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解毒泄浊、化瘀通络方调控Akt/mTOR信号通路抑制单侧输尿管结扎大鼠细胞自噬的机制

中华中医药杂志 2024年第11期39卷 6042-6048页

作者：贾子申李天豪李振彤闫翠环河北中医药大学石家庄050200 河北省中西医结合肝肾病证研究重点实验室石家庄050091 河北中医药大学中西医结合研究所石家庄050091

目的:研究解毒泄浊、化瘀通络方通过调控Akt/mTOR信号通路抑制单侧输尿管结扎(UUO)大鼠梗阻性肾病(ON)细胞自噬的机制。方法:将60只SPF级雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、中药高剂量组(21.16 g·kg^(-1)·d^(-1))、中药中... 详细信息

目的:研究解毒泄浊、化瘀通络方通过调控Akt/mTOR信号通路抑制单侧输尿管结扎(UUO)大鼠梗阻性肾病(ON)细胞自噬的机制。方法:将60只SPF级雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、中药高剂量组(21.16 g·kg^(-1)·d^(-1))、中药中剂量组(10.58 g·kg^(-1)·d^(-1))、中药低剂量组(5.29 g·kg^(-1)·d^(-1))和西药组(20 mg·kg^(-1)·d^(-1)),每组10只。除假手术组外均采用UUO术制作大鼠ON模型,各治疗组术后1 d开始给予相应药物。给药14 d后,检测24 h尿蛋白定量(24 h UP)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN);HE、Masson观察大鼠肾脏病理结构改变,纤维化改变;免疫组织化学法(IHC)法检测自噬相关基因5(Atg5)、自噬相关基因Beclin1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达;Western blot检测大鼠肾脏蛋白激酶B(Akt)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、Atg5、Beclin1、LC3表达;PCR检测Atg5、Beclin1、LC3 mRNA的表达。结果:与模型组比较,各给药组24 h UP、Scr、BUN均显著下降(P<0.05);HE结果显示,模型组肾脏结构发生紊乱可见肾小管扩张,炎性细胞浸润,其余各给药组均有改善;Masson结果显示,各给药组较模型组肾间质有大量胶原沉积好转(P<0.05);IHC结果显示,与模型组比较,中药高剂量组、西药组Atg5、Beclin1、LC3表达显著下降(P<0.05),各给药组mTOR、p-mTOR蛋白表达增强(P<0.05),Beclin1、Atg-5、LC3蛋白和mRNA表达降低(P<0.05)。结论:解毒泄浊、化瘀通络方能够保护ON大鼠肾脏,其机制可能是通过调控Akt/mTOR信号通路,抑制自噬相关基因蛋白Atg5、Beclin1、LC3表达,抑制细胞自噬从而减轻肾脏损伤。

关键词：解毒泄浊、化瘀通络方梗阻性肾病自噬哺乳动物雷帕霉素靶蛋白单侧输尿管结扎术

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磷酸二酯酶5在肾脏纤维化中的保护作用

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中山大学学报（医学科学版） 2023年第6期44卷 931-942页

