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枸杞提取物及其成分叶黄素/玉米黄质在体内外对年龄相关性黄斑变性防治的影响

中国中西医结合杂志 2013年第4期33卷 531-537页

作者：黄冰林丁淑华杭丽郑仕中李伟徐新荣南京中医药大学研究生院南京210046 江西中医学院附属医院五官科南昌330006 南京中医药大学附属江苏省中医院眼科南京210029 南京中医药大学药学院临床药学教研室南京210023 南京中医药大学药学院药学系南京210022

目的研究枸杞提取物在体内对高脂饮食及氢醌诱发的年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)模型小鼠的半胱氨酸组织蛋白酶b(cathepsin b,Cat b)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cystatin C,Cys C)表达的抑制作用,并探讨叶黄... 详细信息

目的研究枸杞提取物在体内对高脂饮食及氢醌诱发的年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)模型小鼠的半胱氨酸组织蛋白酶b(cathepsin b,Cat b)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cystatin C,Cys C)表达的抑制作用,并探讨叶黄素和玉米黄质在体外对过氧化氢(H2O2)诱导的人视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞的基质金属蛋白激酶(MMP)2、金属蛋白激酶组织抑制因子(TIMP)2表达的影响。方法 8个月龄的雌性C57bL/6小鼠50只。10只正常饮食作为年龄对照组;40只高脂饮食6个月后,在饮水中加入氢醌(0.8%)继续3个月,随机分为模型对照组(10只)、高、中、低剂量治疗组(每组10只)分别以3.75、2.50、1.25g/(kg·d)枸杞浸膏灌胃,每日1次,持续3个月。观察期满处死动物,摘取眼球。免疫组化观察Cat b、Cys C的表达,RT-PCR、Western blot检测Cat b、Cys C mRNA及蛋白表达;细胞增殖活性的检测筛选H2O2、叶黄素和玉米黄质的药物浓度,Western blot检测细胞中MMP-2、TIMP-2蛋白表达。结果在体内模型对照组的Cat b、Cys C mRNA及蛋白的表达显著强于年龄对照组(P<0.05,P<0.01),而治疗各组Cat b、Cys C mRNA弱于模型对照组(P<0.01),中、高剂量组Cat b及各剂量组CysC蛋白表达弱于模型对照组(P<0.05,P<0.01)。在体外细胞中叶黄素和玉米黄质能够下调受H2O2诱导的ARPE-19细胞的MMP-2、TIMP-2的蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。结论枸杞提取物能下调高脂饮食及氢醌诱发的模型小鼠Cat b、Cys C的高表达,叶黄素和玉米黄质对H2O2诱导的ARPE-19细胞MMP-2、TIMP-2的蛋白表达有下调作用。

关键词：半胱氨酸组织蛋白酶b 半胱氨酸蛋白酶抑制剂C 枸杞提取物基质金属蛋白激酶2 金属蛋白激酶组织抑制因子2 叶黄素玉米黄质

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枸杞醇提物及其成分叶黄素/玉米黄质在体内外对年龄相关性黄斑变性防治的研究

枸杞醇提物及其成分叶黄素/玉米黄质在体内外对年龄相关性黄斑变...

引用

作者：黄冰林南京中医药大学

学位级别：博士

目的：体内实验,研究枸杞醇提物对高脂饮食及氢醌诱发的年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD)模型小鼠视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)下沉积物和bruch膜超微结构的影响,以及对模型小鼠的半胱... 详细信息

