检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：丁军涛中国农业科学院

学位级别：博士

囊尾蚴病(Cysticercosis)是由猪带绦虫(Taenia solium)的幼虫囊尾蚴(Cysticercus cellulosae)寄生于人或猪等而引起的人畜共患寄生虫病,是公认的世界经济病之一。囊尾蚴病在中国大部分地区尤其在少数民族地区是一个重要的公共卫生问题,... 详细信息

囊尾蚴病(Cysticercosis)是由猪带绦虫(Taenia solium)的幼虫囊尾蚴(Cysticercus cellulosae)寄生于人或猪等而引起的人畜共患寄生虫病,是公认的世界经济病之一。囊尾蚴病在中国大部分地区尤其在少数民族地区是一个重要的公共卫生问题,严重威胁着人体健康,不仅如此,猪囊尾蚴病的广泛存在极大影响了我国畜产品在国际市场上的竞争力,给畜牧业造成重大经济损失,猪囊尾蚴病的免疫防治势在必行,然而在猪囊尾蚴病疫苗研究中,疫苗抗原的选择和来源一直困扰着兽医工作者。Tsol18是猪带绦虫六钩蚴(*** oncosphere)阶段特异性表达的抗原,主要在六钩蚴感染中间宿主的早期阶段分泌,其免疫血清在体外试验中能杀死六钩蚴,是猪囊尾蚴病疫苗研制的主要候选抗原之一。在已有的研究中,Tsol18重组蛋白在原核系统中多以包涵体形式表达,给蛋白质的复性和纯化带来许多困难,并且包涵体活性较低、保存期短、降解快,因而限制了Tsol18在猪囊尾蚴病疫苗研制上的应用。鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)是一种常见的侵袭性胞内菌,通过基因工程方法减毒后对宿主致病性显著降低,但仍保留良好的侵袭力,可将免疫抗原直接递呈给免疫细胞而诱导特异性的免疫应答反应,减毒鼠伤寒沙门氏菌作为口服疫苗载体是目前疫苗免疫研究的热点之一。为了优化猪囊尾蚴病疫苗候选抗原Tsol18重组蛋白,探索猪囊尾蚴病口服重组活载体疫苗的免疫应答,研究其在猪囊尾蚴病免疫预防上的作用,进行了本项研究。收集成熟的猪带绦虫虫卵,经孵化和激活后,提取六钩蚴总RNA,设计特异性引物RT-PCR扩增Tsol18基因片段,并同义突变Tsol18基因片段中四个大肠杆菌低利用率密码子,截去其N端的16个氨基酸的信号肽编码序列,构建原核表达载体pGEX-4T-Tsol18并表达,进行GST-Tsol18重组蛋白的SDS-PAGE、Western blot及稳定性分析,并以GST-Tsol18重组蛋白为抗原制备兔高免血清;将改造的Tsol18基因片段插入Asd+的组成型表达载体pYA3341,构建重组载体pYA3341-Tsol18,将重组载体电转化入缺失腺苷酸环化酶(Δcya)、环腺苷酸受体蛋白基因(Δcrp)以及天冬氨酸-β-半醛脱氢酶(Δasd)的减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550,研究重组活载体疫苗X4550(pYA3341-Tsol18)表达Tsol18重组蛋白的免疫原性、生长稳定性、口服安全性及在小鼠体内的分布情况,ELISA检测免疫小鼠血清和肠液中抗Tsol18抗体的产生情况,流式细胞术分析其脾细胞亚型的分化,ELISA检测免疫猪血清中抗Tsol18抗体的动态变化,探讨重组疫苗可能的免疫应答。结果显示改造后的GST-Tsol18重组蛋白多以可溶性形式表达,蛋白表达量占菌体总蛋白的24 %,Western blot证明GST-Tsol18重组蛋白具有良好的抗原性,4℃保存120 d只有20.1 %降解,显示重组蛋白稳定性有很大改善。重组疫苗4550(pYA3341-Tsol18)在没有选择压力的情况下连续培养100代后,随机挑选的重组疫苗株全部都能生长和表达Tsol18重组蛋白,表明重组疫苗生长稳定;BALB/c鼠口服重组疫苗株2.0×1012 cfu 30天后,存活率100 %,证实重组疫苗口服安全可靠,小鼠口服免疫后第21天在脾脏仍能测到大量的重组疫苗株,表明重组疫苗在体内能够长久存活,有利于刺激机体产生持久的免疫应答;ELISA检测显示在二免后四周小鼠血清中抗Tsol18 IgG抗体的OD值达到0.645,二免后六周小鼠肠液中有抗Tsol18分泌性IgA抗体产生,表明重组疫苗能诱导小鼠产生较强的抗体水平和激发多种免疫应答方式;免疫小鼠的CD4+、CD8+T淋巴细胞数目明显增多,CD4+/CD8+ T细胞比值也显著增高(P<0.01),提示口服疫苗4550(pYA3341-Tsol18)可能同时诱导Th1和Th2免疫应答反应。猪免疫后20 d抗Tsol18 IgG抗体水平开始上升,在二免后30天抗体OD值达到1.025,表明重组疫苗能诱导猪产生抗猪囊尾蚴病的免疫应答效应。本研究获得了具有高效表达、良好免疫原性和稳定性的猪囊尾蚴病疫苗候选抗原GST-Tsol18重组蛋白,构建了携带Tsol18重组蛋白的减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗4550(pYA3341-Tsol18),初步进行了重组疫苗的免疫学研究,为猪囊尾蚴病基因工程疫苗的研制和应用开拓了新的思路。

