检索结果-内蒙古大学图书馆

中国生物工程杂志 2007年第1期27卷 52-58页

作者：张超刘刚余少文邢苗深圳大学生命科学学院深圳市微生物基因工程重点实验室深圳518060

从毕赤酵母表达载体pPICZαA出发,构建了可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体(毕赤酵母表达型T载体),并通过表达重组纤维二糖水解酶II对该载体进行了检验。设计合适的引物扩增一DNA片段,使该片段的上游含XhoI和Eam1105I酶切位点... 详细信息

从毕赤酵母表达载体pPICZαA出发,构建了可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体(毕赤酵母表达型T载体),并通过表达重组纤维二糖水解酶II对该载体进行了检验。设计合适的引物扩增一DNA片段,使该片段的上游含XhoI和Eam1105I酶切位点,下游含Eam1105Ⅰ和XbaI酶切位点。通过XhoI和XbaI位点将扩增产物与质粒pPICZαA连接形成重组质粒。用Eam1105I酶切重组质粒,回收大片段即得到毕赤酵母表达型T载体pPICZαT。使用该表达型T载体进行了里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因(cbh2)的克隆和在巴氏毕赤酵母中的表达。结果表明,使用表达型T载体可以直接克隆PCR产物,而且可以使外源基因在毕赤酵母中成功表达。另一方面,使用该载体时不需要使用限制性内切酶,从而可以避免在所表达蛋白的N-末端引入多余氨基酸。

关键词：纤维二糖水解酶巴氏毕赤酵母分泌型表达载体里氏木霉 T-载体

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猪生长激素基因分泌型表达载体的构建及表达

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农业生物技术学报 1993年第1期 50-56页

作者：朱宝利黄涛贾锋周顺伍齐顺章北京 100094中国科学院发育生物学研究所北京农业大学动物生物化学教研室北京农业大学动物生物化学教研室北京 100094

为了使猪生长激素cDNA基因在大肠杆菌中的表达产物分泌到细胞周质中,本文采用了Kunkel报道的寡聚核苷酸指导的定点突变法,将猪生长激素cDNA基因与大肠杆菌外膜蛋白基因(ompA)的信号序列组装成嵌合基因,并在PL-PR双启动子的控制下进行诱... 详细信息

为了使猪生长激素cDNA基因在大肠杆菌中的表达产物分泌到细胞周质中,本文采用了Kunkel报道的寡聚核苷酸指导的定点突变法,将猪生长激素cDNA基因与大肠杆菌外膜蛋白基因(ompA)的信号序列组装成嵌合基因,并在PL-PR双启动子的控制下进行诱导表达。结果表明表达产物占细菌总蛋白的20％左右;经western blot法证实有少量游离的猪生长激素被分泌到细胞周质中。透射电镜观察结果证明表达产物的大部分是以包涵体的形式存在,N-末端氨基酸分析结果表明表达产物的信号肽已被切除,但尚未证实表达产物形成的包涵体是在细胞的周质中,还是在胞液中。

关键词：猪生长激素基因表达分泌型表达载体包涵体

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一种新型分泌型表达载体的构建及人表皮生长因子的表达

一种新型分泌型表达载体的构建及人表皮生长因子的表达

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作者：郝春芳厦门大学

学位级别：硕士

表皮生长因子(Epidermal Growth Factor)是由53个氨基酸组成的多肽。因其具有多种生物学活性和广泛的临床应用前景,对EGF及其受体家族的研究成为近年来生物学研究的热点之一。　　本研究目的在于构建一种新型的能够在藻细胞分泌表达外... 详细信息

