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华中科技大学学报（医学版） 2006年第3期35卷 291-293页

作者：郑少萍罗加烈刘长金郑少江樊友珍李之望华中科技大学同济医学院基础医学院神经生物学系华中科技大学同济医学院基础医学院生理学系武汉430030 海南医学院病理学教研室海口571101

目的研究他可林（tacrine）对急性分离的大鼠三叉神经节神经元5-HT。受体的调制作用，探讨tacrine治疗阿尔茨海默病新的可能途径。方法采用全细胞膜片钳技术记录急性分离的三叉神经节神经元膜5-HT。受体介导的电流。结果 83．75％（67... 详细信息

目的研究他可林（tacrine）对急性分离的大鼠三叉神经节神经元5-HT。受体的调制作用，探讨tacrine治疗阿尔茨海默病新的可能途径。方法采用全细胞膜片钳技术记录急性分离的三叉神经节神经元膜5-HT。受体介导的电流。结果 83．75％（67／80）受检细胞对胞外加5-HT（10^-6～10^-3mol／1，）敏感，引起一快去敏感的内向电流，同时应用tacrine（10^-6～10^-4mol／L），5-HT激活电流被不同程度抑制，抑制作用随tacrine浓度的增加而增强，抑制作用的IC50值为3×10^-5mol／L。结论 Tacrine可抑制5-HT诱导的三叉神经节神经元膜电流，这可能是其改善阿尔茨海默病患者学习记忆功能障碍的机制之一。

关键词：他可林 5 -HT3受体全细胞膜片钳记录三叉神经节

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大鼠海马抑制性氨基酸受体的功能调控

大鼠海马抑制性氨基酸受体的功能调控

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作者：章小兵中国科学技术大学

学位级别：博士

γ-氨基丁酸A型受体（GABAAR）和甘氨酸受体是中枢神经系统两大重要的抑制性受体,根据二者在突触内、外所介导的抑制性电导特性的不同,将其介导的抑制效应分为相位性抑制（phasic inhibition）和紧张性抑制（tonicinhibition）两大类。... 详细信息

γ-氨基丁酸A型受体（GABAAR）和甘氨酸受体是中枢神经系统两大重要的抑制性受体,根据二者在突触内、外所介导的抑制性电导特性的不同,将其介导的抑制效应分为相位性抑制（phasic inhibition）和紧张性抑制（tonicinhibition）两大类。突触传递过程中,突触前瞬时释放的高浓度神经递质γ-氨基丁酸（GABA）或甘氨酸,作用并激活分布在突触后区域的GABAAR或甘氨酸受体,导致通道开放而引起氯离子内流,进一步使突触后细胞产生抑制。由于突触释放不是持续存在的,因而突触后受体的激活也是间歇式的。抑制性氨基酸受体的这种间歇式激活所产生的对神经元的抑制称为相位性抑制。抑制性氨基酸受体除了介导由突触内受体产生的相位性抑制以外,近年来的研究越来越关注其介导的另外一种抑制形式——紧张性抑制,紧张性抑制是突触外高亲和力的抑制性氨基酸受体由细胞外本底就持续存在的内源性氨基酸类递质,如GABA、甘氨酸以及牛磺酸等激活而产生。紧张性抑制的特点是,它不像相位性抑制那样严格受突触传递的限制,其介导的抑制效应持续存在,因而,紧张性抑制在控制神经元兴奋性方面被认为比相位性抑制发挥了更为重要的作用。