关键词：猪带绦虫六钩蚴 Tsol18 减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗免疫学

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感染减毒鼠伤寒沙门氏菌对小鼠粪样代谢组的影响——WIPM和Bruker 500 MHz核磁共振波谱仪检测结果的比较

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波谱学杂志 2014年第3期31卷 349-363页

作者：陈璐宋侃王玉兰中国科学院生物磁共振分析重点实验室波谱与原子分子物理国家重点实验室武汉磁共振中心(中国科学院武汉物理与数学研究所)湖北武汉430071 长江航务管理局疾病预防控制中心湖北武汉430019 中国科学院大学北京100049

鼠伤寒沙门氏菌属于胞内侵袭性兼性厌氧菌,减毒后的鼠伤寒沙门氏菌安全性大大提高,已被广泛用于病毒、细菌及寄生虫疫苗的研制.但是目前还没有研究利用代谢组学方法来分析减毒鼠伤寒沙门氏菌感染对宿主和肠道菌群相互作用的影响.同时中... 详细信息

鼠伤寒沙门氏菌属于胞内侵袭性兼性厌氧菌,减毒后的鼠伤寒沙门氏菌安全性大大提高,已被广泛用于病毒、细菌及寄生虫疫苗的研制.但是目前还没有研究利用代谢组学方法来分析减毒鼠伤寒沙门氏菌感染对宿主和肠道菌群相互作用的影响.同时中国科学院武汉物理与数学研究所自主研发的WIPM 500 MHz核磁共振(NMR)波谱仪已经研制成功,但是该谱仪是否可以用于代谢组学研究尚未经过考证.本研究同时使用WIPM和Bruker500 MHz核磁共振波谱仪对同一批减毒鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠的粪样进行检测,并结合多变量数据分析方法来研究减毒鼠伤寒沙门氏菌感染对小鼠粪样代谢组的影响.研究结果表明,WIPM NMR波谱仪检测数据的分析结果与Bruker NMR波谱仪的实验结果具有高度的一致性,表明WIPM谱仪可以用于代谢组学研究.研究发现减毒鼠伤寒沙门氏菌感染能够引起小鼠粪样代谢物中多种氨基酸和尿嘧啶含量的上升,并伴有胆汁酸、乳酸和丙酸含量的下降.以上代谢物含量的改变表明,减毒鼠伤寒沙门氏菌感染使小鼠肠道微生物的代谢功能发生了紊乱.

