检索结果-内蒙古大学图书馆

波谱学杂志 2014年第1期31卷 100-107页

作者：罗凡陈宗运吴英亮蒋滨姜凌刘买利波谱与原子分子物理国家重点实验室武汉磁共振中心(中国科学院武汉物理与数学研究所) 湖北武汉430071 中国科学院大学北京100049 病毒学国家重点实验室武汉大学生命科学学院湖北武汉430072

LmKTT-1a是最近发现的一个蝎毒素,该多肽分子不仅具有钾离子通道调节剂的功能,还具有胰蛋白酶（Trypsin）抑制剂的活性,是第一个被发现的双功能蝎毒素.虽然前期工作已对LmKTT-1a的溶液结构和钾离子通道调节剂的功能进行了研究,但未阐明L... 详细信息

LmKTT-1a是最近发现的一个蝎毒素,该多肽分子不仅具有钾离子通道调节剂的功能,还具有胰蛋白酶（Trypsin）抑制剂的活性,是第一个被发现的双功能蝎毒素.虽然前期工作已对LmKTT-1a的溶液结构和钾离子通道调节剂的功能进行了研究,但未阐明LmKTT-1a和Trypsin的作用方式和位点.文中利用液体NMR的手段,采用化学位移扰动分析的方法,确定了LmKTT-1a的loop区域V10～F17等氨基酸位点可能参与了与Trypsin的相互作用.进一步采用定点突变的方法验证了NMR实验的结果,并确认了LmKTT-1a与Trypsin相互作用最关键的氨基酸位点是KI4.该研究结果有助于进一步理解LmKTT-1a具有双功能活性的结构基础.

关键词：核磁共振(NMR) 相互作用化学位移扰动分析蝎毒素 LmKTT-1a 胰蛋白酶

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去泛素化水解酶Usp28的结构与功能研究

去泛素化水解酶Usp28的结构与功能研究

引用

作者：崔榕南昌大学

学位级别：硕士

目的：Usp28（Ubiquitin-specific protease28，Usp28）是去泛素化水解酶家族中最新的抗肿瘤靶标分子，它通过控制癌蛋白MYC（Myelocytomatosis virusoncoprotein，MYC）和促癌蛋白LSD1（Lysine-specific demethylase1，LSD1）的细胞内稳定性而在癌症的发生和发展过程中发挥作用。而更为有趣的是，生物信息学分析表明Usp28的功能有极高概率受蛋白质翻译后修饰形式-SUMO化修饰与泛素化修饰的交叉调控。本论文基于核磁共振技术的相关研究工作，确定了这一交叉调控机制的存在，同时在分子水平阐明了其工作机制和结构基础，为癌症的靶向治疗奠定重要理论基础。方法：（1）使用Usp28(1-651)（含泛素/SUMO结合结构域UBA、UIM/SIM和催化结构域USP）和Usp28(121-651)（仅含催化结构域USP）蛋白质样品进行去泛素水解酶活性实验以确证泛素结合结构域对Usp28催化活性正常展示的必要性；（2）使用Ub-AMC荧光法检测SUMO1/SUMO2分子对Usp28(1-651)及其突变体水解底物（Ub-AMC）的能力，对所得的数据进行统计分析以明确SUMO1/SUMO2分子的非共价结合对Usp28酶活性的影响；（3）运用异核多维NMR技术测定Usp28(1-120)的溶液结构，并使用Usp28(1-120)、泛素、K48偶联的二泛素、SUMO1以及SUMO2进行[1H,15N] HSQC滴定实验以阐明Usp28底物识别和功能调控的分子机制；（4）以人基因组为模板，运用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增Usp28催化结构域片段，并进一步将PCR扩增产物克隆到pET-系列的表达载体中，构建Usp28催化结构域的重组表达质粒。结果：（1）N端泛素结合结构域的缺失会导致Usp28的去泛素水解活性明显降低；（2）SUMO1/SUMO2分子通过与Usp28N端UIM/SIM结构域发生非共价相互作用而抑制Usp28的去泛素水解功能；（3）Usp28(1-120)通过其UBA(ubiquitin-associated domain)结构域和UIM结构域(ubiquitin-interactingmotif)与泛素以及二泛素的β疏水界面发生相互作用；（4）Usp28(1-120)通过其SIM (SUMO interacting motif)结构域与类泛素蛋白SUMO1/SUMO2的疏水界面发生相互作用；（5）SUMO分子的非共价结合会屏蔽Usp28泛素结合结构域与泛素链之间的相互作用而使得Usp28的泛素链底物识别、结合能力受损；（6）基因测序和大肠杆菌表达结果证实：Usp28催化结构域的表达质粒已成功构建。结论：Usp28N端泛素结合结构域（UBDs，ubiquitin-binding domains）的泛素识别结合能力对Usp28的去泛素水解催化活性具有正调控作用。此外，Usp28的酶催化功能同时受到类泛素修饰分子SUMO和泛素分子的交叉调控。SUMO分子的非共价结合会屏蔽Usp28泛素结合结构域与泛素链之间的相互作用，从而使得Usp28的泛素链底物识别、结合能力受损，并进一步导致Usp28的酶活性降低。

关键词： Usp28 泛素/二泛素 SUMO1/SUMO2 NMR 化学位移扰动分析

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