检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：廖文俊中山大学

学位级别：博士

该课题拟应用基因工程技术构建能表达HP过氧化氢酶(KatA)、尿毒酶A亚单位(UreA) 及UreA/KatA融合蛋白的质粒表达载体,观察目的基因在大肠杆菌中的表达情况,然后将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门氏菌中制备成口服活疫苗株,最后在动物实验... 详细信息

该课题拟应用基因工程技术构建能表达HP过氧化氢酶(KatA)、尿毒酶A亚单位(UreA) 及UreA/KatA融合蛋白的质粒表达载体,观察目的基因在大肠杆菌中的表达情况,然后将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门氏菌中制备成口服活疫苗株,最后在动物实验中观察该疫苗株在预防HP感染中的作用.KatA疫苗株具有免疫保护作用,尤以3×10<'8>CFU/只KatA接种免疫组效果最佳;UreA/KatA疫苗株亦有保护性作用;但UreA疫苗株的作用不明显.该研究通过应用表达KatA和UreA/KatA双价抗原的减毒沙门氏菌载体活疫苗免疫动物,诱导出抗HP保护性免疫效应,提示以减沙门氏菌疫苗株作为口服活疫苗的运载体并诱导有效免疫保护作用的策略是可行的,实验为进一步的应用研究奠定了基础,该疫苗有望作为一种新型疫苗在HP感染及其相关性疾病的防治中发挥积极作用.

关键词：幽门螺杆菌疫苗尿素酶过氧化氢酶减毒鼠伤寒沙门氏菌

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基因重组鼠伤寒沙门氏菌防龋疫苗的研究Ⅱ.携带变形链球菌pac基因表达质粒的构建与初步鉴定

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华西口腔医学杂志 2001年第3期19卷 139-141页

作者：陈罕凌均棨杨国平涂家珍中山医科大学口腔医学院 510060 中山医科大学口腔医学院 510060

目的 :构建携带变形链球菌表面蛋白pac基因A区片段的原核高效表达系统。方法 :对含变形链球菌表面蛋白pac基因的pPC41质粒进行PCR扩增 ,获得了pac基因A区片段 ;将扩增获得pac基因A区片段与表达质粒pET17 b定向克隆 ,重组质粒用BamHI,Ec... 详细信息

目的 :构建携带变形链球菌表面蛋白pac基因A区片段的原核高效表达系统。方法 :对含变形链球菌表面蛋白pac基因的pPC41质粒进行PCR扩增 ,获得了pac基因A区片段 ;将扩增获得pac基因A区片段与表达质粒pET17 b定向克隆 ,重组质粒用BamHI,EcoRV双酶切后电泳鉴定。结果 :获得携带pac基因A区片段的重组质粒。结论

关键词：变形链球菌表面蛋白减毒鼠伤寒沙门氏菌龋齿基因重组质粒

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减毒沙门氏菌介导的冠状病毒基因疫苗及其免疫生物学特性

减毒沙门氏菌介导的冠状病毒基因疫苗及其免疫生物学特性

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作者：焦红梅扬州大学

学位级别：博士

确认SARS的病原体为冠状病毒以来,冠状病毒的分子生物学和免疫学的研究成为人们研究的热点之一。冠状病毒是基因组最大的RNA病毒,可感染包括人在内的多种动物。人冠状病毒229E和OC43引起10%～30%的普通感冒,其他冠状病毒可感染呼吸道、... 详细信息