关键词：核磁共振(NMR) 粪样代谢组减毒鼠伤寒沙门氏菌谱仪对比

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以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体构建幽门螺杆菌疫苗候选株的实验研究

以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体构建幽门螺杆菌疫苗候选株的实验研究

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作者：朱森林中山医科大学

学位级别：博士

在该研究中,我们选择HpUreB和HpaA为靶抗原,应用基因重组技术,构建三个分别表达HpHpaA基因、UreB基因和UreB/HpaA融合基因的减毒鼠伤寒沙门氏菌株,并初步研究了这些Hp疫苗候选株对小鼠的免疫保护作用,探索以减毒鼠伤寒沙门氏菌为抗原释... 详细信息

在该研究中,我们选择HpUreB和HpaA为靶抗原,应用基因重组技术,构建三个分别表达HpHpaA基因、UreB基因和UreB/HpaA融合基因的减毒鼠伤寒沙门氏菌株,并初步研究了这些Hp疫苗候选株对小鼠的免疫保护作用,探索以减毒鼠伤寒沙门氏菌为抗原释放系统构建双价Hp疫苗的可行性.结论:1、用基因工程的方法成功构建了表达HpHpaA、UreB和UreB/HpaA(融合蛋白)的以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的HpR疫苗候选株.2、重组疫苗候选株无有免疫原性和较好的稳定性.3、重组疫苗候选对实验小鼠有不同程度的免疫保护效果,双价疫苗候选株保护效果比单价疫苗候选株好.4、成功地在Hp抗原融合蛋白UreB/HpaA中间插入由三个甘氨酸残基组成的柔韧接头.这样构建的双价疫苗候选株两个蛋白不会因为融合而导致空间结构的相互影响,从而保留了各自的免疫原性.该法为构建双价甚至多价Hp活载体疫苗提供了新的方法.

关键词：幽门螺杆菌尿素酶粘附素减毒鼠伤寒沙门氏菌

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以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的重组NDV-HN口服疫苗的构建与鉴定

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中国畜牧兽医 2013年第11期40卷 59-63页

作者：田芳华程相朝张春杰李银聚李静刘一尘河南科技大学动物科技学院河南洛阳471003

试验旨在构建表达鸡新城疫病毒(NDV)HN基因的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)。以pMD18-T-HN为模板,通过PCR扩增出NDV HN基因片段,定向插入原核表达载体pYA3493中,将重组表达质粒pYA3493-HN转入χ6097,再转入减毒... 详细信息

试验旨在构建表达鸡新城疫病毒(NDV)HN基因的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)。以pMD18-T-HN为模板,通过PCR扩增出NDV HN基因片段,定向插入原核表达载体pYA3493中,将重组表达质粒pYA3493-HN转入χ6097,再转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd,通过双酶切和PCR对质粒进行鉴定。结果表明,携带NDV HN基因片段的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)构建成功。本研究结果为开发鸡新城疫的口服基因工程活载体疫苗奠定了基础。

关键词：新城疫 HN基因原核表达载体pYA3493 减毒鼠伤寒沙门氏菌

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以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的肠出血性大肠杆菌EHEC O157：H7疫苗的实验研究

以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的肠出血性大肠杆菌EHEC O157：H7疫...

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作者：宁元元第三军医大学

学位级别：硕士

研究背景及目的O157:H7是肠出血性大肠杆菌的一个主要血清型(本文简称为O157),感染该菌可使人患腹泻、出血性结肠炎、也可引发溶血性尿毒综合征及血小板减少性紫癜等并发症,严重者可导致死亡。自1982年被确定为致病菌的20多年间,世界各... 详细信息