目的：体内实验,研究枸杞醇提物对高脂饮食及氢醌诱发的年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD)模型小鼠视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)下沉积物和bruch膜超微结构的影响,以及对模型小鼠的半胱氨酸组织蛋白酶b(cathepsin b, Cat b)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C (cystatin C, Cys C) mRNA的转录和蛋白表达的影响；体外实验,探讨枸杞子的主要成分叶黄素和玉米黄质对过氧化氢(H2O2)诱导的人视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞的基质金属蛋白激酶(matrix metalloproteinases, MMP)2和金属蛋白激酶组织抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMP)2蛋白表达的影响。方法：体内实验,选取8个月龄的雌性C57bL/6小鼠100只。按体重随机分5组,其中空白组、模型对照组、高剂量组、中剂量组、低剂量组,每组20只。空白组20只：正常饮食；余4组高脂饮食喂养6个月后,于饮水中加入氢醌(0.8%)继续饲养3个月；治疗组再予枸杞醇提物以灌胃法给药(高剂量组3.75g/kg/d、中剂量组2.50g/kg/d、低剂量组1.25g/kg/d),每日一次,继续持续3个月。观察期满处死动物,摘取眼球。电镜观察RPE下沉积物及bruch膜；免疫组化观察Cat b、Cys C的表达;Real time-PCR检测Cat b、Cys C mRNA的表达；Western blot检测Cat b、Cys C蛋白的表达。体外实验,选用ARPE-19细胞常规培养后,细胞增殖活性的方法检测筛选H202及叶黄素和玉米黄质的最佳药物浓度,Western blot方法检测细胞中MMP-2, TIMP-2蛋白酶体表达水平。结果：体内实验,RPE下沉积物形成：模型对照组RPE下沉积物的形成与空白组相比明显增多(P<0.01),治疗组中：高剂量组与模型对照组相比有极明显减轻(P<0.01),中剂量组、低剂量组则有明显减轻(P<0.05)。bruch膜厚度：模型对照组的bruch膜厚度明显比空白组增厚(P<0.01),治疗各组的厚度则明显小于模型对照组(P<0.01)。Cat b、Cys C mRNA的表达：两者在模型对照组的表达显著高于空白组(P<0.01),治疗各组Cat b、Cys C mRNA的表达与模型对照组相比明显降低(P<0.01)。Cat b、Cys C的蛋白表达：Cat b蛋白在模型对照组的表达明显高于空白组(P<0.05),治疗组与模型对照组相比：高、中剂量组有显著降低(P<0.05),低剂量组无明显差异(P>0.05)；Cys C的蛋白表达在空白组与模型对照组相比有显著降低(P<0.05),治疗各组与模型对照组比均显著降低(P<0.01)。体内实验,浓度为1、10、100μmol/L的H202溶液与空白组(不加H202溶液的空白对照组)相比无明显统计学差异(P>0.05),浓度为200μmol/L的H202溶液存在统计学差异(P<0.05),浓度为300、400、500μmol/L的H202溶液则存在极显著性差异(P<0.01)。叶黄素及玉米黄质对ARPE-19细胞活性的影响：当药物浓度在1、10μmol/L时,与模型对照组相比无明显差异(P>0.05),浓度为30、50、70μmol/L时存在显著性差异(P<0.05),浓度为100μmol/L时存在极显著性差异(P<0.01)。MMP-2的蛋白表达：模型对照组MMP-2的蛋白较空白组有明显的高表达(P<0.05),药物浓度为30、50μmol/L时,MMP-2的蛋白表达与模型对照组比有显著性差异(P<0.05),当浓度到达70μmol/L时有极显著性差异(P<0.01)。TIMP-2的蛋白表达：模型对照组TIMP-2的蛋白较空白组有明显的高表达(P<0.05)。治疗组中当药物浓度为30μmol/L时TIMP-2的蛋白表达与模型对照组比并无统计学差异(P>0.05),浓度为50μmol/L时有统计学差异(P<0.05),浓度为70μmol/L时差异有极显著性(P<0.01)。结论：枸杞醇提物能下调Cat b、Cys C mRNA和蛋白的高表达。抑制高脂饮食和氢醌引起的模型小鼠RPE下沉积物形成及bruch膜的增厚,机制可能与下调Cat b、Cys C的表达有关。枸杞子的主要成分叶黄素和玉米黄质对H202诱导的ARPE-19中的MMP-2、 TIMP-2蛋白酶体的高表达均有下调作用。

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