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中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志 2025年第2期33卷 89-94页

作者：尹思源周雨同高铭媛丁雷北京中医药大学东方医院北京100078

目的观察通气散对气滞血瘀型暴聋mTOR信号活性的调控作用,探寻治疗感音神经性听力损失的新靶点。方法纳入气滞血瘀型暴聋患者30例,健康志愿者30例,应用Western Blot法检测两组外周血单核细胞PBMC中mTOR、4EBP1和P70S6K蛋白表达水平;暴... 详细信息

目的观察通气散对气滞血瘀型暴聋mTOR信号活性的调控作用,探寻治疗感音神经性听力损失的新靶点。方法纳入气滞血瘀型暴聋患者30例,健康志愿者30例,应用Western Blot法检测两组外周血单核细胞PBMC中mTOR、4EBP1和P70S6K蛋白表达水平;暴聋组在指南常规治疗基础上加服通气散浓缩煎剂,10日观察周期结束,纯音听阈评价疗效,复测mTOR、4EBP1和P70S6K蛋白表达。结果①健康对照组与暴聋组外周血PBMC检测,mTOR、4EBP1和P70S6K蛋白表达有统计学差异(P<0.001)。②暴聋治疗有效18例,无效12例;仅有效组疗后mTOR、4EBP1和P70S6K蛋白表达水平较疗前有统计学差异(P<0.001)。③有效组与无效组在性别、年龄、病程基线水平无统计学差异,但两组耳聋听力分型具有显著差异(P=0.001)。结论通气散可通过激活mTOR信号活性并磷酸化下游靶蛋白参与气滞血瘀型暴聋的治疗,但预期可能受暴聋不同发病机制的影响。

关键词：通气散暴聋突发性聋感音神经性聋信号活性

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核受体Nur77调节转化生长因子TGF-β信号活性的探究

核受体Nur77调节转化生长因子TGF-β信号活性的探究

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作者：林佳城厦门大学

学位级别：硕士

孤儿核受体Nur77是核受体(Nuclear Receptors，NRs)超家族中非常重要的一员。它作为细胞内立早基因的产物，能够响应包括各类生长因子在内的多种刺激。同时，Nur77广泛参与到机体的生理以及病理学过程中，如:糖脂代谢，细胞自噬，炎症... 详细信息

孤儿核受体Nur77是核受体(Nuclear Receptors，NRs)超家族中非常重要的一员。它作为细胞内立早基因的产物，能够响应包括各类生长因子在内的多种刺激。同时，Nur77广泛参与到机体的生理以及病理学过程中，如:糖脂代谢，细胞自噬，炎症发生发展以及肿瘤的生长凋亡等过程。转化生长因子（TransformingGrowth Factorβ，TGF-β）信号通路在体内广泛参与包括糖代谢，脂质代谢，胞外基质的更替，细胞的增殖、分化，组织的纤维化以及肿瘤的发生发展等多种生理以及病理过程的调控。对TGF-β信号通路调控的研究一直是TGF-β研究的重点，但是核受体对TGF-β信号调节的活性和机理尚不清楚。　　本课题在探究核受体与TGF-β之间相互关系的过程中，发现了Nur77能够作为一种新的调控蛋白对TGF-β信号通路进行调控，并揭示了其中的调控机制。我们首先通过报告基因发现并证明了Nur77能够在HepG2细胞中激活TGF-β/Smad3信号通路。研究发现，在所用检测的核受体中，只有Nur77能够显著激活响应TGF-β/Smad3的报告基因CAGA-luc。实验中发现Nur77不仅能够上调本底CAGA-luc的报告基因活性，还能对TGF-β信号带来的激活有上调作用。同时，Nur77带来的这种激活效应能够被TGF-β一型受体抑制剂SB431542部分抑制。　　我们进一步探究Nur77上调TGF-β/Smad3活性的生物学机制。我们通过免疫共沉淀的方法发现，Nur77能够和Smad3有相互作用，其相互作用的结构域为Nur77的AB区域和Smad3的MH2结构域。通过染色质免疫共沉淀实验揭示Nur77能够通过结合Smad3间接结合Smad3的响应原件。因此Nur77通过其自身的转录自激活活性，并通过与Smad3结合，进而激活Smad3靶基因的转录。另外我们发现Nur77可能还通过其他的方式激活Smad3信号。Nur77能够延长Smad3的磷酸化和细胞核内滞留时间，进而延长Smad3的激活时间;另外，Nur77与Smad3之间的相互作用能够破坏Smad3与Smad6之间的相互作用，进而降低了Smad6对Smad3激活的抑制作用。通过RT-PCR和免疫印迹实验，我们发现Nur77能够上调TGF-β所诱导的PAI-1等Smad3靶基凶的表达。　　因此，本研究发现了一种TGF-β信号通路的新的调节蛋白-孤儿核受体Nur77，并揭示了Nur77调节TGF-β/Smad3信号通路新的作用机制。本研究为治疗TGF-β信号通路紊乱所导致的疾病提供了一种潜在的治疗方式。同时，本研究也拓展了Nur77所能参与的细胞信号转导网络，以及Nur77所能够调控的生物学功能。