研究背景及目的 O157:H7是肠出血性大肠杆菌的一个主要血清型(本文简称为O157),感染该菌可使人患腹泻、出血性结肠炎、也可引发溶血性尿毒综合征及血小板减少性紫癜等并发症,严重者可导致死亡。自1982年被确定为致病菌的20多年间,世界各地已发生了多起O157的暴发流行,表明O157的感染已成为一个全球性的公共卫生问题。然而目前缺乏有效的防治方法,研究证实抗生素可促使O157菌释放致死性志贺毒素(Stx),从而使患者并发溶血性尿毒综合症的危险性增加,因此,研制O157疫苗对预防和控制O157感染有着极其重大的意义。 EspA(大肠杆菌分泌蛋白A)、IntiminC300(紧密粘附素Intimin C端片段约1/3部分)和Stx2B(志贺毒素2 B亚单位)都是O157重要的保护性抗原。EspA作为O157Ⅲ型分泌系统的重要元件,在O157感染引起的宿主细胞A/E(attaching/effacing)损伤过程中起重要的桥梁作用。人和动物感染O157后,机体可产生高水平的EspA抗体。紧密粘附素(Intimin)介导细菌与肠上皮细胞的紧密粘附,是O157最主要的定植因子,尤其是它的C端约1/3部分(Intimin-C)为胞外功能区,可与相应受体结合,具有良好的免疫原性和免疫保护性。Stx2是O157致溶血性尿毒综合征的一个主要毒素,其中B亚单位(Stx2B)具有细胞结合的特性,表现出良好的免疫原性,而针对Stx2B的单克隆抗体具阻断毒素的作用。减毒沙门氏菌因为能够通过粘附、侵袭、定居在肠道相关淋巴组织,已被证实为有效的粘膜免疫载体工具,可经肠系膜淋巴结到达肝脏、脾脏,进一步有效地刺激机体产生粘膜、细胞和体液免疫应答。特别是近来利用不以抗生素作为选择压力的载体-宿主平衡致死系统构建的减毒沙门氏菌载体疫苗已显示出良好的应用前景。因此本实验利用pYA3149的载体-宿主平衡致死系统表达O157的EspA及其IntiminC300、Stx2B的融合保护性抗原,构建以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的肠出血性大肠杆菌O157:H7疫苗,并通过动物实验观察重组载体疫苗的免疫原性及免疫保护性,为发展新型的O157疫苗提供实验依据。实验结果: 1.采用PCR技术扩增获得了579bp的EspA基因、1476bp的EspA-IntiminC300和1767bp的EspA-IntiminC300-Stx2B融合基因,经测序鉴定正确后分别连接到平衡-致死载体pYA3149上,再依次转化大肠杆菌DH5α的asd基因缺失突变株x6097、沙门氏菌中间宿主x3730及终宿主菌x4550。IPTG诱导重组工程菌x4550 (pYA3149- EspA)、X4550(pYA3149-EspA-IntiminC300)及X4550(pYA3149- EspA- Intimin C 300-Stx2B),成功表达了上述三种抗原蛋白,免疫印迹证实所表达蛋白能与相应抗体发生抗原抗体反应。 2.对重组减毒伤寒沙门氏菌载体疫苗株进行体外稳定性实验, x4550 (pYA3149-EspA)、X4550(pYA3149-EspA-IntiminC300)及X4550(pYA3149- EspA- Intimin C300-Stx2B)在有选择压力(不含DAP)和无选择压力(含DAP)的条件下传10代后随机挑取100个菌落分别接种于不含DAP的LB平板及含DAP的LB平板上培养,结果无论有无选择压力存在,所挑取的菌落99%均生长,从中随机选出20个菌落抽提质粒,95%的菌落含有重组质粒。表明构建的重组工程菌在体外有较好的遗传稳定性。 3.以重组减毒伤寒沙门氏菌载体疫苗口服免疫三次Balb/c小鼠后,各实验组免疫后血清特异性抗体GMT值与免疫前相比均差异显著(p<0.001),与对照组相比也差异显著(p<0.001)。三次口服后再注射重组蛋白加强免疫一次,血清特异性抗体大幅增高(p<0.001)。 4.利用肥达氏反应、SS选择培养、PCR、免疫荧光等方法检测,进一步证实重组减毒伤寒沙门氏菌载体疫苗3次口服免疫后能在小鼠脾、Peyer,s结和回肠定植,且能特异表达O157的相关抗原。 5.免疫后小鼠以1×109CFU/只剂量的O157全菌液进行攻毒免疫保护实验,结果表明3次口服重组载体疫苗后x4550(pYA3149-EspA)、x4550(pYA3149-EspA–Intimin C300)及x4550(pYA3149-EspA-IntiminC300-Stx2B)组保护率分别为36%、44%和62%,注射重组蛋白加强免疫后