作者：翟庆娴李蒙隆罗莎梁柏恩王蔚东中山大学中山医学院高血压研究所广东广州510080

【目的】探究磷酸二酯酶5(PDE5)抑制剂西地那非(SIL)或LW1646对单侧输尿管结扎(UUO)诱导的肾间质纤维化的保护作用。【方法】C57BL/6雄性小鼠被随机分为假手术Sham(n=6)、7UUO(n=6)、7UUO+SIL(n=6)或7UUO+LW1646(n=6)组,术前1h给予SIL或LW1646、或溶剂灌胃给药,连续给药7 d后处死小鼠,收集梗阻侧肾脏标本。对肾组织进行H&E和Masson’s染色,使用免疫印迹和RT-qPCR检测肾脏中的纤维化、内质网应激、自噬、凋亡相关蛋白表达水平以及纤维化相关基因表达水平。使用人近端小管上皮细胞(HK-2)给予TGF-β148 h,检测cGMP对内质网应激和纤维化相关蛋白水平的影响。使用衣霉素孵育HK-2细胞24 h,检测PDE5抑制剂对内质网应激、纤维化相关蛋白、自噬和凋亡蛋白水平的影响。【结果】在行UUO术后7 d小鼠体质量相对于假手术组显著下降(P<0.0001),梗阻侧肾脏可见明显肾小管扩张、肾间质炎症细胞浸润,TGF-β1蛋白和mRNA水平、内质网应激、自噬及凋亡相关蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。而给予SIL或LW1646后小鼠梗阻侧肾脏管腔扩张、炎症细胞浸润被缓解。肾脏TGF-β1的蛋白及mRNA表达水平被不同程度下调,PDE5抑制剂显著下调内质网应激、自噬和凋亡水平。在HK2细胞中,TGF-β1诱导的Fibronectin蛋白以及BiP蛋白表达水平显著升高,在cGMP的作用下可被部分逆转;衣霉素诱导的Fibronectin、BiP蛋白水平上调可被SIL或LW1646逆转,同时自噬和凋亡的异常水平也被PDE5抑制剂改变。【结论】PDE5抑制剂可以通过改善肾脏组织细胞内质网应激、自噬水平,以及抗凋亡等途径和缓解纤维化进展,同剂量的LW1646在对缓解内质网应激降低细胞外基质蛋白的表达水平的效果优于SIL。

关键词：磷酸二酯酶5 肾脏纤维化单侧输尿管结扎术内质网应激小鼠

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中医学报 2019年第8期34卷 1665-1669页

作者：马巧亚李睿萍铁晓玲王竹孙万森西安交通大学第二附属医院陕西西安710004 西安市儿童医院陕西西安710004

目的:观察祛风通络方对单侧输尿管结扎术(unilateral urethral occlusion,UUO)大鼠肾间质纤维化相关蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、波形蛋白(vimentin)的影响。方法:50只雄性成年SD大鼠随机分为假手术组10只和... 详细信息

目的:观察祛风通络方对单侧输尿管结扎术(unilateral urethral occlusion,UUO)大鼠肾间质纤维化相关蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、波形蛋白(vimentin)的影响。方法:50只雄性成年SD大鼠随机分为假手术组10只和UUO组40只,其中UUO组根据干预方法不同随机平均分为模型组、阳性对照组、祛风通络方高剂量组、祛风通络方低剂量组。术后第1天开始灌胃相应药物,术后第21天将大鼠全部处死,取术侧肾脏组织,Masson染色观察肾间质纤维化程度,RT-PCR和Western blotting检测肾脏组织α-SMA、vimentin mRNA水平及蛋白表达。结果:①UUO后21 d,模型组及治疗各组大鼠梗阻侧肾体积较对侧增大,剖面肾实质不同程度萎缩,肾盂扩张呈囊状,模型组最为明显。②模型组大鼠近端肾小管上皮细胞萎缩,集合管和远曲小管管腔明显扩张,周围大量炎性细胞浸润伴间质胶原成分显著增加、纤维组织增生,肾小球有硬化或数目减少,各干预组上述病理情况均不同程度改善,其中祛风通络方高剂量组改善最为明显。③与假手术组比较,各组大鼠肾组织α-SMA、vimentin mRNA及蛋白表达均明显升高(P<0.05),以模型组升高最为显著(P<0.01);与模型组比较,各治疗组α-SMA、vimentin mRNA及蛋白表达均不同程度下降(P<0.05),以祛风通络方高剂量组下降最为显著(P<0.01),且祛风通络方高剂量组与祛风通络方低剂量组比较,差异亦有统计学意义(P<0.05)。结论:大剂量祛风通络方可显著改善肾纤维化病理、下调肾纤维化相关蛋白α-SMA、vimentin的表达。

关键词：祛风通络方单侧输尿管结扎术 α-平滑肌肌动蛋白波形蛋白大鼠

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侧腰部二次手术法建立小鼠慢性肾脏病基础上急性肾损伤模型

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中国医药 2018年第8期13卷 1188-1191页

作者：高绪霞韩丽媛马立萍王以新首都医科大学附属北京安贞医院全科医疗科 100029 首都医科大学附属北京安贞医院病理科 100029

目的通过侧腰部二次手术法建立小鼠慢性肾脏病基础上急性肾损伤(AKI)的动物模型,为进一步深入研究AKI病理生理机制、探索有效的防治方法构建研究工具。方法 8～12周龄的雄性C57BL/6小鼠3只作为正常对照,16只在麻醉状态下行左侧腰部单侧... 详细信息