确认SARS的病原体为冠状病毒以来,冠状病毒的分子生物学和免疫学的研究成为人们研究的热点之一。冠状病毒是基因组最大的RNA病毒,可感染包括人在内的多种动物。人冠状病毒229E和OC43引起10%～30%的普通感冒,其他冠状病毒可感染呼吸道、消化道和中枢神经系统等,引起猪、牛、鸡等严重的疾病,有时造成很大的经济损失。冠状病毒致病机理和免疫特性的研究还不十分深入。禽源冠状病毒-鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV),为冠状病毒属的代表,引起鸡的一种急性、高度接触性传染病。减毒苗常用于预防疾病,但效果不理想且存在毒力返强的危险。为此,IB已成为养禽业最难控制的疫病之一。鼠源冠状病毒-小鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus,MHV),可引起易感小鼠的肝炎和脑脊髓炎,可诱发中枢神经系统脱髓鞘。后者与人的中枢神经系统脱髓鞘疾病(多发性硬化症)致病机理相似。因此,中枢神经系统感染小鼠肝炎病毒可作为急性病毒性脑脊髓炎和人类脱髓鞘疾病-多发性硬化症的模型。本研究以IBV和MHV为代表,通过RT-PCR分别扩增出其S1基因和N基因,并构建了这两种基因的真核表达质粒,用减毒沙门氏菌作为运送真核表达质粒的载体,以小鼠为动物模型,探讨冠状病毒的分子免疫特性。目前现有的IB基因工程疫苗虽可诱导机体产生一定的免疫保护效应,但与传统免疫相比,还存在一定的差距。增强IBV DNA疫苗的免疫效果对于预防IB的发生已显得尤为重要。本研究在真核表达质粒pVAX1-S1的基础上,分别构建出共表达鸡IFN-γ、鸡IL-18和嵌合CpG DNA的IBV DNA疫苗,并分别将其导入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207中,构建了重组减毒鼠伤寒沙门氏菌

关键词：鸡传染性支气管炎病毒小鼠肝炎病毒 S1蛋白 N蛋白基因疫苗减毒鼠伤寒沙门氏菌免疫生物学

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携大熊猫轮状病毒CH-1株VP4-VP7双基因的减毒沙门氏菌的构建与免疫原性研究

携大熊猫轮状病毒CH-1株VP4-VP7双基因的减毒沙门氏菌的构建与免...

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作者：马磊四川农业大学

学位级别：硕士

大熊猫轮状病毒(Giant Panda Rotavirus, GPRV)因引起幼龄大熊猫(5-11月龄)传染性和顽固性腹泻,导致多器官衰竭而死亡,其发病率可达100%,对大熊猫的种群扩大造成巨大威胁。目前主要是依靠加强饲养管理预防轮状病毒感染,但由于环境等因... 详细信息

大熊猫轮状病毒(Giant Panda Rotavirus, GPRV)因引起幼龄大熊猫(5-11月龄)传染性和顽固性腹泻,导致多器官衰竭而死亡,其发病率可达100%,对大熊猫的种群扩大造成巨大威胁。目前主要是依靠加强饲养管理预防轮状病毒感染,但由于环境等因素的影响效果不是很理想,为此免疫预防成了防制该病的主要措施和研究热点。本试验对以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的大熊猫轮状病毒VP4和VP7双基因疫苗的构建及对小鼠免疫试验进行研究。1.大熊猫轮状病毒VP4和VP7基因的克隆及鉴定根据GenBank中大熊猫轮状病毒CH-1株VP4和VP7基因序列,分别设计引物,经RT-PCR成功得到GPRV-VP4(2331bp)和GPRV-VP7(981bp)基因的核苷酸序列,分别进行克隆后,测序鉴定得到正确的GPRV-VP4和GPRV-VP7基因核苷酸序列。2.大熊猫轮状病毒VP4和VP7双基因的减毒沙门氏菌的构建选择真核表达质粒pVAX1,将正确的GPRV-VP4和GPRV-VP7基因分别插入表达载体pVAX1中构建含有VP4和VP7基因的单基因表达载体pVAX1-GPR V-VP4、pVAX1-GPRV-VP7和双基因表达载体pVAX1-GPRV-VP4-VP7,并将重组质粒转化减毒沙门氏菌S.L7207得到重组菌株S.L7207/pVAX1-GPRV-VP4、S. L7207/pVAX1-GPRV-VP7和S.L7207/pVAX1-GPRV-VP4-VP7。经PCR、酶切和测序鉴定,表明重组菌构建成功；分别提取重组菌质粒转染IPEC-J2细胞,经间接免疫荧光试验和RT-PCR检测并测序鉴定后,表明重组质粒均能在IPEC-J2细胞中表达。3.携带GPRV-VP4-VP7基因的DNA疫苗的免疫学性质对重组菌株S.L7207/pVAX1-VP4-VP7进行体外稳定性检测,并以不同剂量口服接种BALB/c小鼠,分析其安全性、目的基因在体内的转录和体内稳定性,进行小鼠血清抗体检测和细胞因子检测,并用MTT法检测脾淋巴细胞的增殖等特性鉴定。结果表明,重组菌在Kan抗性下稳定性好,以安全剂量1×108CFU口服接种小鼠后,重组菌携带的S.L7207/pVAX1-VP4-VP7接种小鼠后3d在肠道部位有VP4和VP7基因的转录,并且重组菌在小鼠体内15d内比较稳定；重组菌S.L7207/pVAX1-VP4-VP7免疫组产生抗体与对照组相比差异显著(P<0.05),重组菌刺激脾淋巴细胞增殖与对照组差异显著(P<0.05),结合血清细胞因子检测结果说明重组菌株具有良好的免疫原性。综合试验结果表明,本试验构建的以减毒沙门氏菌为载体的疫苗具有良好的安全性、稳定性和免疫原性,可为大熊猫轮状病毒疫苗研究奠定基础。