在中枢神经系统海马区域,已经有很多有关GABAAR介导的紧张性抑制的报道。研究认为紧张性抑制不仅参与了海马学习记忆等功能的调节,还参与了像癫痫、经前期焦虑失调等神经系统疾病的发病过程。在海马的不同区域,其介导紧张性抑制的GABAAR亚基也不尽相同,如齿状回颗粒细胞上的δ亚基、CA1和CA3锥体神经元上的α5亚基,甚至是仅由α和β亚基（不含任何第三类亚基）组成的功能性GABAAR等都参与了海马神经元紧张性抑制的调节。现有的研究认为大脑海马组织内没有功能性甘氨酸能突触,然而却有大量的甘氨酸受体亚基表达,并且无论是在急性分离的海马神经元、体外培养的海马神经元,还是在海马脑片上的研究,都能记录到明显的甘氨酸受体激活的电流。此外,海马神经元细胞外有大量的能激活甘氨酸受体的内源性配体如牛磺酸和β-丙氨酸等存在,这也使甘氨酸受体的激活并发挥功能成为可能。近年来的研究也证明了甘氨酸受体在海马中扮演的功能性角色,它能抑制海马的突触传递,并影响海马的短期可塑性。目前认为,甘氨酸受体的这种功能是通过细胞外持续存在的内源性氨基酸配体（甚至一些未知的调节剂）激活突触外甘氨酸受体,产生紧张性抑制而发挥的。虽然紧张性抑制的功能越来越被人们所重视,然而,到目前为止,选择性调节GABA能紧张性抑制的药物并不多见。另外,对高位脑区甘氨酸受体介导的紧张性抑制的功能也在逐渐被揭露。由于紧张性抑制在控制神经元兴奋性方面的重要作用,使得选择性调节紧张性抑制的药物的开发具有很好的前景。因此在本课题中,一方面,我们从天然化合物入手,筛选并研究了以薄荷醇（menthol）为代表的萜类化合物对海马抑制性氨基酸受体介导的紧张性抑制的调节作用。另一方面,通过异源表达甘氨酸受体的方法,发现并研究了环噻嗪（cyclothiazide,CTZ）对含有α2亚基的甘氨酸受体的选择性抑制作用及其分子机制。 1.薄荷醇通过增强GABA能紧张性抑制下调中枢神经元兴奋运用电生理方法,我们发现薄荷醇可以降低培养海马神经元的兴奋性。同时行为学实验表明,薄荷醇可以抑制小鼠戊四氮（PTZ）注射以及大鼠电刺激海马点燃所产生的癫痫发作。进一步的机制研究显示,薄荷醇能增强低浓度GABA（与报道的在体动物脑内神经元细胞外空间存在的GABA浓度相接近）在培养的海马神经元上激活GABAAR所产生的电流。同时相对较高浓度的薄荷醇还可以激活培养海马神经元上的GABAAR。进一步在海马脑片CA1区锥体神经元上的研究显示,薄荷醇选择性抑制GABAAR介导的紧张性电流,而对突触部位GABAAR介导的相位性突触后电流无影响。这些结果因而表明薄荷醇可通过增强GABAAR介导的紧张性抑制来下调海马神经元的兴奋性。为了进一步排除薄荷醇抑制海马神经元兴奋性是否有GABAAR以外的机制的参与,我们利用电生理的手段,观察了薄荷醇对海马神经元离子型谷氨酸受体和神经元内在兴奋性的影响。实验结果表明薄荷醇不影响谷氨酸对离子型谷氨酸受体的激活,并对微小兴奋性突触后电流（mEPSCs）无影响;同时对在阻断兴奋性和抑制性氨基酸受体离子通道的情况下,薄荷醇对神经元电流注射所产生的动作电位的发放特性无影响。表明薄荷醇不影响神经元的内在膜兴奋性。此外,胞内游离钙离子螯合实验表明薄荷醇对GABAAR的增强效应不受细胞内游离钙离子浓度的影响。这些结果进一步显示薄荷醇是通过选择性增强GABAAR介导的紧张性抑制来发挥对海马神经元的抑制。紧接着对薄荷醇增强GABAAR功能的结构效应关系的研究表明,薄荷醇的几种旋光