关键词： O157:H7大肠杆菌减毒鼠伤寒沙门氏菌平衡致死系统 III型分泌蛋白EspA 紧密粘附素志贺毒素

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大肠杆菌K88ac-ST Ⅱ融合基因在减毒鼠伤寒沙门氏菌中的表达与免疫

大肠杆菌K88ac-ST Ⅱ融合基因在减毒鼠伤寒沙门氏菌中的表达与免疫

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作者：杨冬梅石河子大学

学位级别：硕士

为了构建表达大肠杆菌菌毛蛋白K88ac和热稳定肠毒素STII融合基因的无抗性减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,并对其免疫效果进行研究。根据GenBank中登录号为m29375的K88ac基因序列以及减毒鼠伤寒沙门氏菌原核表达载体pYA3334的多克隆位点设计... 详细信息

为了构建表达大肠杆菌菌毛蛋白K88ac和热稳定肠毒素STII融合基因的无抗性减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,并对其免疫效果进行研究。根据GenBank中登录号为m29375的K88ac基因序列以及减毒鼠伤寒沙门氏菌原核表达载体pYA3334的多克隆位点设计特异性引物P1、P2,并在上下游引物的5’端分别引入NcoI和BamHI酶切位点,从大肠杆菌DE3(pET- K88ac-STⅡ)中通过聚合酶链式反应(PCR)扩增得到K88ac-STⅡ融合基因。回收纯化后将K88ac-STⅡ融合基因用T4DNA连接酶连于克隆载体pBS-T上,热击转化受体大肠杆菌Top10,蓝白斑筛选阳性菌落,酶切鉴定证明其中含有K88ac-STⅡ融合基因片段,再测序鉴定该融合基因序列的正确性,命名为pBS-K88ac-STⅡ。之后采用缺失腺苷酸环化酶基因(Δcya)、环腺苷酸受体蛋白基因(Δcrp)以及天冬氨酸β-半醛脱氢酶基因(Δasd)的鼠伤寒沙门氏菌(X4550)作为宿主,将编码K88ac-STII的融合基因切下插入Asd+组成型表达载体pYA3334中,鉴定后通过电转化引入宿主菌X4550中,再次酶切鉴定正确后,过夜培养进行SDS-PAGE和Western-Blot试验,检测其特异性蛋白表达情况。最后分别以重组菌株X4550(pYA3334-K88ac-STII)灌服小鼠作为试验组,以转化了空载体的菌株X4550(pYA3334)作为空载体对照组,同时设PBS空白对照组,分别对三个分组的小鼠进行免疫,采集血清检测其抗体效价,之后免疫小鼠用强毒株C83915(STⅡ﹢)攻击,观察结果。本实验成功构建了表达K88ac-STII融合基因平衡致死的减毒鼠伤寒沙门氏重组菌株X4550(pYA3334-K88ac-STII),该重组菌株在33Kda处有特异性表达的蛋白条带,与预期分子量大小一致,而空载体对照菌X4550(pYA3334)在该处未有相应条带出现。Western-blot免疫印迹结果显示重组菌株X4550(pYA3334-K88ac-STII)表达的蛋白能够被K88ac阳性血清特异性结合,在相应位置出现特异性显色条带。这证明重组菌株能够表达K88ac-STII特异性融合蛋白,重组菌的体外稳定实验也证明其有良好的稳定性,从而保证了K88ac-STII抗原能够得以持续表达。而且试验小鼠灌喂重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550 (pYA3334-K88ac-STII)后,能够产生特异性的抗体,而且对大肠杆菌强毒株具有一定的抵抗力。这为进一步研制相应的抗仔猪大肠杆菌病及相应的沙门氏菌病的双价活疫苗侯选株奠定了重要基础。