关键词：大熊猫轮状病毒 VP4 VP7 减毒鼠伤寒沙门氏菌免疫原性

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以减毒鼠伤寒沙门菌为递送载体的人呼吸道合胞病毒融合蛋白DNA疫苗滴鼻免疫抗体分析

以减毒鼠伤寒沙门菌为递送载体的人呼吸道合胞病毒融合蛋白DNA疫...

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作者：程明安徽医科大学

学位级别：硕士

目的:人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,RSV)广泛分布于世界各地,是导致婴幼儿严重下呼吸道感染的最重要的病毒病原。目前尚无特异性防治方法,世界卫生组织将发展RSV疫苗列为最优先发展的疫苗项目之一。RSV的11种蛋... 详细信息

目的:人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,RSV)广泛分布于世界各地,是导致婴幼儿严重下呼吸道感染的最重要的病毒病原。目前尚无特异性防治方法,世界卫生组织将发展RSV疫苗列为最优先发展的疫苗项目之一。RSV的11种蛋白中,融合蛋白(Fusion glycoprotein,F)是中和抗原,免疫动物后,可以产生具有免疫保护作用的中和抗体。本研究以减毒鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium aroA strain SL7207, SL7207)为载体携带可表达RSV密码子优化的F蛋白的真核表达质粒,探讨不同黏膜免疫途径及密码子优化对免疫效果的影响。方法:通过对RSV野生型F基因(Fwt)进行密码子优化,获得密码子优化的F基因(Fsyn),并构建可表达Fsyn的真核表达质粒pcDNA3.1/Fsyn,通过Western blot分析来检测真核表达质粒pcDNA3.1/Fsyn的体外表达水平。转化SL7207得到SL7207/pcDNA3.1/Fsyn ,构建重组的减毒鼠伤寒沙门菌疫苗SL7207/pcDNA3.1/Fsyn。经重组菌体外稳定性试验后,分别经单次滴鼻和灌胃免疫途径,免疫BALB/c小鼠,通过体液免疫、黏膜免疫和细胞免疫等指标分析免疫后小鼠RSV特异性免疫应答产生情况,以及免疫效果的持续时间。结果:取已转化pcDNA3.1/Fsyn的SL7207提取质粒,经限制性内切酶分析、测序与预期一致。与野生型相比较,可表达密码子优化型F蛋白的真核表达质粒pcDNA3.1/Fsyn体外表达水平高;重组的减毒鼠伤寒沙门菌疫苗SL7207/pcDNA3.1/Fsyn具有较好的体外传代稳定性(保持在89%以上)。与灌胃组相比,滴鼻组诱导小鼠产生了更高水平的血清IgG和呼吸道黏膜分泌型IgA(Secretary IgA, SIgA),获得了更好的免疫效果(P<0.05)。与野生型相比,密码子优化的F蛋白具有更好的免疫原性(P<0.05)。结论:获得的重组减毒鼠伤寒沙门菌疫苗SL7207/pcDNA3.1/Fsyn,能够诱导机体产生有效的体液免疫和局部免疫。经滴鼻途径免疫和密码子优化能够提高以SL7207为载体的RSV DNA疫苗免疫效果。因此我们认为以减毒伤寒沙门菌为载体的滴鼻DNA疫苗兼具黏膜免疫及DNA疫苗的双重优点,是RSV等通过黏膜途径感染的病毒疫苗研究的重要方向,为今后RSV疫苗免疫策略等研究奠定了坚实基础。