目的通过侧腰部二次手术法建立小鼠慢性肾脏病基础上急性肾损伤(AKI)的动物模型,为进一步深入研究AKI病理生理机制、探索有效的防治方法构建研究工具。方法 8～12周龄的雄性C57BL/6小鼠3只作为正常对照,16只在麻醉状态下行左侧腰部单侧输尿管结扎术(UUO),48和96 h后各有8只再从双侧腰部行肾脏缺血40 min再灌注24 h手术,记为UUO 3 d+缺血再灌注(I/R)组和UUO5 d+I/R组。自动生化仪苦味酸法检测血清肌酐水平,左侧肾脏组织石蜡包埋,切成4μm厚切片,行苏木精-伊红及Masson染色观察,并进行急性小管损伤评分和纤维组织半定量分析。结果 UUO 3 d+I/R组、UUO 5 d+I/R组血清肌酐水平明显高于对照组[(197±47)、(186±26)μmol/L比(54±10)μmol/L],肾脏小管急性损伤评分明显高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。苏木精-伊红染色显示肾脏间质大量炎症细胞浸润、管腔扩张、充斥管型,刷状缘消失、小管上皮细胞空泡变性、坏死脱落等急性小管损伤,并存皮质变薄、小管萎缩、上皮细胞扁平、间质增宽等慢性病变。Masson染色可见UUO 3 d+I/R组、UUO5 d+I/R组小鼠肾脏间质纤维基质增多。结论小鼠侧腰部UUO后再行I/R二次手术法可建立慢性肾脏病基础上AKI的模型。

关键词：急性肾损伤慢性肾脏病单侧输尿管结扎术双侧.肾脏缺血再灌注手术动物模型

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川芎嗪对肾间质纤维化中TGF-β1/miR-29表达的影响

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临床与病理杂志 2017年第5期37卷 881-888页

作者：徐梅孙升云暨南大学医学院中医学院广州510632 暨南大学第一附属医院广州华侨医院中医科广州510632

目的:观察川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)对单侧输尿管结扎(unilateral ureteral obstruction,UUO)大鼠模型肾间质纤维化(renal interst it ial f i brosi s,R I F)、间质损伤及TGF-β1/miR-29表达的影响。方法:50只雄性Wistar大鼠随机分为5组:正常对照组(Ctrl组)、假手术组(Sham组)、模型组(UUO组)、缬沙坦组(VAN组)和TMP组各10只。经相应处理后,通过HE,Masson染色观察肾组织的病理学表现;同时采用SP免疫组织化学法检测各组病变组织中TGF-β1的表达情况;最后采用RT-PCR技术比较各组TGF-β1,miR-29基因的表达。结果:HE染色结果显示Ctrl组、Sham组、UUO组、VAN组及TMP组的肾间质损伤评分分别为0.27±0.10,0.30±0.12,8.79±1.03,6.23±0.81及4.57±0.74。Masson染色胶原半定量分析结果显示Ctrl组、Sham组、UUO组、VAN组及TMP组的评分分别为0.21±0.03,0.23±0.06,2.49±0.33,1.63±0.07及1.32±0.04。SP免疫组织化学染色显示模型组TGF-β1的蛋白表达高于对照组;而缬沙坦和TMP可部分逆转TGF-β1蛋白的表达,且TMP的效果优于缬沙坦。RT-PCR结果显示模型组的TGF-β1 mRNA表达增高、miR-29 mRNA表达降低。TMP组和缬沙坦组TGF-β1 mRNA表达明显低于模型组,而miR-29 mRNA表达则明显高于模型组;且TMP组TGF-β1 mRNA表达高于缬沙坦组。结论:缬沙坦和TMP可明显减轻UUO致RIF中肾组织学损伤,且TMP的疗效优于缬沙坦。此外TMP还可抑制TGF-β1而促进miR-29的表达。