关键词： γ-氨基丁酸A型受体甘氨酸受体紧张性抑制相位性抑制点突变癫痫薄荷醇萜类化合物环噻嗪全细胞膜片钳记录

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Sigma-1受体的激动剂对电压门控型钠离子通道Nav1.2的调节作用研究

Sigma-1受体的激动剂对电压门控型钠离子通道Nav1.2的调节作用研究

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作者：高晓飞复旦大学

学位级别：博士

电压门控型钠离子通道(VGSC)主要表达于中枢神经系统(CNS)中,参与动作电位产生过程,并且是众多局麻药、镇痛及抗惊厥药物和毒素的作用靶标。Sigma-1受体也主要分布于CNS,主要参与调节细胞膜上的离子通道、神经元的电活动以及递质释放等... 详细信息

电压门控型钠离子通道(VGSC)主要表达于中枢神经系统(CNS)中,参与动作电位产生过程,并且是众多局麻药、镇痛及抗惊厥药物和毒素的作用靶标。Sigma-1受体也主要分布于CNS,主要参与调节细胞膜上的离子通道、神经元的电活动以及递质释放等过程。Sigma-1受体的多种配体,主要用于抗精神疾病、抗心律失常及镇咳等方面的治疗。其中,(+)-SKF10047,是一种sigma-1受体的选择性激动剂,一直被作为研究sigma-1受体的常用工具药物。已有研究表明(+)-SKF10047可以通过sigma-1受体的激活对Na+、K+、Ca2+等离子通道进行调节。本研究中,使用大量表达内源sigma-1受体的HEK293T细胞和几乎不表达内源sigma-1受体的COS-7细胞系作为模型,通过在HEK293T和COS-7细胞系中瞬时表达大鼠的Nav1.2、Nav1.4和Nav1.5离子通道,并使用sigma-1受体的选择性激动剂(+)-SKF10047、PRE-084和DM(Dextromethorphan),以及拮抗剂BD1047和NE-100作为主要的工具药物,主要研究了sigma-1受体的激动剂对Nav1.2通道的调节作用机制。使用膜片钳全细胞记录的方法,记录通道在给药前后的电流INa的变化。在HEK293T细胞中表达Nav1.2,100μM的(+)-SKF10047对INa。产生瞬时抑制作用,且在1～2min内达到稳定,抑制率约为40%,并且该药物对INa。的抑制作用具有浓度依赖性、频率依赖性和使用依赖性。该药物对Nav1.2的稳态激活特性没有影响,但能够显著地促使Nav1.2的稳态失活曲线向超极化方向偏移约27mV。同时,使用sigma-1受体的特异性拮抗剂BD1047或NE-100不能抑制(+)一SKF10047对INa。的抑制作用；使用sigma-1受体的shRNA质粒干扰HEK293T细胞内源sigma-1受体的表达,或者在COS-7细胞中过表达Navl.2通道,或者在COS-7细胞中共同过表达sigma-1受体和Nav1.2通道,再给药(+)-SKF10047,其对INa。的抑制作用均不发生明显改变。在电极内液中给药PKA信号通路阻断剂H-89和***信号通路阻断剂BIM I和Go6976、G蛋白的拮抗剂NF023和NF449以及G蛋白的激动剂GTPγS,均不能影响(+)-SKF10047对Nav1.2的抑制作用。此外,胞外孵育毒素PTX和CTX来不可逆地改变G蛋白信号,同样不改变(+)-SKF10047对Nav1.2的抑制作用。通过基因定点突变,突变Nav1.2通道上的局麻药结合位点氨基酸W1716.F1764.Y1771后,发现F1764A点突变对(+)-SKF10047的作用有显著抑制,W1716C不影响药物对INa。的抑制作用,Y1771A则使INa。的抑制率稍有升高。通过在不同的刺激频率下给药记录,发现(+)-SKF10047对Nav1.2电流的抑制作用能随刺激频率的升高而增强,并能够使Nav1.2通道电流从失活中恢复的速度显著减慢,同时药物的作用具有使用依赖性,说明药物更容易与去极化状态下的通道发生结合。另外,在HEK293T中瞬时表达Nav1.4或Nav1.5通道,并给药100μM的(+)-SKF10047,发现药物对钠电流的抑制率均在40%以上。而在COS-7细胞中瞬时表达Nav1.4或Navl.5通道,给药后INa抑制率与HEK293T细胞上的结果没有显著性差异。在颗粒神经元和皮层神经元上,给药100μM的(+)-SKF10047后,细胞总体的内向钠电流同样受到抑制,抑制率分别为31.1±2.6%和38.0±1.8%。此外,与(+)-SKF10047同属一类的另一个sigma-1受体的选择性激动剂DM,对HEK293T和COS-7中外源表达的Nav1.2电流的抑制作用分别约为65%和68%。且该药物对INa。的抑制作用亦不能被BD1047或NE-100所阻断,而Nav1.2的F1764A点突变则可以显著降低该药物对INa。的抑制作用。另一种类的sigma-15受体选择性激动剂PRE-084对HKE293T中瞬时表达的Nav1.2的INa抑制作用则较低,约为14%。根据以上的研究结果,我们首次提出sigma-1受体的选择性激动剂(+)-SKF10047对Nav1.2离子通道的抑制作用不依赖于sigma-1受体的激活或G蛋白或者PKA、PKC信号通路,而是通过药物直接与通道的孔区结构的关键位点结合,改变通道的构象,从而抑制INa。并且,推测苯基吗啡类的sigma-1受体的激动剂可能以同样的直接作用的方式抑制Nav1.2。同时,(+)-SKF10047对Nav1.4、N

关键词：电压门控型钠离子通道 Nav1.2 sigma-1受体 (+)-SKF10047 INa 抑制作用全细胞膜片钳记录

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三七总皂苷对大鼠海马CA1区突触传递的作用及机制

三七总皂苷对大鼠海马CA1区突触传递的作用及机制

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作者：周燕广西医科大学

学位级别：博士

(一)三七总皂苷对大鼠海马CA1区突触后电流的影响目的:研究三七总皂苷（Panax notoginseng saponins,PNS）对海马脑片CA1区锥体神经元兴奋性和抑制性突触传递的作用。方法:断头法分离3～4周雄性wistar大鼠海马半脑,用切片机切出400μm... 详细信息

