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细胞与分子免疫学杂志 2016年第12期32卷 1627-1631页

作者：刘艳华李宾公王裕勤王得龙邹晋柯旋郝艳琴南昌大学第一附属医院心内科江西南昌330006 湖南省娄底市中心医院心内科湖南娄底417000 湖南省娄底市中心医院肿瘤外科湖南娄底417000

目的探讨敲减Runt相关转录因子3(RUNX3)对低氧诱导人心脏微血管内皮细胞(HCMEC)向间质转分化的影响及具体机制。方法低氧条件下培养HCMEC,使用RUNX3干扰慢病毒敲减HCMEC中的RUNX3基因,应用反转录PCR检测内皮细胞间质转分化(EndoMT)相关... 详细信息

目的探讨敲减Runt相关转录因子3(RUNX3)对低氧诱导人心脏微血管内皮细胞(HCMEC)向间质转分化的影响及具体机制。方法低氧条件下培养HCMEC,使用RUNX3干扰慢病毒敲减HCMEC中的RUNX3基因,应用反转录PCR检测内皮细胞间质转分化(EndoMT)相关基因CD31、血管内皮钙黏素(VE-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、成纤维细胞特异蛋白1(FSP-1)以及RUNX3的mRNA表达,应用Western blot法检测CD31、α-SMA、RUNX3、转化生长因子β2(TGF-β2)、Smad2/3、p-Smad2/3以及Notch-1、Hes1、Hey1蛋白表达,免疫荧光细胞化学染色检测CD31、α-SMA的表达和定位。结果低氧能够诱导HCMEC发生EndoMT;低氧时TGF-β2、Smad2/3、p-Smad2/3以及Notch-1、Hes1、Hey1蛋白均上调;而RUNX3敲减后TGF-β2以及Notch-1蛋白水平增高,然而Smad2/3、p-Smad2/3以及Hes1、Hey1蛋白水平均不同程度下调。结论 RUNX3敲减可减轻低氧诱导的EndoMT,可能是通过部分抑制TGF-β及Notch信号通路。

关键词：内皮细胞间质转分化 Runt相关转录因子3(RUNX3) 转化生长因子β(TGF-β) Notch 低氧

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miR-328对高糖诱导人脐静脉内皮细胞间质转分化的调控及信号机制

miR-328对高糖诱导人脐静脉内皮细胞间质转分化的调控及信号机制

引用

作者：陈云肖南昌大学

学位级别：硕士

目的:通过高糖诱导构建人脐静脉内皮细胞间质转分化模型,探讨miR-328在内皮细胞间质转分化中的调控作用以及MEK1/2-ERK1/2信号通路在其中的作用。方法:培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),高糖诱导... 详细信息

目的:通过高糖诱导构建人脐静脉内皮细胞间质转分化模型,探讨miR-328在内皮细胞间质转分化中的调控作用以及MEK1/2-ERK1/2信号通路在其中的作用。方法:培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),高糖诱导间质转分化;构建携带miR-328和antagomiR-328基因的重组慢病毒,转染HUVECs。将实验分为九组:(1):HUVECs+正常葡萄糖(5.5mmol/L),(2):HUVECs+甘露醇对照组(30mmol/L),(3):HUVECs+高浓度葡萄糖(30mmol/L),(4):HUVECs+miR-328,(5):HUVECs+miR-328病毒阴性对照,(6):HUVECs+高浓度葡萄糖+antagomiR-328,(7):HUVECs+高浓度葡萄糖+antagomiR-328病毒阴性对照,(8):HUVECs+高浓度葡萄糖+U0126(10μmol/L),(9):HUVECs+miR-328+U0126(10μmol/L)。免疫荧光双染色鉴定HUVECs发生间质转分化;RT-PCR检测miR-328表达水平;Western blot检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白,p-MEK1/2、p-ERK1/2表达水平。结果:1.免疫荧光双染色结果显示,经高糖处理的HUVECs呈CD31、α-SMA染色双阳性;2.与正常葡萄糖组相比,高糖组miR-328表达明显增高(p<0.05),差异具有统计学意义;与高糖组及miR-328组相比,经U0126处理后miR-328表达明显降低(p<0.05),差异有统计学意义;3.与正常葡萄糖组相比,高糖及miR-328处理的HUVECsⅠ、Ⅲ型胶原蛋白表达明显增多(p<0.05),差异具有统计学意义;与高糖组相比,antagomiR-328组Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达明显减少(p<0.05),差异具有统计学意义;与高糖组及miR-328组相比,经U0126处理后Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达明显减少(p<0.05),差异具有统计学意义;4.与正常葡萄糖组相比,高糖及miR-328处理的HUVECs,p-MEK1/2、p-ERK1/2表达水平明显增高(p<0.05),差异具有统计学意义;与高糖组相比,经antagomiR-328处理的HUVECs,p-MEK1/2、p-ERK1/2表达水平明显降低(p<0.05),差异具有统计学意义,经过U0126处理后p-MEK1/2、p-ERK1/2水平较高糖组明显降低(p<0.05),差异具有统计学意义。结论:(1)高糖可诱导HUVECs发生间质转分化,同时miR-328表达增高;(2)过表达miR-328可诱导HUVECs发生间质转分化,而antagomiR-328可抑制内皮细胞间质转分化;(3)miR-328诱导HUVECs间质转分化和MEK1/2-ERK1/2信号通路有关。

关键词：人脐静脉内皮细胞高糖 miR-328 内皮细胞间质转分化 MEK1/2-ERK1/2

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自噬对缺氧诱导心脏微血管内皮细胞间质转分化和梗死后心肌纤维化的调控及机制

自噬对缺氧诱导心脏微血管内皮细胞间质转分化和梗死后心肌纤维化...