表皮生长因子(Epidermal Growth Factor)是由53个氨基酸组成的多肽。因其具有多种生物学活性和广泛的临床应用前景,对EGF及其受体家族的研究成为近年来生物学研究的热点之一。　　本研究目的在于构建一种新型的能够在藻细胞分泌表达外源基因的分泌型表达载体,并实现表皮生长因子的分泌型表达。本实验主要采用集胞藻6803(Synechocytis ***6803)的某些分泌性蛋白的分泌信号肽序列片段插入pET-His载体多克隆位点上游作为分泌信号肽,实现人表皮生长因子在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中的分泌型表达,同时得到一种可以用于在藻类分泌型表达hEGF的新型表达载体。　　首先,优化设计目的人表皮生长因子的基因序列。依照螺旋藻密码子的偏嗜性设计了hegf基因序列合成了密码子优化的hegf基因,并将其插入表达载体pET-His中构建了pET-His-EGF质粒,在表达菌株*** BL21(DE3)plysS中表达目的蛋白,SDS-PAGE检测结果表明表达菌株中主要以包涵体形式存在,表达量约为14％。转化菌株培养后进行超声破碎,沉淀经过包涵体洗涤液洗涤后,通过割胶回收的方法纯化目的蛋白,免疫得到兔抗hEGF多克隆抗体,抗体效价约为1:50000。纯化后的多克隆抗体用于后续实验中分泌型表达的检测。　　其次,构建分泌型表达载体。通过Cyanobase藻类学数据库的查询,从集胞藻6803转译后加工过程中的某些蛋白的分泌信号序列得到可以用于分泌型表达的信号序列,进一步通过SignalP3.0 Server分析软件预验证,从集胞藻6803得到可行性序列分别命名为A(sll0172)、B(slr2101)、C(sll1483)、D(sll0427),它们分别是不同蛋白的信号序列,将这些信号序列插入pET-His-EGF表达载体hegf基因上游,得到了带有分泌型信号的pS-X系列表达载体。其中hEGF在pS-A载体中实现分泌型表达,在其它三个载体中未见表达。A序列为一种周质蛋白的信号序列,结构分类为膜蛋白。　　本研究主要对pS-A表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中的各部分:从培养基,周质,胞质和沉淀部分,分别通过SDS-PAGE,Western印迹分析验证了hEGF的表达结果,其中目的蛋白有分泌到细胞外,但是主要分泌到细胞周质中,我们通过两种方法处理使周质蛋白释放到目的液中,验证分析后得到,分泌到周质空间的相对表达量约为1％,在细胞质和沉淀中也有hEGF的表达。该新型分泌型表达载体是利用蓝藻信号序列作为分泌表达的信号肽,能在大肠杆菌中分泌表达,说明是一种广谱的原核型分泌表达载体,为人表皮生长因子在螺旋藻中表达奠定基础。　　此外,本研究将hEGF插入大肠杆菌的分泌型表达载体plpp-OmpA构建了plpp-OmpA-EGF表达载体,将该表达载体在*** BL21(DE3)plysS和TOPlOF'中诱导表达,均未见目的蛋白表达。说明我们的表达载体pS-A在原核生物分泌表达hEGF时具有一定的优越性。　　本研究的特色在于将蓝藻的中的分泌型蛋白的分泌信号片段作为信号肽导入***载体中进行人表皮生长因子的分泌型表达,为蛋白在包括蓝藻在内的原核生物中进行分泌型表达建立了良好的载体模式,具有广泛的应用前景。

关键词：表皮生长因子信号序列分泌型表达载体

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应用PCR重组技术构建大肠杆菌分泌型表达载体

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生物化学杂志 1995年第6期11卷 642-645页

作者：黄仪秀陈杰鹏毕群李斯明张磊朱圣庚北京大学生命科学学院生物化学与分子生物学系广东省汕头市滨制药厂

应用ＰＣＲ重组技术，对大肠杆菌分泌型表达载体ｐＩＮ－ⅢｏｍｐＡ进行改建，除去原载体的ＨｉｎｄⅢ位点，将信号肽序列末端两个密码子ＣＡＧＧＣＣ改为ＣＡＡＧＣＴ，从而引入一个新的ＨｉｎｄⅢ位点，并在其下游接上一段多克隆位点... 详细信息

应用ＰＣＲ重组技术，对大肠杆菌分泌型表达载体ｐＩＮ－ⅢｏｍｐＡ进行改建，除去原载体的ＨｉｎｄⅢ位点，将信号肽序列末端两个密码子ＣＡＧＧＣＣ改为ＣＡＡＧＣＴ，从而引入一个新的ＨｉｎｄⅢ位点，并在其下游接上一段多克隆位点序列。改建后的载体可用于直接插入外源ＤＮＡ编码序列，表达产物在分泌过程中被切除信号肽而成为天然有活性的蛋白质，操作十分简便。

关键词：大肠杆菌分泌型表达载体聚合酶链反应

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莱茵衣藻分泌型表达载体及分泌型表达系统的构建方法

莱茵衣藻分泌型表达载体及分泌型表达系统的构建方法

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作者：胡章立吴锦霞陈俊 518060 广东省深圳市南山区南海大道3688号

本发明公开了莱茵衣藻分泌型表达载体及分泌型表达系统的构建方法，本发明利用来源于莱茵衣藻分泌型蛋白的氨基酸序列，通过信号肽预测软件预测其信号肽基因序列，对预测获得的信号肽基因进行人工合成，并将其插入到莱茵衣藻表达载体的... 详细信息

标准号: CN102181471A

本发明公开了莱茵衣藻分泌型表达载体及分泌型表达系统的构建方法，本发明利用来源于莱茵衣藻分泌型蛋白的氨基酸序列，通过信号肽预测软件预测其信号肽基因序列，对预测获得的信号肽基因进行人工合成，并将其插入到莱茵衣藻表达载体的启动子和克隆位点之间，构建了莱茵衣藻分泌型表达载体。同时，利用外源基因检测构建的莱茵衣藻分泌型表达载体的表达效率，将含有外源基因的莱茵衣藻分泌型表达载体，通过莱茵衣藻遗传转化法，转化到莱茵衣藻，经过筛选，获得能分泌表达外源基因的转基因工程藻株。本发明为利用莱茵衣藻作为生物反应器分泌表达外源基因奠定了基础。

关键词：莱茵衣藻分泌型表达载体外源基因分泌表达信号肽基因序列氨基酸序列分泌型表达分泌型蛋白生物反应器信号肽基因信号肽预测转基因工程表达载体软件预测遗传转化启动子藻株克隆筛选检测转化