(一)三七总皂苷对大鼠海马CA1区突触后电流的影响目的:研究三七总皂苷（Panax notoginseng saponins,PNS）对海马脑片CA1区锥体神经元兴奋性和抑制性突触传递的作用。方法:断头法分离3～4周雄性wistar大鼠海马半脑,用切片机切出400μm厚度的海马脑片,对CA1区锥体细胞采用“盲法”全细胞膜片钳技术记录,分别检测和分析PNS(0.05～0.4 g·L-1)对刺激CA1传入纤维引出的兴奋性突触后电流（EPSCs）和抑制性突触后电流（IPSCs）的影响,继而以脉冲间隔为50 ms的配对刺激代替单刺激,通过EPSC2/EPSC1比值的变化观察PNS对双脉冲易化（paired-pulse facilitation,PPF）的影响。结果: ①0.1～0.4 g·L-1PNS显著抑制EPSCs（p＜0.05）; ②0.1～0.4 g·L-1PNS在抑制EPSC1、EPSC2的同时明显升高EPSC2/EPSC1比值（p＜0.05）,加强了双脉冲易化; ③0.05～0.4 g·L-1PNS对IPSCs无显著影响（p＞0.05）。结论: ①PNS显著减小大鼠海马CA1区锥体神经元的EPSCs而不影响IPSCs,说明PNS不是通过强化抑制性中间神经元的功能间接地抑制兴奋性神经元,而是对兴奋性突触传递直接产生抑制; ②PNS明显升高EPSC2/EPSC1比值,说明PNS是通过突触前机制抑制CA1区兴奋性突触传递。（二）三七总皂苷对大鼠海马CA1区长时程增强效应的影响目的:研究三七总皂苷（Panax notoginseng saponins,PNS）对大鼠海马脑片CA1区锥体神经元长时程增强效应的影响,以分析其增强学习记忆功能的神经电生理机制。方法:断头法分离wistar大鼠（3～4W）海马半脑,用切片机切出400μm厚度的海马脑片,采用“盲法”全细胞膜片钳技术记录CA1区锥体细胞的兴奋性突触后电流（EPSCs）,给予高频刺激HFS（100 Hz）诱导EPSCs的长时程增强（LTP）,分析PNS对大鼠海马CA1区EPSCs和LTP的影响。结果: ①0.03～0.05 g·L-1PNS不影响CA1区的EPSCs基础突触传递（p＞0.05）; ②0.04～0.05 g·L-1PNS可以增强高频刺激（HFS）诱发的LTP（p＞0.05）。结论: ①0.04～0.05 g·L-1PNS在不影响EPSCs的前提下增强海马CA1区锥体神经元LTP的作用应是其增进学习记忆力的神经电生理机制; ②由于突触传递功能可塑性的下降很可能是AD患者学习记忆能力下降的原因,而提高海马突触可塑性、易化和促进LTP的药物有益于改善AD患者的认知功能障碍。故0.04～0.05 g·L-1PNS增强LTP的作用很可能有益于改善AD患者的认知功能障碍。（三）三七总皂苷对大鼠海马CA1区微小兴奋性电流的影响目的:研究三七总皂苷（Panax notoginseng saponins,PNS）对海马脑片CA1区锥体神经元微小兴奋性电流的作用和机理。方法:采用“盲法”全细胞膜片钳技术,记录PNS(0.05～0.4 g·L-1)对3～4周雄性wistar大鼠海马CA1区自发的微小兴奋性突触后电流（miniature excitatory post synaptic current,mEPSC）的影响。结果:0.05～0.4 g·L-1PNS可明显增加CA1区锥体神经元自发mEPSC的产生频率,但并不影响mEPSC的幅度。结论:PNS可作用于突触前位点对海马神经元兴奋性突触活动产生调节作用,PNS增加mEPSC频率的作用与促进突触前膜nAChR的激动有关,这可能是其调节海马神经元的兴奋性进而发挥益智作用的机制之一。（四）总结 ***显著减小大鼠海马CA1区锥体神经元的EPSCs而不影响IPSCs,说明PNS不是通过强化抑制性中间神经元的功能间接地抑制兴奋性神经元,而是对兴奋性突触传递直接产生抑制;PNS明显升高EPSC2/EPSC1比值,说明PNS是通过突触前机制抑制CA1区兴奋性突触传递。PNS对兴奋性突触后电流的抑制与神经保护作用有关。 ***增强海马CA1区锥体神经元LTP的作用应是其增进学习记忆力的神经电生理机制,PNS很可能有益于改善AD患者的认知功能障碍。 ***可作用于突触前位点对海马神经元兴奋性突触活动产生调节作用,PNS增加mEPSC频率的作用与促进突触前膜nAChR的激动有关,这可能是其调节海马

关键词：三七总皂苷海马CA1区突触前抑制兴奋性突触后电流抑制性突触后电流三七总皂苷海马CA1区高频刺激长时程增强兴奋性突触后电流全细胞膜片钳记录三七总皂苷海马CA1区微小兴奋性突触后电流突触前机制膜片钳

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人参皂苷Rd作用于NMDA受体抵抗神经兴奋性毒性损伤的机制研究

人参皂苷Rd作用于NMDA受体抵抗神经兴奋性毒性损伤的机制研究

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作者：张琛第四军医大学

学位级别：博士

离子型谷氨酸受体NMDA受体(NMDAR)是一类重要的配体门控性离子通道，对钙离子具有高通透性是其重要特点。缺血性脑卒中等病理情况下，NMDAR过度激活会介导过量钙离子内流，造成神经元兴奋性毒性损伤。大量针对缺血性脑卒中等不同神经系... 详细信息