关键词：大肠杆菌 K88ac-STⅡ融合基因减毒鼠伤寒沙门氏菌重组

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表达绿色荧光蛋白重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建

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江苏农业研究 2001年第3期22卷 55-58页

作者：王芳焦新安潘志明刘文博高崧张扬张如宽刘秀梵扬州大学农业部畜禽传染病重点开放实验室江苏扬州225009

应用DNA重组技术构建了表达绿色荧光蛋白 (GFP)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。用EcoRⅠ和NcoⅠ将pEGFP质粒中的绿色荧光蛋白基因EGFP切下 ,克隆进表达载体质粒pYA3334的EcoRⅠ和NcoⅠ位点之间 ,构建成重组表达质粒pYAGFP ,然后转化大肠杆菌... 详细信息

应用DNA重组技术构建了表达绿色荧光蛋白 (GFP)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。用EcoRⅠ和NcoⅠ将pEGFP质粒中的绿色荧光蛋白基因EGFP切下 ,克隆进表达载体质粒pYA3334的EcoRⅠ和NcoⅠ位点之间 ,构建成重组表达质粒pYAGFP ,然后转化大肠杆菌X6 2 12、中间宿主X3730、终末宿主X45 5 0。X45 5 0于LB培养基上呈绿色 ,在荧光显微镜下观察 ,整个菌体发绿色荧光。构建的表达GFP的重组鼠伤寒沙门氏菌为减毒沙门氏菌活载体基因工程疫苗的研制提供一个良好模型。

关键词：绿色荧光蛋白减毒鼠伤寒沙门氏菌重组技术肠道疾病动物病

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苦丁茶提取物与减毒鼠伤寒沙门氏菌联合治疗对肿瘤的影响研究

苦丁茶提取物与减毒鼠伤寒沙门氏菌联合治疗对肿瘤的影响研究

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作者：徐海霞海南大学

学位级别：硕士

苦丁茶作为一种传统凉茶,很早之前就在传统中药中广泛使用。早期研究苦丁茶成分,发现其富含皂苷、黄酮、多酚、挥发油、多糖以及金属元素等多种有效成分,现代药理研究发现苦丁茶具有抗动脉粥样硬化、抗氧化、抗血管生成、抗病毒和抗癌... 详细信息

苦丁茶作为一种传统凉茶,很早之前就在传统中药中广泛使用。早期研究苦丁茶成分,发现其富含皂苷、黄酮、多酚、挥发油、多糖以及金属元素等多种有效成分,现代药理研究发现苦丁茶具有抗动脉粥样硬化、抗氧化、抗血管生成、抗病毒和抗癌等活性。细菌介导的癌症治疗方法的出现,解决了实体肿瘤治疗过程中药物无法到达缺氧坏死区域以及由于治疗周期长引起的耐药性等问题。我们从体内和体外两个方面,研究苦丁茶甲醇提取物(KDCE)与细菌联合治疗对小鼠结肠癌的影响。本实验旨在探讨KDCE结合减毒鼠伤寒沙门氏菌对小鼠结肠癌的治疗影响,为日后这一治疗手段应用于临床提供理论依据。体内实验:构建小鼠结肠癌模型,用KDCE和减毒鼠伤寒沙门氏菌治疗小鼠,KDCE灌胃治疗,细菌尾静脉注射。结果表明,与单纯的KDCE组和减毒鼠伤寒沙门氏菌组相比,KDCE与减毒鼠伤寒沙门氏菌的联合治疗对小鼠结肠癌的抑瘤性更好,KDCE并不影响细菌的靶向性,反而在短时间内增加了细菌在小鼠肿瘤组织中的聚集,在安全方面,KDCE并没有加重细菌的毒性,对其他器官的毒副作用小,最后得到结论,KDCE与细菌的联合对小鼠结肠癌模型具有更好的治疗效果。体外实验:用KDCE处理人脐静脉内皮细胞(HUVEC)24小时后,提取蛋白进行Western Blo检测,结果显示,KDCE抑制了血管内皮生长因子受体VEGFR2的表达,细胞增殖凋亡相关因子P-AKT和P-ERK却没有显著变化;同样,用KDCE处理人结肠癌细胞(HT-29),结果显示,KDCE对HT-29细胞的IC50为541.8μg/ml(24h)在蛋白水平上,KDCE对HT-29细胞中的P-AKT并没有影响,反而增加了ERK蛋白的磷酸化。综上所述,KDCE与减毒鼠伤寒沙门氏菌联合对小鼠结肠癌模型的治疗效果更佳,毒副作用也在安全范围内;KDCE能抑制HUVEC细胞中VEGFR2的表达,但不能显著影响细胞增殖凋亡相关因子AKT/ERK的磷酸化;KDCE可抑制HT-29的增殖,并增加HT-29细胞中ERK蛋白的磷酸化。

