二医院呼吸科杭州310009 浙江大学医学院附属第二医院病理科杭州310009

介绍一种新型的软组织固定液：羟已基哌嗪乙磺酸-谷氨酸介导的具有保护作用的有机溶剂（hepes-glutamic acid buffer mediated organic solvent protection effect，HOPE溶液）。我们将该溶液用于肺组织体外感染模型的保存收到了很好的... 详细信息

介绍一种新型的软组织固定液：羟已基哌嗪乙磺酸-谷氨酸介导的具有保护作用的有机溶剂（hepes-glutamic acid buffer mediated organic solvent protection effect，HOPE溶液）。我们将该溶液用于肺组织体外感染模型的保存收到了很好的效果。

关键词：体外感染模型组织固定液肺组织 buffer effect 有机溶剂保护作用 HOPE

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四种冲洗剂对根管内粪肠球菌清除效果的体外实验

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中华口腔医学杂志 2007年第4期42卷 223-224页

作者：王冬梅高学军沈嵩北京大学口腔医学院.口腔医院牙体牙髓科 100081

目的比较常用的根管冲洗剂对根管内粪肠球菌感染的清除效果。方法建立粪肠球菌根管内感染模型,实验组用4种常用的化学冲洗剂、对照组用0.9%NaCl 溶液冲洗根管。冲洗前、后计数根管内的细菌量,检测残余细菌并观察72h 细菌复苏情况。结果... 详细信息

目的比较常用的根管冲洗剂对根管内粪肠球菌感染的清除效果。方法建立粪肠球菌根管内感染模型,实验组用4种常用的化学冲洗剂、对照组用0.9%NaCl 溶液冲洗根管。冲洗前、后计数根管内的细菌量,检测残余细菌并观察72h 细菌复苏情况。结果化学冲洗剂的杀菌效果明显好于0.9%Nacl 溶液(P<0.05),2.5%次氯酸钠及2%氯己定明显好于3% H_2O(P<0.05)。结论 2%氯己定、2%氯胺-T 的杀菌效果与2.5%次氯酸钠相似,3%H_2O 杀菌效果较弱。

关键词：肠球菌粪根管冲洗剂体外感染模型

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猪肺炎支原体黏附猪肾细胞模型建立及体外黏附特性研究

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畜牧兽医学报 2013年第5期44卷 772-777页

作者：张旭冯志新武昱孜车巧林刘茂军熊祺琰华利忠李彬邵国青江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心南京210014

为了建立猪肺炎支原体全菌体外黏附细胞模型及初步探讨其对不同细胞系的黏附特性,选取实验室保存的Mhp野毒分离株(XLW-1、XLW-2、XLW-3、WX株)、国际标准株232、弱毒疫苗168株感染猪肾传代细胞系(PK15),同时利用本实验室已建立的Mhp间... 详细信息

为了建立猪肺炎支原体全菌体外黏附细胞模型及初步探讨其对不同细胞系的黏附特性,选取实验室保存的Mhp野毒分离株(XLW-1、XLW-2、XLW-3、WX株)、国际标准株232、弱毒疫苗168株感染猪肾传代细胞系(PK15),同时利用本实验室已建立的Mhp间接免疫荧光检测方法检测各菌株对PK15的黏附特性。结果发现,不同Mhp株全菌均可黏附PK15细胞,但不同菌株黏附能力存在差异。其黏附能力强弱依次为野毒株XLW-1株、WX株、疫苗168株、国际标准株232、野毒株XLW-2、XLW-3株。选取黏附能力较强的XLW-1株,继续探讨其对猪原代气管上皮细胞、猪肺泡上皮细胞(SJPL)、猪肺泡巨噬细胞(3D4/31)、恒河猴肾细胞(Marc145)的黏附性。XLW-1株能在体外黏附不同的细胞系,但对不同细胞的黏附能力存在差异,其中对猪源的原代分离的猪气管上皮细胞、SJPL细胞系、3D4/31细胞系黏附性均较强,而对非猪源的Marc145细胞系的黏附性较弱。本研究结果表明,Mhp全菌体可在多种细胞系上建立黏附感染模型,不同Mhp菌株的黏附能力存在着差异,且同一菌株对不同细胞系的黏附特性也存在差异。

关键词：猪肺炎支原体体外感染模型黏附特性

来源：评论

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