离子型谷氨酸受体NMDA受体(NMDAR)是一类重要的配体门控性离子通道，对钙离子具有高通透性是其重要特点。缺血性脑卒中等病理情况下，NMDAR过度激活会介导过量钙离子内流，造成神经元兴奋性毒性损伤。大量针对缺血性脑卒中等不同神经系统疾病模型的临床前研究表明，抑制或阻断NMDAR能够有效减轻神经元的病理损伤。但是，NMDA受体拮抗剂的临床试验却常常由于无明确有效性或者不可耐受的副作用而失败。随着对NMDAR亚单位结构和功能多样性的深入认识，高选择性的干预NMDAR亚单位功能为开发治疗缺血性脑卒中的神经保护剂提供了新的思路。本课题组前期体内外动物实验和临床试验研究证实，人参皂苷Rd (GSRd)在急性缺血性脑卒中的治疗中具有良好的神经保护效应，提示GSRd可能成为一种具有应用前景的神经保护剂。但是其作用机制和靶点尚不明确。我们前期研究提示GSRd的神经保护作用可能与NMDAR有关。由于NMDAR在缺血性脑卒中的发病中具有重要作用，本研究在体外培养的大鼠海马神经元上，采用神经电生理学和分子生物学等方法，探讨了GSRd神经保护作用与NMDAR之间的关系。以期进一步揭示GSRd的作用机制及潜在靶点，为其临床应用提供理论依据。第一部分人参皂苷Rd对NMDA受体电流的调节作用目的：本课题前期研究提示GSRd的神经保护作用可能与NMDAR有关。因此，本部分实验首先探讨NMDAR是否为GSRd发挥神经保护作用的潜在靶点。方法：大鼠海马神经元原代培养至10-14d用于实验。采用膜片钳技术和“Y型管”给药系统，在无镁外液环境下记录大鼠海马神经元的NMDA受体电流，并给予GSRd和不同NMDA受体拮抗剂干预，观察GSRd对NMDA受体电流的影响。建立兴奋性毒性损伤模型，记录兴奋性毒性损伤情况下NMDA受体电流变化，并观察GSRd处理对该电流的影响。结果： 1.在大鼠海马神经元上，给予NMDA刺激可迅速诱发出明显的内向电流，该电流具有快速部分脱敏的特点。给予NMDAR拮抗剂AP-5和MK-801均能够显著抑制该电流，表明我们记录到的是典型的NMDA受体电流。 2. GSRd能够明显减小NMDA受体电流峰值，并且其作用具有剂量依赖性，其EC50为7.7μM。 3.兴奋性毒性损伤后记录到的NMDA受体电流峰值较正常状态下诱发电流峰值明显增大，而给予GSRd处理后NMDA受体电流峰值较损伤组明显减小，表明在兴奋性毒性损伤情况下GSRd亦能够明显抑制NMDAR的活动。结论：GSRd在一定程度上能够减小NMDAR通道活动，并且在兴奋性毒性损伤情况下仍能够明显降低过度开放的通道活动，提示NMDAR可能是GSRd发挥神经保护作用的潜在靶点。第二部分人参皂苷Rd对NMDA受体调节作用的亚单位选择性目的：功能性NMDAR主要由两个NR1亚单位和两个NR2A或两个NR2B亚单位组成，研究表明NR2A和NR2B亚单位在突触内外的分布和功能是不同的。本部分实验中我们进一步分离NMDA受体电流成分，观察GSRd对NMDAR的调节作用是否具有亚单位选择性。方法：原代培养大鼠海马神经元至10-14d用于实验。采用膜片钳技术和“Y型管”给药系统在大鼠海马神经元上记录NMDA受体电流，分别给予NR2A亚单位选择性拮抗剂NVP-AAM077和NR2B亚单位选择性拮抗剂ifenprodil干预，观察它们是否影响GSRd对NMDA受体电流的调节作用。记录NMDA受体成分的微小突触后电流(NMDAR-mEPSC)以反映突触内NMDAR活动，按照MK-801抑制方案分离突触外NMDA受体电流，分别观察GSRd对二者的影响。在HEK293细胞上转入重组NR1/NR2A受体和NR1/NR2B受体，分别记录NR1/NR2A受体电流(INR1/NR2A)和NR1/NR2B受体电流(INR1/NR2B)，观察GSRd对这两种电流的影响。使用NMDAR放射性配基[3H]CGP39653进行配基受体结合实验，检测GSRd对NMDAR的亲和力。结果： 1. NVP-AAM077并未影响GSRd对NMDA受体电流的抑制作用，而ifenprodil则能够完全消除GSRd对NMDA受体电流的抑制作用。 2. GSRd处理前后海马神经元突触内NMDAR-mEPSC的频率和幅度均没有明显变化。但是GSRd能够明显减小突触外NMDA受体电流的峰值。 3. GSRd对转染HEK293细胞INR1/NR2A和INR1/NR2B均无明显影响。GSRd对[3H]CGP39653特异性结合的抑制率较低，提示其与NMDAR的亲和力较低。结论：GSRd对NMDAR的调节作用具有一