关键词：人呼吸道合胞病毒融合蛋白密码子优化黏膜免疫减毒鼠伤寒沙门氏菌 SL7207

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减毒沙门氏菌介导PNP/MePdR自杀基因系统的抗胰腺癌细胞作用

减毒沙门氏菌介导PNP/MePdR自杀基因系统的抗胰腺癌细胞作用

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作者：林勇苏州大学

学位级别：硕士

目的构建含有pEGFP-C1-PNP质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261菌株，检测其在胰腺癌细胞BxPc-3中的表达。探讨减毒沙门氏菌作为载体介导PNP/MePdR自杀基因系统对胰腺癌细胞BxPc-3的杀伤作用。方法1. PCR扩增得到PNP基因，构建真核表达载体p... 详细信息

目的构建含有pEGFP-C1-PNP质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261菌株，检测其在胰腺癌细胞BxPc-3中的表达。探讨减毒沙门氏菌作为载体介导PNP/MePdR自杀基因系统对胰腺癌细胞BxPc-3的杀伤作用。方法 1. PCR扩增得到PNP基因，构建真核表达载体pEGFP-C1-PNP，并进行酶切、PCR、和测序鉴定。利用电转化法将重组质粒转入减毒沙门氏菌SL3261，进行细菌形态学和表面抗原稳定性检测。含质粒SL3261菌株与胰腺癌细胞BxPc-3体外共培养，利用荧光显微镜和RT-PCR分别检测GFP的表达和PNP基因的转录。 2.将携带PNP基因的减毒沙门氏菌SL3261与胰腺癌细胞BxPc-3体外共培养，加入前体药物MePdR，MTT法检测MePdR对BxPc-3细胞的杀伤作用和旁观者效应。结果 1.目的基因正确连接pEGFP-C1中，并成功转入减毒鼠伤寒沙门氏菌，感染细胞亦检测到目的基因表达。 2.受SL3261/pEGFP-C1-PNP感染的BxPc-3细胞对MePdR很敏感，作用5天后其IC50为0.1mg/L。当MePdR浓度为1mg/L时，受SL3261/pEGFP-C1-PNP感染的细胞半数死亡发生在加药后第三天。5%的PNP阳性细胞与95%的非阳性细胞混合，就可使多数细胞被杀死。结论成功构建了能携带ePNP基因真核表达质粒的SL3261菌株，且能在胰腺癌细胞中正确表达。减毒沙门氏菌作为载体介导PNP/MePdR自杀基因系统对胰腺癌细胞具有杀伤作用，且旁观者效应明显。

关键词：减毒鼠伤寒沙门氏菌 PNP/MePdR自杀基因系统 BxPc-3细胞旁观者效应

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以减毒鼠伤寒沙门菌为载体的人呼吸道合胞病毒融合蛋白DNA疫苗滴鼻免疫抗体分析

以减毒鼠伤寒沙门菌为载体的人呼吸道合胞病毒融合蛋白DNA疫苗滴...