关键词：病理生理学核受体转化生长因子信号活性生物学机制

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猪RIG-I样受体家族RIG-I、MDA5和LGP2信号功能、相互关系和抗病毒作用研究

猪RIG-I样受体家族RIG-I、MDA5和LGP2信号功能、相互关系和抗病毒...

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作者：李双洁扬州大学

学位级别：博士

天然免疫在宿主抵御病原微生物入侵中的作用非常关键。天然免疫RIG-I样受体家族(RLR)在识别病毒感染,诱导宿主干扰素反应,抵御病毒过程中发挥重要作用。RLR家族包括RIG-I、MDA5和LGP2三个成员。RIG-I和MDA5在识别病原相关分子模式(PAMP)... 详细信息

天然免疫在宿主抵御病原微生物入侵中的作用非常关键。天然免疫RIG-I样受体家族(RLR)在识别病毒感染,诱导宿主干扰素反应,抵御病毒过程中发挥重要作用。RLR家族包括RIG-I、MDA5和LGP2三个成员。RIG-I和MDA5在识别病原相关分子模式(PAMP)后,通过其信号活性域CARDs向下游传递信号,与同样含有CARD结构域的接头分子线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)发生同源相互作用,最终激活转录因子IRF3和NF-κB,促进I型干扰素(IFN)和促炎性细胞因子的表达,并启动干扰素信号级联反应,抵抗病毒的感染。LGP2无信号活性域CARDs,不能向下游传递信号,主要通过调控RIG-I和MDA5活性发挥作用。尽管对人和小鼠RLR有广泛研究,但目前对家畜RLR缺乏系统的研究。本研究分离鉴定了猪RLR家族成员RIG-I、MDA5和LGP2,对其信号功能、相互关系及抗病毒作用进行了系统研究。1、猪RIG-I样受体RIG-I、MDA5和LGP2功能分析及其抗病毒作用研究本研究通过基因克隆,从猪肺泡巨噬细胞(PAM)中分离出了猪RIG-I样受体成员RIG-I、MDA5和LGP2基因,将基因片段连接至pENTR4-MCS中间载体,再通过LR位点特异性重组反应,分别构建出pRIG-I、pMDA5和pLGP2的pcDNA真核表达质粒。经Western-blotting验证,pRIG-I、pMDA5和pLGP2表达的蛋白大小分别为120 kDa、140kDa 和 80kDa。将 pRIG-I、pMDA5 和 pLGP2 分别转染 HEK293T 细胞,发现pRIG-I、pMDA5均有组成性活性,且pMDA5的信号更强,而pLGP2无信号活性。pRIG-I和pMDA5对不同的双链RNA(dsRNA)和病毒刺激有相似的应答信号活性。CRISPR/Cas9方法制备三种猪RLR敲低的PAM和PK15细胞。在pRIG-I和pMDA5敲低PAM和PK15细胞中,与对照细胞相比,dsRNA类似物低分子量poly I:C刺激和病毒VSV、EMCV感染后诱导表达下游基因IFNp、ISG56、ISG60和IL8的转录水平均显著降低。pLGP2虽然无信号活性,但在pLGP2敲低PAM和PK15细胞中,感染或刺激诱导下游基因的转录水平也降低。为进一步确认猪RLR的功能,分别构建pRIG-/-、pMDA5-/-和pLGP2-/-PAM细胞。上述细胞中,低分子量或高分子量polyI:C刺激诱导的IFNβ、ISG56、IL1β、IL8和TNFα的转录水平均显著降低;病毒VSV、EMCV、SeV、H9N2、HSV1复制和基因表达均增加,而病毒诱导下游细胞因子IFNβ、ISG56、IL1β、IL8和TNFα基因的转录水平显著降低;此外,EMCV感染刺激下游转录因子IRF3磷酸化水平和ISG56蛋白表达也显著下调。这些结果表明:ⅰ pRIG-I和pMDA5能感受识别不同RNA和病毒并激活相似细胞信号,与人和小鼠RIG-I/MDA5的选择性识别不同;ⅱ pRIG-I、pMDA5和pLGP2可能都有广谱的抗病毒功能;ⅲ pLGP2可能对pRIG-I和pMDA5信号有相似的调控作用。分别在PAM和Marc-145细胞中过表达pRIG-I、pMDA5和pLGP2,结果表明猪流感病毒H9N2、猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒(JXA1-R株)在三种RLR过表达细胞中的复制与蛋白表达受到显著抑制。pRIG-I和pLGP2在IPEC-J2细胞中过表达也能抑制猪流行性腹泻病毒(YC2014株)的复制。这些结果表明,猪的RIG-I样受体具有广泛抗病毒效应,在抵抗猪流行性病毒感染中发挥着重要作用。2、猪RIG-I样受体LGP2对RIG-I和MDA5信号的调控作用研究猪的LGP2没有信号活性,但我们发现,在pLGP2转染的PAM细胞中,低分子量poly I:C刺激或VSV病毒感染诱导下游基因IFNβ、ISG60、IL8以及TNFα的转录水平升高,且呈LGP2剂量依赖性,表明pLGP2对pRIG-I/pMDA5信号具有正调控作用。pLGP2敲低细胞(PAM和PK15)以及pLGP2-/-PAM中RNA刺激和病毒感染诱导下游基因表达降低也提示pLGP2对pRIG-I/pMDA5信号的正调控作用。为解析pLGP2对pRIG-I和pMDA5信号的单独调控作用,将pLGP2分别转染pRIG-/-和pMDA5-/-PAM细胞,结果显示病毒VSV感染诱导下游IFNβ和ISG56基因转录水平都升高,证明pLGP2对pRIG-I和pMDA5信号均具有相似的正调控作用。机制层面,激光共聚焦显微镜观察和免疫共沉淀试验结果显示,pLGP2在细胞激活后可以与pRIG-I和pMDA5发生相互作用。通过原核表达与蛋白纯化,我们获得了pR