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作者：邹晋南昌大学

学位级别：硕士

第一部分自噬对缺氧诱导的心肌微血管内皮细胞间质转分化的调节及机制目的:1、研究缺氧对人心脏微血管内皮细胞(human cardiac microvascular endothelial cells,HCMECs)间质转分化(endothelial-to-mesenchymal transition,EndMT)及自噬的影响;2、研究自噬对缺氧诱导的HCMECs EndMT的影响及具体机制。方法:1、探究缺氧状态下对HCMECs EndMT的影响。实验主要分为2组(1)control组:常氧(21%O2、5%CO2、74%N2,37℃)条件下培养HCMECs3天;(2)hypoxia组:缺氧(1%O2、5%CO2、74%N2,37℃)条件下培养HCMECs3天,分别对两组细胞进行如下实验:⑴光学显微镜下观察两组细胞形态学变化;⑵RT-PCR测定各组细胞中CD31、E-cadherin、αSMA、FSP-1及Snail mRNA相对表达水平;⑶Western blot测定两组细胞CD31、E-Cadherin、ɑSMA、FSP-1、Snail蛋白表达水平;⑷双重免疫荧光染色观察CD31、αSMA及FSP-1表达变化及并对CD31+αSMA+/FSP+双阳性细胞(说明正在发生EndMT的细胞)和CD31-SMA+/FSP+细胞(说明已经发生EndMT的细胞)计数分析。2、探究缺氧状态下HCMECs自噬水平的变化。⑴HCMECs缺氧3天内LC3蛋白的表达动态变化,通过Western blot法测定HCMECs缺氧0,2,4,6,12,24,48,72 h处LC3表达变化;⑵将细胞分为以下4组:(1)control组:常氧条件下培养HCMECs;(2)氯喹(Chloroquine,CQ)(20μm)组:常氧条件下加入氯喹处理HCMECs 8小时;(3)hypoxia组:缺氧条件下培养HCMECs 6小时;(4)hypoxia+CQ(20μm)组:常氧条件用氯喹处理HCMECs 2小时,缺氧培养6小时;Western blot法分别测定各组LC3表达变化;⑶转染GFP-LC3质粒的HCMECs在缺氧3天内GFP-LC3表达动态变化,通过激光共聚焦观察HCMECs缺氧0,2,6,12,24,36,48,72 h处GFP-LC3表达变化。3、探究缺氧状态下自噬对HCMECs EndMT的影响及相关机制。实验主要分为以下5组(1)control组:常氧条件下培养HCMECs 3天;(2)hypoxia组:缺氧条件下培养HCMECs 3天;(3)hypoxia+雷帕霉素(rapmycin,rap)(100nm)组:雷帕霉素预处理细胞2小时,后将HCMECs置于缺氧条件下培养3天;(4)hypoxia+3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)(5mm)组:3-MA预处理细胞2小时,后将HCMECs置于缺氧条件下培养3天;(5)hypoxia+CQ(20μm)组:氯喹预处理细胞2小时,后将HCMECs置于缺氧条件下培养3天。分别对各组细胞进行如下实验:⑴双重免疫荧光染色观察CD31及αSMA表达变化并对CD31+αSMA+双阳性细胞和CD31-SMA+细胞计数分析;激光共聚焦显微镜下观察Snail及LC3在HCMECs的共定位;⑵RT-PCR测定各组细胞中CD31、E-Cadherin、αSMA、FSP-1、Snail、TGFβ2、Smad2及Smad3的mRNA表达水平并比较分析;⑶Western blot测定各组细胞中CD31、E-cadherin、αSMA、FSP-1、Snail、LC3、beclin1、TGFβ2、Smad2、p-Smad2、Smad3及p-Smad3蛋白表达并比较分析。结果1、缺氧诱导HCMECs发生EndMT:⑴光学显微镜可见:control组HCMECs保持典型的铺路石或鹅卵石样内皮细胞样外观;而缺氧状态下细胞逐渐呈纺锤型样变化,且随时间变化愈明显。⑵RT-PCR结果显示:与control组相比,hypoxia组HCMECs的CD31、E-cadherin mRNA表达下降,而αSMA、FSP-1及Snail mRNA表达升高(P<0.05)。⑶Western blot结果显示:与control组相比,hypoxia组HCMECs的CD31、E-cadherin蛋白表达下降,而αSMA、FSP-1及Snail蛋白表达升高(P<0.05)。⑷双重免疫荧光染色结果显示:与control组相比,hypoxia组HCMECs中CD31表达逐渐减弱,αSMA/FSP-1强度逐渐增强,CD31+αSMA+/FSP+双阳性细胞明显增加甚至出现CD31-SMA+/FSP+细胞(P<0.05)。2、缺氧诱导HCMECs发

关键词：内皮细胞间质转分化自噬缺氧急性心肌梗死心肌纤维化

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