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作者：程明安徽医科大学

学位级别：硕士

目的:人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,RSV)广泛分布于世界各地,是导致婴幼儿严重下呼吸道感染的最重要的病毒病原。目前尚无特异性防治方法,世界卫生组织将发展RSV疫苗列为最优先发展的疫苗项目之一。RSV的11种蛋白中,融合蛋白(Fusion glycoprotein,F)是中和抗原,免疫动物后,可以产生具有免疫保护作用的中和抗体。本研究以减毒鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium aroA strain SL7207,SL7207)为载体携带可表达RSV密码子优化的F蛋白的真核表达质粒,探讨不同黏膜免疫途径及密码子优化对免疫效果的影响。<br>　　方法:通过对RSV野生型F基因(Fwt)进行密码子优化,获得密码子优化的F基因(Fsyn),并构建可表达Fsyn的真核表达质粒pcDNA3.1/Fsyn,通过Western blot分析来检测真核表达质粒pcDNA3.1/Fsyn的体外表达水平。转化SL7207得到SL7207/pcDNA3.1/Fsyn,构建重组的减毒鼠伤寒沙门菌疫苗SL7207/pcDNA3.1/Fsyn。经重组菌体外稳定性试验后,分别经单次滴鼻和灌胃免疫途径,免疫BALB/c小鼠,通过体液免疫、黏膜免疫和细胞免疫等指标分析免疫后小鼠RSV特异性免疫应答产生情况,以及免疫效果的持续时间。<br>　　结果:取已转化pcDNA3.1/Fsyn的SL7207提取质粒,经限制性内切酶分析、测序与预期一致。与野生型相比较,可表达密码子优化型 F蛋白的真核表达质粒pcDNA3.1/Fsyn体外表达水平高;重组的减毒鼠伤寒沙门菌疫苗SL7207/pcDNA3.1/Fsyn具有较好的体外传代稳定性(保持在89％以上)。与灌胃组相比,滴鼻组诱导小鼠产生了更高水平的血清IgG和呼吸道黏膜分泌型IgA(Secretary IgA,SIgA),获得了更好的免疫效果(P＜0.05)。与野生型相比,密码子优化的F蛋白具有更好的免疫原性(P＜0.05)。<br>　　结论:获得的重组减毒鼠伤寒沙门菌疫苗SL7207/pcDNA3.1/Fsyn,能够诱导机体产生有效的体液免疫和局部免疫。经滴鼻途径免疫和密码子优化能够提高以SL7207为载体的RSV DNA疫苗免疫效果。因此我们认为以减毒伤寒沙门菌为载体的滴鼻DNA疫苗兼具黏膜免疫及DNA疫苗的双重优点,是RSV等通过黏膜途径感染的病毒疫苗研究的重要方向,为今后RSV疫苗免疫策略等研究奠定了坚实基础。

关键词：婴幼儿呼吸道感染人呼吸道合胞病毒融合蛋白密码子优化黏膜免疫减毒鼠伤寒沙门氏菌

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携带ePNP/MePdR自杀基因系统的减毒沙门氏菌菌株构建及初步鉴定

携带ePNP/MePdR自杀基因系统的减毒沙门氏菌菌株构建及初步鉴定

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作者：李园园广州医科大学