关键词：苦丁茶提取物细菌治疗减毒鼠伤寒沙门氏菌结肠癌

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TGEV S基因减毒鼠伤寒沙门氏菌重组活载体疫苗株的初步构建

TGEV S基因减毒鼠伤寒沙门氏菌重组活载体疫苗株的初步构建

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作者：秦学远四川农业大学

学位级别：硕士

本研究成功克隆了猪传染性胃肠炎SC-H株S蛋白A、D抗原位点基因S1和热敏肠毒素B亚单位基因LTB,并构建了S1及与LTB融合的重组表达载体pYA3342-S1和pYA3342-LTB-S1。将构建的重组质粒依次转化减毒沙门氏菌X3730和X4550,获得了2株能稳定表达... 详细信息

本研究成功克隆了猪传染性胃肠炎SC-H株S蛋白A、D抗原位点基因S1和热敏肠毒素B亚单位基因LTB,并构建了S1及与LTB融合的重组表达载体pYA3342-S1和pYA3342-LTB-S1。将构建的重组质粒依次转化减毒沙门氏菌X3730和X4550,获得了2株能稳定表达TGEV S蛋白减毒鼠伤寒沙门氏菌（***）疫苗株,为TGEV口服活载体疫苗的开发研究奠定了基础。 1.猪传染性胃肠炎S1基因片段和热敏肠毒素B亚单位基因的克隆本实验根据已发表的TGEV SC-H株S基因cDNA序列设计并合成一对特异性引物,以pMD19T-S质粒为模板,PCR扩增得到964bp的编码TGEV S蛋白A和D抗原位点的基因片段,并推导出321aa氨基酸序列,构建了克隆载体pMD19T-S1。根据Genbank上的猪源ETEC的LTB序列（M17873）,设计并合成一对特异性引物,PCR扩增得到395bp的基因片段,并推导出131aa氨基酸序列,构建了克隆载体pMD19T-LTB。用DNAstar软件将测序结果中LTB的ORF与GenBank中收录的猪源ETEC菌的LTB基因参考序列（M17873）相比较,其核苷酸同源性为100%。 2.减毒沙门氏菌表达TGEV S蛋白疫苗株的构建首先将LTB基因通过EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点转移到pVAX载体上,然后再将S1基因通过BamHⅠ和HindⅢ插入pVAX-LTB中,接着利用EcoRⅠ和HindⅢ将pVAX-LTB-S1质粒中的LTB-S1片段转入pYA3342质粒,最终得到沙门氏菌表达载体pYA3342-LTB-S1。同时,利用BamHⅠ和HindⅢ酶切位点将S1基因通过插入pYA3342质粒中,得到重组质粒pYA3342-S1。将pYA3342-S1和pYA3342-LTB-S1分别依次电转化X3730和X4550沙门氏菌,得到减毒沙门氏菌X4550（pYA3342-S1）和X4550（pYA3342-LTB-S1）;用SDS-PAGE分析在终浓度为1mmol/L IPTG的诱导下减毒沙门氏菌表达产物,结果表明S基因及与LTB融合基因在减毒沙门氏菌表达系统中都获得表达,表达的重组蛋白分别约为37kDa和49kDa。 3.重组疫苗株的生物学特性初步研究本实验构建的2株重组菌生长特性方面与X4550（pYA3342）相比没有显著变化;同时在LB（DAP+）液体培养基中连续传10代后,含重组质粒的菌株达到98%以上。1×1010或1×1011CFU重组菌X4550（pYA3342-LTB-S1）和X4550（pYA3342-S1）分别灌胃接种6～8周龄昆明小鼠,用PCR方法检测其肝脏和脾脏中的重组菌,结果接种后第3天都可在肝脏和脾脏中检测出两种重组减毒沙门氏菌,连续检出3周;连续观察30天,小鼠无异常症状。

