检索结果-内蒙古大学图书馆

华东地区第13届实验动物科学学术交流会

作者：陈仁金胡安康王珍珍袁红花张腾业吴连连朱裕华朱孝荣徐州医学院实验动物中心江苏徐州221004 徐州医学院神经生物学研究中心江苏徐州221004

本文为了构建牛皮蝇的皮蝇A(hyderminA,HA)基因的分泌型真核表达载体pEF1 α-HA-AcGFP,并在Cos7细胞中表达与鉴定,试验从牛皮蝇中提取RNA,反转录成cDNA,扩增出HA基因,并在HA序列的上游加一段信号肽序列.通过双酶切将带有信号肽的HA基因... 详细信息

本文为了构建牛皮蝇的皮蝇A(hyderminA,HA)基因的分泌型真核表达载体pEF1 α-HA-AcGFP,并在Cos7细胞中表达与鉴定,试验从牛皮蝇中提取RNA,反转录成cDNA,扩增出HA基因,并在HA序列的上游加一段信号肽序列.通过双酶切将带有信号肽的HA基因序列克隆到真核表达载体pEF1 α-IRES-AcGFP,得到重组真核表达载体pEF1 α-HA-AcGFP.利用脂质体法转染Cos7细胞,分别用RT-PCR和Western blot方法在RNA和蛋白水平上检测HA基因在Cos7细胞中的表达.结果表明:经双酶切及测序鉴定,分泌型真核表达载体pEF1α-HA-AcGFP构建成功,转染Cos7细胞后,在RNA和蛋白水平上检测到HA基因的表达.说明成功构建了HA基因的分泌型真核表达载体.

关键词：皮蝇A基因克隆表达分泌型真核表达载体 Cos7细胞

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1型人类免疫缺陷病毒tat基因重组分泌型真核表达载体的构建

引用

微创医学 2012年第4期7卷 347-350页

作者：赵丽娟陈源红唐华英韦红玉曾怡右江民族医学院微生物学与免疫学教研室广西百色市533000

目的构建人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)tat基因分泌型真核表达载体。方法聚合酶链反应(PCR)法从缺失pol基因的重组HIV-1基因组pNL4-3中扩增tat基因;将PCR获得的tat基因片段和pSecTag2B分泌型真核表达载体分别用Hind III酶切;pSecTag2B载... 详细信息

目的构建人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)tat基因分泌型真核表达载体。方法聚合酶链反应(PCR)法从缺失pol基因的重组HIV-1基因组pNL4-3中扩增tat基因;将PCR获得的tat基因片段和pSecTag2B分泌型真核表达载体分别用Hind III酶切;pSecTag2B载体片段经小牛碱性磷酸酶去磷酸化后,用T4 DNA连接酶将tat基因与pSecTag2B载体片段连接过夜并转化感受态大肠杆菌DH5α,提取阳性克隆质粒进行Hind III酶切鉴定,并利用Nco I酶切鉴定克隆的tat基因反向。最后选取正向tat基因克隆质粒送基因测序。结果 PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上约320bp位置出现条带,与预期的324bp大小一致;经Hind III和Nco I分别酶切鉴定,获得2个正向克隆;正向克隆经测序,克隆的tat基因序列与Genbank中登记的HIV-1 tat基因100%同源。结论本研究方法可以成功地构建HIV-1 tat基因分泌型真核表达载体。

关键词：人类免疫缺陷病毒1型 tat基因分泌型真核表达载体

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重组分泌型人类免疫缺陷病毒Tat蛋白在真核细胞中的表达及活性检测

引用

检验医学与临床 2014年第11期11卷 1455-1457,1461页

作者：韦红玉曾怡唐华英赵丽娟右江民族医学院微生物学与免疫学教研室广西百色533000

目的构建人类免疫缺陷病毒病毒tat基因的重组分泌型真核表达载体并在真核细胞中表达,检测表达的重组蛋白活性。方法聚合酶链反应(PCR)从重组质粒pcDNA3.1(+)/Tat中扩增tat基因,利用HindⅢ和BamHⅠ酶切位点分别将tat基因正向、反向插入... 详细信息

目的构建人类免疫缺陷病毒病毒tat基因的重组分泌型真核表达载体并在真核细胞中表达,检测表达的重组蛋白活性。方法聚合酶链反应(PCR)从重组质粒pcDNA3.1(+)/Tat中扩增tat基因,利用HindⅢ和BamHⅠ酶切位点分别将tat基因正向、反向插入分泌型载体pSecTag,获得正向插入克隆(pSecTat)和反向插入克隆(pSecTat-AS),经双酶切鉴定连接成功后,利用测序鉴定其序列和插入方向。将构建的重组质粒转染293细胞,利用Western blot法检测Tat蛋白的表达。进而将重组质粒与LTR-CAT报告质粒共转染293细胞和BCBL-1细胞,CAT-酶联免疫吸附试验(ELISA)检测其细胞内CAT表达,从而检测Tat蛋白的活性。最后将转染重组质粒的293细胞与转染LTR-CAT报告质粒的BCBL-1细胞用Transwell培养系统共培养,CAT-ELISA检测分泌型Tat蛋白的旁分泌调控活性。结果 PCR扩增产物在10g/L琼脂糖凝胶上约300bp位置出现条带,与预期的324bp大小相符;经HindⅢ和BamHⅠ分别酶切鉴定,获得2个正向克隆;正向克隆经测序,克隆的tat基因序列与GenBank中登记的HIV-1tat基因100%同源。正向克隆质粒转染293细胞后,Western blot法检测观察到约19×103蛋白条带。正向克隆质粒与LTR-CAT报告质粒共转染293细胞和BCBL-1细胞CAT表达量高于反向克隆质粒转染细胞(P<0.05)。与反向克隆对照相比,与正向克隆转染的293细胞共培养的BCBL-1细胞CAT表达量更高(P<0.05)。结论成功构建HIV-1tat基因基因分泌型真核表达载体,该载体不但可在真核细胞内表达具有调控活性的Tat蛋白,表达的Tat蛋白还可分泌至细胞外并具有调控活性。

关键词：人类免疫缺陷病毒病毒 tat基因分泌型真核表达载体调控活性

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猪瘟病毒囊膜蛋白E2基因真核分泌型表达载体的构建及其表达

引用

西北农林科技大学学报（自然科学版） 2009年第5期37卷 7-11页

作者：徐彦召张彦明何雷唐青海代晨王静杨小云西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100

【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pS... 详细信息

【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pSecTag-E2qc和pSecTag-E2sh表达载体,分别进行PCR、双酶切及测序鉴定。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染猪脐静脉血管内皮细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测目的基因的转录情况,同时对转染细胞及细胞上清液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,以检测目的蛋白的表达情况。【结果】成功克隆了E2蛋白基因全长序列1119bp和去除E2蛋白跨膜基因序列999bp的目的基因。构建的表达载体经PCR、双酶切法及测序鉴定均无误。转染后细胞的RT-PCR结果显示,目的基因被成功转录。转染后细胞及细胞上清液的SDS-PAGE和Western-blot结果显示,目的基因被成功表达。【结论】成功构建了猪瘟病毒E2蛋白的真核表达载体,转染猪脐静脉血管内皮细胞后,分泌表达了猪瘟病毒E2重组蛋白。

关键词：猪瘟病毒囊膜蛋白猪脐静脉血管内皮细胞分泌型真核表达载体真核表达

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