关键词：猪RIG-I样受体基因敲除信号活性调控作用抗病毒转录组测序

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猪源NOD1和NOD2的免疫生物学功能研究及其应用

猪源NOD1和NOD2的免疫生物学功能研究及其应用

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作者：朱美芹扬州大学

学位级别：硕士

哺乳动物在生长发育过程中会不断受到外界环境中病原微生物的侵染,从而它们进化出了比较完善的免疫系统来抵制外界病原体的侵染。免疫系统可分为固有免疫系统和获得性免疫系统,固有免疫系统是机体抵抗外来致病因子入侵的第一道防线,主... 详细信息

哺乳动物在生长发育过程中会不断受到外界环境中病原微生物的侵染,从而它们进化出了比较完善的免疫系统来抵制外界病原体的侵染。免疫系统可分为固有免疫系统和获得性免疫系统,固有免疫系统是机体抵抗外来致病因子入侵的第一道防线,主要是通过模式识别受体(PRRs)识别高度保守的病原相关分子模式(PAMPs),然后再经过细胞中的一系列信号级联反应激活免疫应答的发生。最近的研究显示,作为模式识别受体NOD样受体(NLRs)蛋白家族中最具有代表性的NOD1和NOD2,可以通过识别特异性配体二氨基庚二酸(iE-DAP)和胞壁酰二肽(MDP)而迅速启动固有免疫反应,并能通过激活NF-κB和MAPK等信号传导途径,在机体免疫防御细菌感染中发挥作用;也有报道显示它们可以识别和抵抗病毒感染,虽然具体机制尚不清楚。在畜牧业发展的今天,猪作为一种重要的模式动物,同时也是重要的经济动物,猪的健康与人类的生活需求一脉相连。因此,本研究从猪源细胞中克隆出NOD1和NOD2两种受体编码基因并构建真核表达质粒来鉴定两种受体蛋白表达和信号功能;另外,通过构建NOD1和NOD2基因敲除细胞系进一步鉴定它们在抗病原微生物感染中所发挥的重要作用;最后还通过构建NOD1原核表达质粒进行蛋白纯化和单克隆抗体制备,这为后期进一步研究提供良好的生物材料。具体研究内容分为以下三个部分:1猪源NOD1(pNOD1)、NOD2(pNOD2)基因克隆表达及信号功能鉴定分别从猪的PAM和PK15细胞中RT-PCR扩增出pNOD1和pNOD2两个受体编码基因的全长cDNA序列,pNOD1为2867bp,pNOD2为3039bp。利用Gateway LR克隆技术成功构建了 C-端分别携带2HA和3FLAG标签的真核表达质粒pcDNA-pNOD1和pcDNA-pNOD2。Western blotting检测pNOD1和pNOD2的蛋白表达水平,蛋白大小都约为125kDa,pNOD1的蛋白表达水平较高,而pNOD2蛋白的表达水平较低。对pNOD1和pNOD2信号功能进行鉴定:将真核表达质粒与ELAM(NF-κB)启动子虫萤光素酶报告基因、肌动蛋白启动子海肾荧光素报告基因共转染HEK293T细胞,分别用特异性配体iE-DAP和MDP的刺激,双荧光素酶报告系统检测结果显示,pNOD1具有较强的组成性活性,pNOD1和pNOD2都可以识别相应特异性配体介导下游NF-κB信号活化。同时定量RT-PCR检测pNOD1和pNOD2转染HEK293T细胞下游基因表达,结果表明下游细胞因子IL-8的转录水平明显上升,与下游NF-κB信号活化一致。