促性腺激素释放激素受体（Gn RHR）是G蛋白偶联受体家族的成员,其特征是有一个七次跨膜螺旋结构,它在垂体促性腺激素细胞以及乳腺,卵巢和前列腺等的表面表达。促性腺激素释放激素（Gn RH）与其结合后,该受体与第二信使G蛋白结合,受体的激活最终导致促性腺促黄体生成激素和促卵泡激素的释放。此受体结构的研究可为突破该受体的结构解析瓶颈做铺垫,了解其具体下游作用机制做铺垫,以该受体为靶标的药物开发提供一定的理论基础,同时当此受体作为一种药物靶标时,为前列腺癌、子宫内膜异位症、青春期早熟等相关疾病的治疗提供新的思路与策略。本课题欲对Gn RHR进行表达纯化与功能性研究。针对受体蛋白目的基因进行克隆设计和克隆优化,选择不同框架构建分子克隆,并对目的蛋白进行表达纯化实验检测其蛋白表达情况。然后进行功能性研究实验,针对基因质粒进行分子突变,欲构建成对配体响应性良好的蛋白受体质粒,通过报告基因实验检验其活力。若检验受体蛋白性质良好,热稳定性高、活力性强、单一构象等,再进行蛋白表达纯化实验检测其表达情况。课题针对目的基因设计了几个框架,完成了p Fast Bac-HA-Bril-h Gn RHR-tev-OMBP-MBP-H8、pc DNA3-HA-Flag-H10-tev-Bril-h Gn RHR、p Fast Bac-HAh Gn RHR-tev-OMBP-MBP质粒的构建。验证了受体蛋白的下游通路为NFAT,且发现了delta K191、（S186G,delta K191）、（L112F/Q208E/L300V/D302E,delta K191）、（delta K191,F130W）、（delta K191,F272Y）、（delta K191,F130W,F272Y）、P303A突变下的蛋白受体对配体的响应性增强。蛋白的表达纯结果不大理想,蛋白大量聚集性质不好产量偏低,故待未来进一步摸索探究,找出更适合的框架更有利的突变,使其产量更高、性质更稳定。
下丘脑-垂体-性腺轴是人体内关键的负反馈调控途径,主要参与调节性特征及生殖功能,该途径紊乱会导致不孕不育、子宫肌瘤、乳腺癌、前列腺癌等诸多重大疾病的发生。促性腺激素释放激素Gn RH是HPG轴的重要调控者之一,该激素作用的靶受体为促性腺激素释放激素受体GnRH1R。因此,对Gn RH-GnRH1R系统的研究是治疗上述重大疾病的关键,GnRH1R受体也从而成为最具潜力和希望的药物靶标之一。一直以来,由于缺乏对GnRH1R结构信息的相关报道,药物配体与GnRH1R受体的作用机制未被充分阐明,迫切需要以结构为研究基础推动药物研发进程。我们从NCBI数据库中挖掘出人源GnRH1R基因,在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中对目的基因进行了表达;引入融合蛋白和定点突变改善野生型GnRH1R的表达;利用亲和层析柱和分子排阻色谱柱对目的蛋白进行分离与纯化;以脂立方相法对目的蛋白和拮抗剂Elagolix共结晶;利用X射线衍射技术采集复合物晶体数据,通过解析数据得到了晶体结构;以细胞功能实验进一步验证复合物结构信息。本课题主要研究成果如下:(1)在GnRH1R第三个胞内环插入融合蛋白-糖原合成酶PGS后,增加了野生型的表达量;在此基础上引入定点突变,将GnRH1R受体第128位脯氨酸突变位赖氨酸后,目的蛋白在分子排阻色谱柱上峰形明显改善;纯化过程中加入拮抗剂Elagolix使目的蛋白呈现均一稳定的状态,在热稳定性实验中蛋白样品TM值达到83℃。(2)利用脂立方相法成功培养出复合物晶体,通过优化晶体生长条件使晶体尺寸变大,最终在150 m M NHNO、p H 6.0-6.5及PEG400 30-38%的条件下收获了一批高质量的复合物晶体。(3)本课题利用X射线晶体衍射技术成功解析了2.8(?)的GnRH1R-Elagolix复合物晶体结构,首次展示了非激活状态下GnRH1R受体结构及配体结合口袋的详细信息,描绘了受体与配体间的相互作用网络,从分子角度提供了更多结构细节。(4)通过结构分析与细胞功能实验发现了复合物晶体结构种受体的“V形”N端结构与拮抗剂Elagolix共同占据结合口袋的有趣现象。(5)分析受体结构中发挥作用的关键性氨基酸残基,发现残基D138和R139形成的螺旋间盐桥及R139和T265之间的极性相互作用共同限制了GnRH1R激活构象的变化,从而将受体稳定在非活性构象;残基K121和D98与配体Elagolix形成的氢键作用将配体锚定在结合口袋中。(6)发现了复合物结构中与经典型DRY motif、PIF motif、NPxx Y motif存在差异的“非经典型motif”,这些motif共同构成了调控GnRH1R不同构象间变化的微开关。本课题以上市拮抗剂药物Elagolix为配体,采用共结晶的方法得到了复合物晶体,首次成功解析了2.8(?)分辨率的GnRH1R-Elagolix复合物结构,从原子水平阐述了配体与GnRH1R的结合模式。因此,本课题的研究内容对于作用于Gn RH-GnRH1R系统的药物研发具有重要指导意义。
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