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hsBLyS分泌型表达载体构建及CHO表达

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南京师大学报（自然科学版） 2004年第2期27卷 81-86页

作者：吴海涛胡云龙刁振宇金丽娜李洁张双全南京师范大学生命科学学院

本实验引物延伸合成人红细胞生成素信号肽序列 ;信号肽序列和人可溶性B淋巴细胞刺激因子 (hu mansolubleBLymphocyteStimulator,hsBLyS)基因重叠延伸拼接成融合基因 ;融合基因插入pcDNA3、pcDNA3 1、pEFneo质粒 ;信号肽引物设计时 ,突... 详细信息

本实验引物延伸合成人红细胞生成素信号肽序列 ;信号肽序列和人可溶性B淋巴细胞刺激因子 (hu mansolubleBLymphocyteStimulator,hsBLyS)基因重叠延伸拼接成融合基因 ;融合基因插入pcDNA3、pcDNA3 1、pEFneo质粒 ;信号肽引物设计时 ,突变同义密码 ,最终重组质粒成为分泌表达质粒 ;磷酸钙共沉淀将表达质粒和标志质粒pSV dhfr,共转染CHO—dhfr- 细胞 ;选择培养液筛选 ,氨甲喋呤扩增表达 ,获稳定表达rhsBLyS细胞株 ;ELISA检测浓缩表达上清 ,结果表明 :rhsBLyS表达量由 0 13 μg/mL上升至 0 5 5 μg/mL .

关键词： hsBLyS CHO 基因表达信号肽分泌型表达载体免疫调节因子

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莱茵衣藻分泌型表达载体及分泌型表达系统的构建方法

莱茵衣藻分泌型表达载体及分泌型表达系统的构建方法

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作者：胡章立吴锦霞陈俊 518060 广东省深圳市南山区南海大道3688号

标准号: CN102181471B

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人干燥综合征抗原A毕赤酵母分泌型表达载体的构建

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实用医学杂志 2006年第22期22卷 2575-2577页

作者：杨湘越兰小鹏冯福英吴文冰钟智强廖剑朱忠勇南京军区福州总医院全军医学检验中心 350025

目的:构建表达人干燥综合征抗原A(SSA)的毕赤酵母分泌型表达载体。方法:以人白血病淋巴细胞HL-60株cDNA为模板,PCR扩增目的基因SSA,纯化,双酶切,DNA浓缩回收,插入酵母分泌型表达载体pPIC9k,热冲击法转化感受态大肠杆菌JM109,阳性克隆提... 详细信息

目的:构建表达人干燥综合征抗原A(SSA)的毕赤酵母分泌型表达载体。方法:以人白血病淋巴细胞HL-60株cDNA为模板,PCR扩增目的基因SSA,纯化,双酶切,DNA浓缩回收,插入酵母分泌型表达载体pPIC9k,热冲击法转化感受态大肠杆菌JM109,阳性克隆提取质粒,双酶切鉴定并测序。结果:PCR产物大小符合要求,重组质粒pPIC9k-SSA双酶切鉴定与预期一致,测序结果正确。结论:成功构建SSA毕赤酵母分泌型表达载体,为下一步取代从动物胸腺中人工提取低纯度、低产量的SSA抗原,研制新型抗SSA诊断试剂盒打下基础。

关键词：干燥综合征毕赤酵母分泌型表达载体

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人sCR1酵母分泌型表达载体构建及其高拷贝转化子的快速筛选

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实用医药杂志 2009年第11期26卷 61-63,66页

作者：王广兰宫璀璀刘亚利初霞王文丽李璇 153医院济南军区检验中心河南郑州450042

目的采用酵母分泌型载体表达人可溶性补体受体1型(sCR1),研究人sCR1高拷贝重组阳性转化子的快速筛选及鉴定。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1... 详细信息

目的采用酵母分泌型载体表达人可溶性补体受体1型(sCR1),研究人sCR1高拷贝重组阳性转化子的快速筛选及鉴定。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化。结果获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性。

关键词：可溶性1型补体受体1 毕赤酵母细胞 G418抗性筛选分泌型表达载体

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昆虫杆状病毒表达系统分泌型表达载体的构建和初步应用

昆虫杆状病毒表达系统分泌型表达载体的构建和初步应用

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中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议

作者：谢小燕程通管宝全张军夏宁邵厦门大学细胞生物学和肿瘤细胞工程教育部重点实验室厦门大学细胞生物学和肿瘤细胞工程教育部重点实验室厦门大学细胞生物学和肿瘤细胞工程教育部重点实验室厦门大学细胞生物学和肿瘤细胞工程教育部重点实验室厦门大学细胞生物学和肿瘤细胞工程教育部重点实验室

杆状病毒表达系统是目前普遍使用的真核表达系统之一,为改造其第五代产品——Bac-to-Bac系统,以简化表达产物的纯化步骤,对该系统的转移载体进行了改造,利用一种起源于昆虫的分泌肽蜂毒肽(melittin)建立新的融合表达转移载体.

关键词：分泌型表达载体昆虫杆状病毒表达系统真核表达系统初步应用

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