学位级别：硕士

研究背景:随着全球进入老龄化社会,肿瘤持续升高的发病率以及死亡率,不仅迫使各个国家投入大量的人力及财力,而且严重降低人们的生存质量。迄今为止,各类基因疗法、免疫疗法以及分子靶向药联合传统的手术、放疗或化疗,虽然极大延长了患... 详细信息

研究背景:随着全球进入老龄化社会,肿瘤持续升高的发病率以及死亡率,不仅迫使各个国家投入大量的人力及财力,而且严重降低人们的生存质量。迄今为止,各类基因疗法、免疫疗法以及分子靶向药联合传统的手术、放疗或化疗,虽然极大延长了患者的生存期,但仍不能明显降低实体瘤患者的死亡率,全球肿瘤的发病率依然呈现急速上升的趋势。细菌凭借其特有的肿瘤靶向能力、细胞的侵袭能力、肿瘤组织的渗透能力再加上近几年合成生物学的兴起使细菌疗法成为肿瘤治疗领域一颗冉冉升起的新星。在细菌抗肿瘤领域,细菌减毒及功能改造是科学家们关注的重点,研究者们通过各种途径敲除细菌的毒性基因,并进行功能改造,希望能够构建出具有高度肿瘤靶向能力且安全性良好的菌株,利用菌株靶向肿瘤的能力以及自身的免疫原性杀灭肿瘤,但却发现实际与理论存在巨大的差异,因为在细菌毒性和疗效之间很难找到一个平衡点。随后科学家转而借用基因工程技术改造细菌,将其打造成可携带各种物质的微型“机器人”,利用细菌的肿瘤靶向能力将外源性物质带到肿瘤局部发挥作用。沙门氏菌能通过自身独特的分泌方式可将含有外部基因的重组质粒转运至真核细胞内并表达,因此沙门氏菌可作为细菌治疗的良好载体;基因定向酶前体药物治疗(GDEPT)是一种前体药物传递治疗系统,它主要由三个部分构成:一个携带外源基因的载体,一个非活性药物(前药物)以及一个可编码将无活性前体药物转化为活性药物的酶的基因;在GDEPT治疗策略中,ePNP/MePdR前药系统因具有强大的抗肿瘤效应及旁观者效应而备受人们关注,其原理是ePNP可将无毒的MePdR转化为有毒的MeP,MeP可通过影响细胞DNA、RNA、蛋白质等物质的合成起到杀伤细胞的作用。研究目的:既往研究已表明以病毒、细菌为载体介导的ePNP/MePdR前药系统在黑色素瘤、胰腺癌、结肠癌等癌种模型中可表现出强大的抗肿瘤效应,但以沙门氏菌为载体进行膀胱癌的抗肿瘤研究目前国内外还未见报道。本研究首先构建出携带ePNP基因的质粒,探究其是否可在沙门氏菌中稳定表达;其次通过体外试验验证携带有ePNP/MePdR前药系统的沙门氏菌具有杀伤小鼠膀胱肿瘤细胞的效果,希望能为进一步研究ePNP/MePdR前药系统以及沙门氏菌抗肿瘤治疗作铺垫。研究方法:本实验首先通过GenBank中提供的ePNP的核苷酸序列设计出引物,从大肠杆菌DH5α中克隆出目的基因,构建出携带有目的基因的真核表达质粒;将携带有ePNP基因的重组质粒电转到沙门氏菌中,该菌为实验室前期构建的严格厌氧的减毒鼠伤寒沙门氏菌,通过基因测序进行初步鉴定;最后通过细胞、细菌体外共培养实验验证携带ePNP目的基因的重组沙门氏菌对小鼠膀胱肿瘤细胞具有直接杀伤作用。结论:本实验成功构建出携带ePNP/MePdR自杀基因系统重组质粒的减毒沙门氏菌;体外实验表明携带ePNP/MePdR自杀基因系统的重组减毒沙门氏菌对小鼠膀胱肿瘤细胞具有良好的杀伤效应,为后续体内研究提供了实验基础。