运用启动子报告基因试验分析pNOD1和pNOD2信号功能关系,没有发现明显的相互抑制或者促进作用。另外,将pNOD2转染NF-κB双荧光素酶信号HEK293报告细胞,用G418筛选获得pNOD2-NF-κB双荧光素酶信号稳定报告细胞。成功构建的pNOD2-NF-κB双荧光素酶稳定报告系为以后的筛选工作提供了有效工具。2 pNOD1和pNOD2抗病原微生物作用鉴定利用CRISPR-cas9技术,分别设计pNOD1和pNOD2基因对应的gRNAs,将gRNAs与慢病毒载体pLentiCRISPRv2连接,对测序正确的gRNAs病毒重组载体进行功能鉴定。将pNOD1和pNOD2表达质粒和对应的gRNAs载体共转染HEK293T细胞,Western blotting检测分析鉴定gRNAs有效性和特异性。将鉴定的gRNAs质粒进行慢病毒包装,病毒上清液分别感染PAM、PK15和IPEC-J2细胞,经过嘌呤霉素的筛选,获得最终存活的基因敲除(KO)稳定细胞系。将构建好的pNOD1、pNOD2KO和载体对照稳定细胞系用于感染鼠伤寒沙门氏菌(PAM)、猪大肠杆菌(PK15)、猪和人流感病毒(PAM)、猪流行性腹泻病毒(IPEC-J2),细菌计数和qRT-PCR结果显示与对照相比,pNOD1 KO和pNOD2 KO细胞系感染以上病原微生物时,细菌增殖以及病毒复制水平都显著上升;其中pNOD1 KO和pNOD2 KO细胞系在感染鼠伤寒沙门氏菌和流感病毒后下游基因主要是抗病毒蛋白基因的转录水平明显下降。这说明pNOD1和pNOD2在宿主受到病原侵染时发挥防御作用的重要性。3重组pNOD1原核蛋白表达及单克隆抗体的制备Gateway LR克隆技术构建原核表达质粒pDest527-pNOD1,并将其转化至大肠埃希菌DE3/BL21,Western-blotting检测到目的蛋白的正确表达,目的重组蛋白主要在沉淀中表达。选择优化表达条件大量培养重组菌并诱导表达蛋白,从细菌沉淀中纯化包涵体,包涵体蛋白用8M尿素变性再用浓度梯度6M、4M、2M、0M尿素依次复性最终得到可溶性蛋白。将目得pNOD1纯化蛋白免疫

关键词：天然免疫 pNOD1 pNOD2 信号活性抗感染单克隆抗体

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一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及成骨诱导方法

一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及成骨诱导方法

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作者：辛江江张坤 250000 山东省济南市中国(山东)自由贸易试验区济南片区港源八路磐升生物产业园3号楼3层

本发明公开了一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物，由以下原料组成：基础培养基、β‑甘油磷酸二钠、磷酸铁锂、纳米硒化铋、泡桐素、成纤维细胞生长因子、重组胰岛素。本发明提供的组合物添加磷酸铁锂、纳米硒化铋以及泡桐素等成分，... 详细信息