关键词：猪传染性胃肠炎病毒 S基因减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株

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表达PCV2 Cap蛋白减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗的构建及动物免疫试验

表达PCV2 Cap蛋白减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗的构建及动物免疫...

引用

作者：赵红妮西北农林科技大学

学位级别：硕士

本研究目的旨在构建一种表达PCV2 Cap蛋白减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗,通过动物免疫试验对构建的疫苗进行评价。Cap蛋白是PCV2 ORF2基因编码的主要结构蛋白和免疫保护性蛋白,本研究选择截去N端41个氨基酸的核定位区的ORF2编码基因作... 详细信息

本研究目的旨在构建一种表达PCV2 Cap蛋白减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗,通过动物免疫试验对构建的疫苗进行评价。Cap蛋白是PCV2 ORF2基因编码的主要结构蛋白和免疫保护性蛋白,本研究选择截去N端41个氨基酸的核定位区的ORF2编码基因作为目的基因,利用减毒鼠伤寒沙门氏菌的平衡致死系统表达优化的ORF2基因,构建表达Cap蛋白的活载体疫苗,并对重组菌苗的生物学特性和免疫学特性进行评价。研究取得如下结果: 1表达猪圆环病毒Cap蛋白的鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗的构建合成特异性引物P1、P2,PCR扩增得到ORF2基因,将其插入经BamH I和Pst I双酶切的Asd+的组成型表达载体pYA3341中,构建重组表达载体pYA3341-ORF2;重组载体电转化入缺失天冬氨酸-β-半醛脱氢酶(Δasd)、腺苷酸环化酶(Δcya)以及环腺苷酸受体蛋白基因(Δcrp)的减毒鼠伤寒沙门氏菌中间宿主菌X3730及终末宿主菌X4550中,获得重组活载体疫苗菌X4550(pYA3341-ORF2)。 2重组活载体疫苗菌的生物学特性检测研究重组活载体疫菌苗X4550(pYA3341-ORF2)体外稳定特性、生长特性、口服安全性及在小鼠体内的定值分布情况。结果显示,Cap蛋白能在X4550中有高水平的表达,且重组菌能在体外稳定遗传、生长状态良好、口服安全无毒性及在机体中具有良好的定值分布特性。 3重组活载体疫苗菌的免疫原性研究将重组活载体疫苗菌X4550(pYA3341-ORF2)口服免疫Balb/C小鼠作为免疫组,以口服重组菌X4550(pYA3341)的小鼠作为阴性对照组,以口服PBS的小鼠作为空白对照组。ELISA方法检测疫苗免疫组小鼠血清抗体效价达到1:1920;间接免疫荧光法检测疫苗免疫组小鼠血清中和抗体效价可达到1:19.2;MTT法检测免疫组小鼠淋巴细胞分裂指数可达到4.26;流式细胞术检测疫苗免疫组小鼠的CD4+、CD8+T淋巴细胞数目分别约为29.9、7.52,CD4+/CD8+T细胞比值约为3.99。将重组活载体疫苗菌X4550(pYA3341-ORF2)免疫猪,ELISA法检测疫苗免疫猪血清抗体效价1:57.6;疫苗免疫组猪血清的中和抗体效价可达到1:11.2;疫苗免疫组淋巴细胞分裂指数可达到3.82。重组菌苗X4550(pYA3341-ORF2)能够稳定表达Cap蛋白,具有良好免疫原性,为该疫苗的进一步研制与临床应用提供参考依据。

关键词： PCV2 Cap蛋白减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗

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