关键词：减毒鼠伤寒沙门氏菌 ePNP/MePdR 抗肿瘤

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鸡传染性支气管炎病毒N和S1基因的克隆表达及运送N基因真核质粒减毒沙门氏菌在鸡体内的免疫原性

鸡传染性支气管炎病毒N和S1基因的克隆表达及运送N基因真核质粒减...

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作者：田华荣扬州大学

学位级别：硕士

鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）,为冠状病毒属一员,引起鸡的一种急性、高度接触性传染病。减毒苗常用于预防该病,但效果不理想且存在毒力返强的危险。为此,IB已成为养禽业最难控制的疫病之一。目前现有的IB... 详细信息

鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）,为冠状病毒属一员,引起鸡的一种急性、高度接触性传染病。减毒苗常用于预防该病,但效果不理想且存在毒力返强的危险。为此,IB已成为养禽业最难控制的疫病之一。目前现有的IB基因工程疫苗虽可诱导机体产生一定的免疫保护效应,但与传统免疫相比,还存在一定的差距。增强IBV DNA疫苗的免疫效果对于预防IB的发生已显得尤为重要。为此,本研究扩增出IBV N基因和S1基因,对其序列进行了分析。在此基础上分别构建了N基因的原核表达质粒及真核表达质粒。诱导后重组菌的菌体蛋白与IBV阳性血清反应后,具有一定的抗原性。同时用减毒沙门氏菌作为运送真核表达质粒的载体,以商品鸡为动物模型,探讨其免疫特性。 1.鸡传染性支气管炎病毒N基因和S1基因的克隆、序列分析及原核表达提取IBV C9001分离株RNA作为模板,根据GenBank登陆的相应S1基因和N基因序列设计特异性引物,其中,用于扩增S1基因的下游引物人为加入终止密码子。RT-PCR扩增后得到全长的N基因和S1基因。序列测定结果显示,所克隆的IBV C9001株N基因ORF全长为1230 bp,编码409个氨基酸;同源性比较结果表明,其与GenBank中有代表性的参考毒株N基因核苷酸和氨基酸序列有较高的同源性,在85.5%～99.8%之间。其中与Guangdong株、H52株、saib14株和saib wj株氨基酸序列同源性高达99.3%99.8%,尤其以H52株同源性最高。所克隆的S1基因ORF全长1659 bp,编码552个氨基酸;同源性比较结果表明:与GenBank中有代表性的参考毒株S1基因核苷酸和氨基酸序列有较高的同源性,在71.5%～99.3%之间。纯化的PCR产物和pBV220质粒分别用EcoR I和SalⅠ酶切并回收。然后,将回收后的载体片段（pBV220）和目的片段（N）连接,构建重组原核表达质粒,限制性内切酶EcoR I、SalⅠ筛选和酶切分析阳性克隆。将pBV220-N重组大肠杆菌通过温度敏感诱导4h,其菌体裂解物经SDS-PAGE可检测到一条大小为46 kD左右的特异蛋白条带而含空质粒pBV220的大肠杆菌经诱导后未见目的蛋白表达。用IBV阳性血清对重组菌诱导后的全菌体蛋白进行Western-blotting检测,结果表明,诱导后重组菌的菌体蛋白与IBV阳性血清反应后,具有一定的抗原性。 2.运送IBV N基因真核表达质粒的减毒沙门氏菌的构建及其在鸡体内诱导的免疫应答用限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ将N基因从相应的重组质粒中切出,重组到真核表达载体pVAX1相应的酶切位点中,获得重组质粒pVAX1-N。以脂质体转染技术将重组质粒转染COS-7细胞,通过间接免疫荧光法进行表达产物检测,结果表明转染重组质粒的COS-7细胞有绿色荧光。这表明构建的重组真核表达质粒可在体外表达N蛋白抗原。通过电转化法将重组质粒pVAX1-N转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207中,经PCR和沙门氏菌特异性血清凝集试验鉴定,获得重组菌SL7207（pVAX1-N）。将重组菌SL7207（pVAX1-N）分别以1×109 CFU、5×109 CFU、1×1010 CFU口服接种4日龄商品代伊莎褐蛋鸡,2周内所有试验鸡均无任何不良反应,试验结果初步表明重组菌SL7207（pVAX1-N）具有良好的安全性。首免35天,各试验组鸡体重在0.396 Kg-0.417 Kg之间,重组菌免疫组、灭活苗免疫组、H120免疫组与空白对照组之间没有显著性差异（P>0.05）。这说明重组菌免疫在一定程度上不影响鸡的生长。以5×109CFU剂量的重组菌SL7207（pVAX1-N）口服和滴鼻免疫4日龄商品鸡,免疫两次,间隔两周。在二免三周,用酶联免疫吸附试验（ELISA）分析重组菌免疫在鸡体内诱导免疫应答的情况。结果表明重组沙门氏菌具有良好的免疫原性,能分别诱导机体产生体液免疫应答和黏膜免疫应答。抗体测定结果表明,SL7207（pVAX1-N）免疫组血清抗体水平增加,与空白对照组、空载体对照组存在一定的差异,但不显著（P>0.05）。小肠黏膜抗体测定结果表明,SL7207（pVAX1-N）免疫组、H120免疫组均可以检测到针对N蛋白的特异性黏膜抗体。高于空载体对照组、空白对照组,但不存在显著性差异（P>0.05）。但部分个体的血清抗体和黏膜抗体水平与空载体对照组、空白对照组存在显著性差异（P<0.05）。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒 S1基因 N基因原核表达真核表达减毒鼠伤寒沙门氏菌免疫特性

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以减毒沙门氏菌为载体传递猪繁殖与呼吸综合征病毒DNA疫苗的口服免疫应答

以减毒沙门氏菌为载体传递猪繁殖与呼吸综合征病毒DNA疫苗的口服...