关键词：人参皂苷Rd 海马神经元 NMDA受体兴奋性毒性神经保护全细胞膜片钳记录

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人肺腺癌A549细胞膜钾离子通道特性与细胞增殖关系的研究

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中国肺癌杂志 2005年第4期8卷 261-265页

作者：李向楠戴天阳曾晓荣杨艳潘雪王琼泸州医学院附属医院胸心外科泸州医学院心肌电教室泸州医学院组胚教研室

背景与目的肺癌的发生发展、侵袭和转移均受肺癌相关基因的调控,而相关基因的表达、缺失或/和突变常是通过细胞膜信号传导系统和细胞膜离子通道实现的。本研究观察了人肺腺癌细胞系A549细胞膜钾离子通道的特性,以探讨应用钾通道阻断剂... 详细信息

背景与目的肺癌的发生发展、侵袭和转移均受肺癌相关基因的调控,而相关基因的表达、缺失或/和突变常是通过细胞膜信号传导系统和细胞膜离子通道实现的。本研究观察了人肺腺癌细胞系A549细胞膜钾离子通道的特性,以探讨应用钾通道阻断剂抑制肺腺癌细胞增殖的可行性。方法以人肺腺癌细胞系A549细胞为研究对象,采用全细胞膜片钳技术记录细胞膜离子通道特性;通过细胞体外增殖试验,观察钾通道阻断剂四乙胺(TEA)对细胞增殖影响。结果A549细胞在保持电压为-70mV,测试电压-30^+110mV时,记录到一种跨膜电流,该跨膜电流具有电压依赖性、外向整流特性,并且500ms内不失活,可被钾通道阻断剂TEA阻断;细胞体外增殖试验显示,20、40和60mmol/L的TEA作用24h能明显抑制人肺腺癌A549细胞的体外增殖,而0.2和2mmol/L的TEA对细胞的体外增殖无明显抑制作用。结论人肺腺癌细胞系A549细胞中存在外向性电压门控性钾通道,该钾通道可被TEA阻断;钾通道阻断剂TEA能抑制A549细胞的体外增殖,抑制作用与TEA存在剂量依赖关系。

关键词：肺腺癌钾离子通道全细胞膜片钳记录四乙胺细胞增殖

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神经甾体类物质对中枢神经系统甘氨酸受体的调节机制及功能研究

神经甾体类物质对中枢神经系统甘氨酸受体的调节机制及功能研究

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作者：江鹏中国科学技术大学

学位级别：博士

甾体激素类物质（steroid hormones）在机体中作用常是首先结合到甾体激素相应的胞内受体，进而进入核内充当转录因子，调节着基因的表达。该过程由于涉及到蛋白质的合成，起效所需时间较长，一般数十分钟至数小时。自上个世纪八十年代... 详细信息

