核酶(Ribozyme)是一类具有催化功能的小分子RNA,核酶开关由核酶和体外筛选出的适体区序列组成,可以通过配体分子与适配体的特异性结合,改变构象影响核酶的催化活性,从而实现对靶基因转录与表达的有力控制。氨基糖苷类抗生素(AAs)残留物广泛存在于食品和环境中,其在生态系统中的循环积累对人类健康造成了很大风险。适配体传感器作为一种新型的生物传感器,是一种以适配体作为生物识别元件进行AAs检测的有效传感方法,具有良好的选择性、特异性和灵敏度,而被广泛运用于生物医学检测的各个行业。本研究构建了一种了基于人工核酶开关的妥布霉素浓度调控的全细胞微生物传感器(tob-HHAz),由妥布霉素适配体和曼氏血吸虫锤头状核酶构成,利用核酶开关与妥布霉素的特异性结合,诱导核酶剪切,释放原有封闭的RBS序列,实现对下游报告基因e GFP的“turn on”调控。这种通过将妥布霉素浓度转化成可视化荧光表达水平的生物传感器,能将所有模块都集成到细胞内一个完整的RNA序列上,并被导入大肠杆菌细胞,实现活细胞内非标记快速识别稳定信号检测,同时减少外界环境的干扰影响。我们首先通过对适配体与核酶之间的通信模块关键区域进行随机序列的设计,建立了一个基于tob-HHAz RNA支架的人工RNA文库,通过在大肠杆菌体内的高通量筛选,获得了对妥布霉素调节敏感的三种RNA结构。进一步通过体外剪切验证和其RNA二级结构的生物信息学分析,获得了C4和H6两种有效的活体细菌传感器。在对牛奶样本的检测中,二者均表现出对妥布霉素很好的浓度依赖性,且传感器的检测线性范围为0-1000 n M,最低检出限(LODs)为40 n M,低于欧盟规定的牛奶中最大残留水平(MRLs);在用于人尿液中妥布霉素的检测中,C4结构可提供30-650 n M的检测线性范围和30n M的最低检出限LODs。以上样本中C4和H6均保留了对妥布霉素检测的高度特异性。这种通过核酶开关对蛋白水平调控的全细胞微生物传感器,通过工程微生物繁殖,便可以轻松而廉价地大规模生产,易于使用和保存的经济与便捷。作为活体传感器,其稳健、简单、敏感的快速评价抗生素能力可以解决现场检测和即时诊断的问题。本研究创建一种完整的和可靠的、基于核糖体开关的全细胞微生物传感器建立方法,其适配体区域的可变性,这为实现进一步从抗生素小分子到重金属离子、氨基酸、蛋白质等物质的高灵敏度和特异性检测也提供了一种普遍适用方法。这将对生物传感器在食品安全控制、环境监测、医学检测中的实用性具有重要意义。
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