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作者：蒋文明南京农业大学

学位级别：硕士

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是目前危害养猪业最严重的传染病之一。该病的病原PRRSV属于尼多病毒目、动脉炎病毒科，为有囊膜的不分节段、单股、正链RNA病毒。GP5、GP3、M蛋白是PRRSV的... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是目前危害养猪业最严重的传染病之一。该病的病原PRRSV属于尼多病毒目、动脉炎病毒科，为有囊膜的不分节段、单股、正链RNA病毒。GP5、GP3、M蛋白是PRRSV的主要保护性抗原，以GP5基因为免疫原研制的DNA疫苗能诱导一定程度的免疫应答，但注射免疫途径因实际操作和成本问题难以推广应用。细胞内感染性细菌减毒后作为DNA疫苗载体是目前基因免疫研究的热点之一。鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)是一种较为常见的侵袭性胞内菌，通过基因工程方法减毒后对宿主致病性显著降低，但仍保留良好的侵袭力，可直接将真核表达质粒携带进入动物细胞内表达相应的蛋白而诱导特异性的免疫应答反应。但目前国内还未见减毒沙门氏菌作载体用于畜类DNA疫苗的报道。本研究探讨了利用沙门氏菌aroA基因突变株为载体传递PRRSV DNA疫苗的可行性。本研究应用PCR技术，以构建好的PRRSV S1毒株GP5全基因重组质粒pcDNA3-GP5为模板，扩增了部分信号肽序列缺失的GP5基因(GP5’基因)，并将其克隆入pcDNA3.1的CMV启动子下游，构建成真核表达质粒pcDNA3-GP5’。序列测定结果表明克隆的GP5’基因全长525bp，编码175个氨基酸。序列分析和二级结构预测表明，GP5蛋白含有多个疏水区域，2～4个潜在的糖基化位点和一段疏水信号肽。核苷酸序列同源性比较发现，S1株与其它分离株的GP5’同源性在99％。利用脂质体转染试剂将重组质粒pcDNA3-GP5和pcDNA3-GP5’转染HEK-293A细胞，用RT-PCR技术证明目的基因mRNA的转录，同时用IFA方法证明目的蛋白能够在真核细胞中表达。将真核表达质粒pEGFP、pcDNA3-GP5和pcDNA3-GP5’高压电转化至aroA突变的减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207株构建成3个重组沙门氏菌SL7207／pEGFP、SL7207／pcDNA3-GP5和SL7207／pcDNA3-GP5’。制备小鼠腹腔巨噬细胞，感染SL7207／pEGFP，经荧光显微镜可以检测到有荧光蛋白表达。将SL7207／pcDNA3-GP5和SL7207／pcDNA3-GP5’口服免疫小鼠，2d后提取肠道粘膜总RNA，可以检测到目的基因的转录和表达；同时制备免疫小鼠的腹腔巨噬细胞，用FITC标记的羊抗鼠IgG进行间接免疫荧光试验可以检测到特异性的黄绿色荧光。结果表明该减毒沙门氏菌不仅可将目的基因呈递给小鼠体细胞，而且，转运的目的基因可以获得转录和表达。以减毒沙门氏菌传递猪萦殖与呼吸综合征病毒DN人疫苗的口服免疫应答本试脸比较了减毒沙门氏菌为载体传递PR]拐V DNA疚苗和裸质粒DNA疚苗的免疚效果以及GPS基因和GP5’基因的免疫效果.6至8周龄的雌性小鼠随机分成7 组，每组16只.sL72o7lpeDNA3一GPS和sL7207lpeDNA3一GPS’以1。、fo的剂童口服免疫，裸质粒peDNA3一GPS和peDNA3一GPS，以10。陀皮内注射，共免疚4次，每次间隔巧天.结果表明，两种疫苗都诱导小鼠产生PRRSV中和杭体，最后一次免疫后14天口服组和注射组的中和杭体水平差异不显著.但SL72071 peDN六J一GPS和 SL72071体DNA3心P5’免疫组至二免后14天才出现中和杭体.同时发现GPS基因免疫组的中和杭体水平要明显高于GP5’基因免疫组.口服免疫和裸质拉DNA免疚均诱导了小鼠IFN一丫的表达，而且对照组也表达了IFN一丫.结果表明，口服免疚可以诱导机体产生针对PRRSV的体液免疫应答，但是没有特异性的IFN一丫应答;PR]招V GPS蛋白中的信号肤序列和N末端的糖基化位点与PRRSV GPS蛋白的中和表位有关。总之，本研究结果表明，以减毒沙门氏菌为载体传递PRRSV GPS基因的口服DNA 疫苗能诱导小鼠产生杭PRRSV的体液和细胞免疚应答.口服DNA疚苗具有省时、方便、价康、易于群体免疚等优点，有望代替肌肉注射或基因枪等DNA疚苗的免疫方式，是研制低成本、实用化口服畜类DNA疫苗的一条新途径.如何提高P川妞VDNA

关键词： PRRSV GP5 减毒鼠伤寒沙门氏菌 DNA疫苗口服DNA免疚基因免疫

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