甾体激素类物质（steroid hormones）在机体中作用常是首先结合到甾体激素相应的胞内受体，进而进入核内充当转录因子，调节着基因的表达。该过程由于涉及到蛋白质的合成，起效所需时间较长，一般数十分钟至数小时。自上个世纪八十年代末以来，甾体激素类物质在神经系统中的作用研究掀起一股热潮。并且大量研究结果发现，神经系统中，部分甾体激素类物质可以直接作用于一些细胞膜表面配体门控离子通道或G蛋白偶联受体，从而在数毫秒至数秒内即可改变神经元兴奋性。鉴于这些甾体激素类物质快速起效的特性，它们也被称作为神经活性甾体（neuroactive steroids）。进一步研究发现，神经系统局部环境中某些神经活性甾体的浓度要远高于血浆中的水平，并且神经元和胶质细胞中存在有这些甾体激素合成的酶类，因此，这部分的甾体激素类物质在神经系统中可以自主合成。Baulieu于1997年提出了“神经甾体（neurosteroids）”的概念以命名这些甾体物质。一般说来，通过基因水平和非基因水平两方面途径，神经甾体调节了神经元的功能及其可塑性，在中枢神经系统中起到复杂多样的作用。成年动物中枢神经系统中，GABAA受体（GABAA receptors，GABAARs）是一种重要的抑制性受体，介导了快速的抑制性突触传递。过去的很多神经甾体调节抑制性受体的研究也主要是集中在对GABA能系统的调控。例如，神经甾体中，研究较多的一系列具有镇静和催眠作用的孕烷甾体，它们可以通过变构作用，增强GABAARs功能。又如有研究表明雌激素可以通过抑制GABA能的突触信号传递来调节神经元的兴奋性。然而，另一种抑制性受体甘氨酸受体（glycine receptors，GlyRs）所受的关注则较少。业已证明，GlyRs在中枢神经系统中广泛分布。脊髓中，GlyRs也介导了快速的突触传递，并参与脊髓中感觉信号的加工（包括伤害感受信息的加工传递），其中GlyRα3亚基更是外周炎症导致痛觉敏化现象的重要靶点。海马中，虽然GlyRs大量分布，但未有完全证明功能性glycine能突触的存在。由于这个原因，海马中GlyRs的研究受到了极大忽视。目前研究证据表明，海马中GlyRs的tonic激活则参与调节神经网络兴奋性、与GABAARs间交互抑制及短时程可塑性。此外，最近的研究还表明GlyRs在神经系统发育中起到重要作用，如参与脊椎动物视网膜、皮层及脊髓的发育。那么神经甾体又是如何调节GlyRs的功能呢?本研究中，我们主要使用海马和脊髓神经元培养技术、质粒的转化和转染技术及电生理记录研究了神经甾体孕烷醇酮（pregnanolone，PGN；5β-pregnan-3α-ol-20-one）和17-β-雌二醇（17-β-estradiol，E2）对于中枢神经元上GlyRs的调节作用和可能的机制，并探索其调节作用可能的生理功能和意义。 1．神经甾体PGN对培养大鼠脊髓神经元中甘氨酸能反应调控的研究本实验中，我们利用全细胞膜片钳方法检测了PGN及其三个异构体对于GlyRs的调控作用。结果显示，PGN可逆地抑制天然GlyRs和重组的α1-、α2、α3-和α1β-GlyR介导的峰值电流。在培养的大鼠脊髓背角神经元中，PGN浓度依赖性地抑制甘氨酸诱导的电流(glycine-induced current，IGly)，半效抑制浓度为1.0±0.3μM。PGN对IGly的抑制效果并不依赖于膜电位，且PGN使得IGly浓度效应曲线右移，却不改变glycine诱导的最大电流和曲线的希尔系数（Hillcoefficient）。PGN的三个异构体中，allopregnanolone略微增强IGly，然而iso-pregnanolone和iso-allopregnanolone不显著影响培养脊髓神经元中的IGly。因此，我们的研究结果提示PGN与glycine竞争结合到GlyRs，从而起到抑制IGly的作用，并且，这种竞争抑制作用具有结构特异性。此外，PGN可以降低甘氨酸能的微小抑制性突触后电流（glycinergic miniature inhibitory postsynapticcurrents，glycinergic mIPSCs）的幅度与频率。那么，通过调节甘氨酸能的突触传递，PGN可能在生理或病理情况下影响到伤害性感受信号在脊髓中的加工。 2．E2对培养的中枢神经元GlyRs的调控研究在培养的大鼠海马神经元中，我们利用全细胞膜片钳方法首先检测了E2对于IGly幅度的调节作用，结果发现E2快速且可逆地抑IGly的峰值。E2对IGly的抑制作用不依赖于细胞膜电压，也不依赖于glycine的浓度，提示E2对I

关键词：培养的大鼠海马和脊髓神经元天然和重组甘氨酸受体甘氨酸能微小抑制性突触后电流神经甾体孕烷醇酮雌激素 17-β-雌二醇伤害感受发育全细胞膜片钳记录

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大鼠海马神经元中酸敏感离子通道的特性和功能研究

大鼠海马神经元中酸敏感离子通道的特性和功能研究

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作者：高隽中国科学技术大学

学位级别：博士

该课题采用急性分离的技术,观察了急性分离的海马CA1区神经元上ASICs电流特性;并结合RT-PCR、Western blot、免疫组化、细胞培养及质粒的转化和转染等实验方法,进一步研究了缺血后各个ASICs亚基的变化及可能的机制.主要的实验结果如下:1... 详细信息

该课题采用急性分离的技术,观察了急性分离的海马CA1区神经元上ASICs电流特性;并结合RT-PCR、Western blot、免疫组化、细胞培养及质粒的转化和转染等实验方法,进一步研究了缺血后各个ASICs亚基的变化及可能的机制.主要的实验结果如下:1.急性分离的海马CA1区神经元上ASICs样电流的电生理学特性该实验中,我们观察到当胞外的pH降低到6.8时,可以激活急性分离的海马CA1区神经元产生一个内向电流,并随着pH的降低,该电流的峰值也逐渐增大,在pH 4.5时达到最大,EC<,50>接近于6.1;药理学研究发现,该电流对TTX不敏感,但可以被amiloride——DEG/ENaC通道非特异性的阻断剂,浓度依赖性的抑制.2.全脑缺血期间CaMKII和NMDA受体激活介导ASIC1a亚基磷酸化大量的研究表明,表达在外周神经系统中的ASICs可以感受信息传递过程中pH的变化,而对感觉信息的传递过程进行调节.中枢神经系统中ASICs的分布非常广泛,组织酸化也是生理、病理情况下最常见的现象之一.基因敲除的实验提示生理条件下,ASIC1与突触可塑性有关,参与了LTP的产生机制.但对病理条件下ASICs的功能研究不是很多.该实验就采用实验性缺血、和全脑缺血的模型,从单细胞水平和在体水平两个层次观察了缺血刺激对海马神经元上ASICs各个亚基的调节及可能的机制.结果提示在缺血期间ASIC1a可以作为NMDA受体的下游物质介导部分的神经毒效应.临床研究表明,防治缺血/缺氧的药物,如谷氨酸受体的拮抗剂,由于存在广泛的副作用而导致疗效不理想甚至失败,而该文观察到的缺血期间ASIC1a的作用可以为缺血治疗药物的研发提供新的实验依据和药物靶点.