标准号: CN113652396B

本发明公开了一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物，由以下原料组成：基础培养基、β‑甘油磷酸二钠、磷酸铁锂、纳米硒化铋、泡桐素、成纤维细胞生长因子、重组胰岛素。本发明提供的组合物添加磷酸铁锂、纳米硒化铋以及泡桐素等成分，能有效提高细胞的成骨增殖分化效率。其中添加的磷酸铁锂、纳米硒化铋提高了脂肪间充质干细胞成骨分化信号活性，能有效促进细胞的成骨分化。泡桐素和成纤维细胞生长因子、重组胰岛素一起促进成骨细胞增殖，缩短细胞分化时间。本发明还提供一种脂肪间充质干细胞成骨诱导方法，采用本发明提供的组合物可以高效稳定的对脂肪间充质干细胞进行成骨诱导分化，保障了脂肪间充质干细胞在骨组织工程中的应用。

关键词：脂肪间充质干细胞成骨诱导磷酸铁锂纳米硒成纤维细胞生长因子成骨分化胰岛素成骨细胞增殖分化骨组织工程基础培养基细胞甘油磷酸细胞分化信号活性有效促进原料组成成骨增殖应用

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泛素结合蛋白UBXN7在制备抗HBV药物中的应用

泛素结合蛋白UBXN7在制备抗HBV药物中的应用

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作者：孙桂鸿郭明雄袁森许佳琪汪敏 430072 湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学

本发明提供了泛素结合蛋白UBXN7在制备抗HBV药物中的应用。本发明通过研究中发现，HBV感染细胞后，促进UBXN7发生泛素化修饰，通过蛋白酶体途径导致UBXN7降解；过表达UBXN7可抑制HBV的s和e抗原分泌，降低其RNA和壳体化DNA表达水平；分... 详细信息

标准号: CN114452374A

本发明提供了泛素结合蛋白UBXN7在制备抗HBV药物中的应用。本发明通过研究中发现，HBV感染细胞后，促进UBXN7发生泛素化修饰，通过蛋白酶体途径导致UBXN7降解；过表达UBXN7可抑制HBV的s和e抗原分泌，降低其RNA和壳体化DNA表达水平；分子机制方面，UBXN7蛋白通过抑制NF‑κB信号活性，抑制HBV复制；在人原代肝细胞PHHs和小鼠体内，分别确证了UBXN7抑制HBV复制的功能和分子机制。本发明首次发现了通过上调UBXN7的表达能够达到治疗HBV相关疾病的目的，因此，可将其应用于制备抗HBV相关疾病的药物。

关键词：分子机制泛素制备复制蛋白酶体途径人原代肝细胞抗HBV药物结合蛋白信号活性壳体化疾病降解小鼠修饰分泌应用蛋白体内发现细胞治疗研究

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一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及成骨诱导方法

一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及成骨诱导方法

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作者：辛江江张坤 450000 河南省郑州市高新技术产业开发区金梭路41号西城科技大厦20层B2003-19号

标准号: CN113652396A

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一种高耐药性Huh-7-DN肝癌细胞株

一种高耐药性Huh-7-DN肝癌细胞株

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作者：吴健丁佳周笑天 200433 上海市杨浦区邯郸路220号

本发明属微生物动物细胞系领域，涉及一种具有高耐药性的人肝癌细胞株Huh‑7‑DN及其建立方法，其保藏编号：CGMCC No.12253。本细胞系为人源性细胞，与其亲本细胞相比，具有以下生物学特性：流式细胞鉴定结果显示其稳定表达CD133/EpCAM... 详细信息

标准号: CN107574152A

本发明属微生物动物细胞系领域，涉及一种具有高耐药性的人肝癌细胞株Huh‑7‑DN及其建立方法，其保藏编号：CGMCC No.12253。本细胞系为人源性细胞，与其亲本细胞相比，具有以下生物学特性：流式细胞鉴定结果显示其稳定表达CD133/EpCAM双阴性的细胞表面分子标记；呈现上皮细胞间质转化（EMT）特征、高豪猪信号活性和高耐药的特点，并高表达多药耐药相关ABCC1转运蛋白。本发明所述的具有高耐药性的人肝癌细胞株Huh‑7‑DN可作为人肝细胞癌多药耐药的研究细胞模型，其具有独特的分子生物学特性、异质性、多态性，有助于应用在揭示人肝细胞癌的耐药机制和化疗药物的筛选。

关键词：人肝癌细胞株高耐药性人肝细胞细胞表面分子标记分子生物学特性动物细胞系生物学特性保藏化疗药物鉴定结果流式细胞耐药机制亲本细胞上皮细胞稳定表达细胞模型信号活性转运蛋白多态性高表达异质性阴性间质微生物筛选细胞转化应用研究

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一种高耐药性Huh-7-DN肝癌细胞株

一种高耐药性Huh-7-DN肝癌细胞株

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作者：吴健丁佳周笑天 200433 上海市杨浦区邯郸路220号

标准号: CN107574152B

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