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复旦学报（医学版） 2007年第3期34卷 335-339页

作者：钟贞杨健李平谭理应其龙宋后燕复旦大学上海医学院生物化学与分子生物学系-教育部分子医学重点实验室上海200032 英国爱丁堡大学干细胞研究中心

目的探索胚胎干细胞定向分化为血管内皮细胞,并用于构建内皮化血管支架,为临床心血管疾病治疗提供实验基础。方法采用改良后单层分化体系,血管内皮生长因子(VEGF)作为独立诱导因子定向诱导胚胎干细胞分化为血管内皮细胞,用RT-PCR法检测... 详细信息

目的探索胚胎干细胞定向分化为血管内皮细胞,并用于构建内皮化血管支架,为临床心血管疾病治疗提供实验基础。方法采用改良后单层分化体系,血管内皮生长因子(VEGF)作为独立诱导因子定向诱导胚胎干细胞分化为血管内皮细胞,用RT-PCR法检测分化时程各时间点内皮特异性标志的表达,用免疫荧光法检测分化体系中的内皮细胞蛋白标志。将分化成熟的内皮细胞种植于支架表面,构建内皮化血管支架。结果胚胎干细胞全能性分子标志Oct3／4,早期内皮标志Flk-1,Tie-2,PECAM-1,以及成熟内皮标志VE-cadherin在胚胎干细胞分化体系中呈现一定的转录时序性;免疫荧光结果显示分化细胞Flk-1,VE-cadheiin阳性,血管支架被表达VE-cadherin的内皮细胞覆盖。结论我们改良了胚胎干细胞分化为血管内皮细胞的方法,并用于探索内皮化血管支架的构建。

关键词：胚胎干细胞分化内皮化血管支架

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转染双功能水蛭素的胚胎干细胞分化内皮细胞并构建内皮化血管支架

转染双功能水蛭素的胚胎干细胞分化内皮细胞并构建内皮化血管支架

引用

作者：钟贞复旦大学

学位级别：硕士

胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES)具有自我更新和多向分化潜能，能够分化为绝大多数的成体细胞，我们优化了内皮细胞分化条件，建立了简易的血管内皮细胞的分化体系，为研究分化过程中分子机制提供了体外模型，也可为细胞移植治疗... 详细信息

胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES)具有自我更新和多向分化潜能，能够分化为绝大多数的成体细胞，我们优化了内皮细胞分化条件，建立了简易的血管内皮细胞的分化体系，为研究分化过程中分子机制提供了体外模型，也可为细胞移植治疗提供丰富的血管内皮细胞来源，我还用分化成熟的血管内皮细胞构建内皮化血管支架。血管内支架(stent)植入后需防止管腔再狭窄，常用抗凝防栓药物，支架表面种植内皮细胞即支架内皮化也可防止支架植入术后管腔再狭窄，但至今尚未成为临床治疗手段，原因为内皮细胞的来源困难以及内皮细胞的持续抗凝血功能。我们构建了转染双功能水蛭素(RGD-Hirudin)基因的胚胎干细胞克隆，并定向分化为血管内皮细胞，种植于血管支架表面形成内皮化支架，这种内皮化支架具有持续分泌双功能水蛭素发挥抗凝抗血小板聚集的功效，具有应用前景。第一部分 (1)单层分化法，胚胎干细胞(ES)通过无LIF培养基自发分化四天，后四天采用血管内皮生长因子(VEGF)的体外诱导分化为成熟血管内皮细胞。我们收集D0，D2，D4，D6，D8，D10分化细胞，RT-PCR检测分化过程中各时间点ES标志性基因Oct3/4及内皮细胞标志基因Flk-1，Tie一2，PECAM-1，VE-cadherin的转录情况，同时免疫荧光检测第八天分化细胞F1k-1，VE-cadherin的蛋白表达，并通过流式细胞仪检测分化细胞VE-cadherin<'+>细胞的比例从而指示内皮细胞分化得率。结果显示，在此分化体系中，我们能够成功地得到63.27％的成熟内皮细胞。(2)我们同时尝试用拟胚体(EB)分化法建立内皮细胞分化系统，通过RT-PCR法检测分化过程中D0，D2，D4，D6，D8，D10的分子标志Flk-1，Tie-2，PECAM-1，VE-cadherin的转录，证明我们同样能在分化第八天得到一定比率的血管内皮细胞。第二部分采用我们实验室已研制成功的重组双功能水蛭素(RGD-hirudin) 作为目的基因，选择内皮细胞特异性调控序列Flk-1promoter/enhancer(p/e)替换表达载体pIRES2-EGFP原有启动子，构建重组表达质粒。该重组表达质粒中由于核糖体内部进入位点(IRES)的存在，由Flk-1p/e调控RGD-hirudin及EGFP基因在ES细胞阶段及成熟内皮细胞阶段同时转录表达，这使得目的基因(RGD-hirudin)的表达可由绿色荧光蛋白表达指示。重组质粒借助脂质体Lipofectin 2000转染入ES细胞，并由G418筛选压力下挑取稳定克隆。同时我们还采用Flk-1p/e改造pEGFP-1表达载体作为对照质粒，由相同的序列调控绿色荧光蛋白的表达。转染细胞挑取稳定克隆作为对照工程细胞株。 PCR，RT-PCR检测稳定转染克隆株目的基因RGD-hirudin，EGFP及其转录*** blotting检测RGD-hirudin蛋白表达，稀释法测凝血酶原时间检测转染ES克隆培养上清的抗凝活性。我们成功构建了表达RGD-hirudin并具有抗凝活性的ES工程细胞株。第三部分稳定转染ES细胞克隆通过我们建立的内皮分化系统分化成内皮细胞并种植到血管内支架上，通过扫描电镜观察支架上内皮细胞形态。绿色荧光蛋白表达指示种植细胞的成熟内皮分化阶段及RGD-hirudin的蛋白表达。免疫荧光DAPI染色及VE-cadherin抗体染色进一步显示支架表面内皮细胞特征。稀释法测凝血酶原时间检测内皮化血管支架培养上清的抗凝活性。至此，具有抗凝活性的来源于胚胎干细胞的内皮化血管支架构建成功。结论：通过建立一套简单的血管内皮细胞分化体系，我们能够从小鼠胚胎干细胞分化得到一定比率的血管内皮细胞。筛选出稳定表达RGD-hirudin重组质粒的ES细胞克隆，分化为血管内皮细胞并构建出具有抗凝活性的内皮化血管支架。

关键词：胚胎干细胞内皮细胞双功能水蛭素内皮化血管支架细胞分化分子机制细胞移植

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