关键词：酸敏感离子通道缺血 NMDA受体磷酸化 CaMKⅡ转位海马 HEK293细胞全细胞膜片钳记录转化和转染 RT-PCR Western blot 免疫组化细胞培养激光共聚焦显微镜大鼠

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神经肽Y对海马神经元兴奋性突触活动的影响

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中风与神经疾病杂志 2012年第10期29卷 876-878页

作者：董长征董秀芳赵文清张素芳李文玲河北省人民医院功能神经外科河北石家庄050051 邢台市第一医院神经内科河北邢台054000

目的观察神经肽Y(NPY)对体外培养海马神经元兴奋性突触活动的影响。方法 Wistar大鼠海马神经元体外原代培养,无镁细胞外液处理3h,建立稳定的海马神经元癫痫样放电模型,应用全细胞膜片钳记录技术,观察不同浓度NPY对海马神经元自发兴奋性... 详细信息

目的观察神经肽Y(NPY)对体外培养海马神经元兴奋性突触活动的影响。方法 Wistar大鼠海马神经元体外原代培养,无镁细胞外液处理3h,建立稳定的海马神经元癫痫样放电模型,应用全细胞膜片钳记录技术,观察不同浓度NPY对海马神经元自发兴奋性突触后电流(sEPSCs)的影响。结果 (1)体外培养12d的海马神经元轮廓清晰,折光性良好,彼此间广泛突触联系形成,适于神经元电生理试验。(2)癫痫组神经元sEPSCs发放频率(28.826±1.254HZ)高于对照组(1.296±0.241HZ),差异有统计学意义(P<0.05)。0.1μmol NPY组sEPSCs的频率为0.895±0.146HZ;1μmol NPY组频率为0.461±0.394HZ,与癫痫组(28.826±1.254HZ)相比,均有明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。0.1μmol NPY组的频率降低的程度小于1μmol NPY组神经元,差异有统计学意义(P<0.05)。sEPSCs幅度各组相比无明显差异(P>0.05)。结论 NPY能够抑制癫痫神经元sEPSCs的频率,而不影响幅度,这为NPY基因治疗癫痫提供了电生理学证据。

关键词：神经肽Y 癫痫神经元全细胞膜片钳记录自发兴奋性突触后电流

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咖啡因对急性分离大鼠DRG神经元GABA-激活电流的调制作用(英文)

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神经解剖学杂志 2007年第3期23卷 251-255页

作者：李韶孙长凯张健李爱萍朴花李之望大连医科大学生理学教研室脑疾病研究所大连116027 华中科技大学同济医学院神经生物学系武汉430030

应用全细胞膜片钳记录大鼠新鲜分离背根神经节(DRG)神经元GABA-激活电流,观察咖啡因对GABA-激活电流(IGABA)的调制作用。结果显示:大部分受检细胞(97.4%,113/116)对外加GABA敏感。1-1000μmol/LGABA引起一剂量依赖性、有明显去敏感作用... 详细信息

应用全细胞膜片钳记录大鼠新鲜分离背根神经节(DRG)神经元GABA-激活电流,观察咖啡因对GABA-激活电流(IGABA)的调制作用。结果显示:大部分受检细胞(97.4%,113/116)对外加GABA敏感。1-1000μmol/LGABA引起一剂量依赖性、有明显去敏感作用的内向电流。预加咖啡因(0.01-100μmol/L)30s后再加GABA能明显抑制GABA(100μmol/L)激活电流的幅值。预加咖啡因后GABA量效曲线明显下移;GABA-激活电流的最大值较之对照下降约57%;而Kd值(30μmol/L)几乎不变。该结果提示此种抑制为非竞争性的。预加氨茶碱(theophylline)亦可明显抑制GABA激活电流,同一浓度(10μmol/L)下氨茶碱的抑制作用较咖啡因的抑制作用强。预加安定(diazepam,1μmol/L)对GABA(10μmol/L)激活电流有增强作用,而预加咖啡因(10μmol/L)有拮抗安定增强IGABA的作用。胞内透析H-8后,几乎可以完全消除咖啡因对IGABA的抑制作用。本结果表明咖啡因在初级传入末稍可能产生对抗突触前抑制的效应。

关键词：咖啡因 GABAA受体全细胞膜片钳记录背根神经节大鼠

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