关键词：单侧输尿管结扎术肾间质纤维化川芎嗪 TGF-β1 miR-29

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超声弹性对比指数在单侧输尿管结扎大鼠肾脏纤维化程度评估中的应用价值

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中华实用诊断与治疗杂志 2017年第11期31卷 1059-1061页

作者：黄洁丽王硕刘熹余莹王秀艳余晨同济大学附属同济医院上海市同济医院肾脏内科 200065 同济大学附属同济医院超声科上海200065

目的探讨超声弹性对比指数(elasticity contrast index,ECI)对单侧输尿管结扎模型大鼠肾脏纤维化程度的评估价值。方法 SD大鼠24只随机分为假手术组6只和模型组18只(术后3、7、14d各6只),模型组行右侧输尿管结扎术,假手术组仅分离输尿... 详细信息

目的探讨超声弹性对比指数(elasticity contrast index,ECI)对单侧输尿管结扎模型大鼠肾脏纤维化程度的评估价值。方法 SD大鼠24只随机分为假手术组6只和模型组18只(术后3、7、14d各6只),模型组行右侧输尿管结扎术,假手术组仅分离输尿管但不结扎。假手术组术后14d,模型组术后3、7、14d应用体积分数5%水合氯醛腹腔注射麻醉后,先行超声检查测量ECI,再处死大鼠取右肾组织行Masson染色及肾脏纤维化程度评分。结果模型组术后14d时ECI(1.20±0.18)高于假手术组(0.59±0.09)(P<0.05),术后3、7d时ECI(0.62±0.10、0.68±0.12)与假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05);模型组术后3、7、14d时肾脏纤维化程度评分(2.56±0.73、4.35±0.84、6.93±0.72)均高于假手术组(0)(P<0.05),且模型组术后3、7、14d时肾脏纤维化程度评分比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 ECI可反映大鼠肾脏纤维化的程度,可作为评估肾脏纤维化的半定量指标。

关键词：肾脏纤维化超声弹性对比指数单侧输尿管结扎术大鼠

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慢性肾脏病基础上急性肾损伤小鼠模型的建立

慢性肾脏病基础上急性肾损伤小鼠模型的建立

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第十四次全国动脉硬化性疾病学术会议暨第五次中-加动脉粥样硬化及心血管疾病国际研讨会

作者：高绪霞韩丽媛马立萍王以新首都医科大学附属北京安贞医院全科医疗科北京100029 首都医科大学附属北京安贞医院病理科北京100029

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芪黄保肾方对肾衰竭幼鼠PAX2表达的影响

芪黄保肾方对肾衰竭幼鼠PAX2表达的影响

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作者：吕孝冬黑龙江省中医药科学院

学位级别：硕士

目的:观察芪黄保肾方对肾衰竭幼鼠肾脏组织配对盒基因2(Paired box2,PAX2)的表达的影响,探讨芪黄保肾方保护肾功能,延缓儿童肾衰竭的作用机制。对象:65只体重范围在80至120g的四周龄SD幼鼠,购置于哈尔滨医科大学附属二院动物实验中心。... 详细信息

目的:观察芪黄保肾方对肾衰竭幼鼠肾脏组织配对盒基因2(Paired box2,PAX2)的表达的影响,探讨芪黄保肾方保护肾功能,延缓儿童肾衰竭的作用机制。对象:65只体重范围在80至120g的四周龄SD幼鼠,购置于哈尔滨医科大学附属二院动物实验中心。实验期间,所有幼鼠均在黑龙江中医药大学动物实验中心饲养。室温维持在22-24℃,相对湿度保持在(50-70)%,人工12h昼/夜循环照明。保持通风、安静,定期更换垫料,消毒实验动物笼具。动物自由饮水,普通饮食。所有食物及饮用水都由黑龙江中医药大学动物实验中心提供,所有食物都经过了严格的消毒。方法:按照随机分组法将这65只幼鼠随机分在5组:假手术组、模型组、虫草组、芪黄保肾方组(简称芪黄组)、芪黄保肾方+虫草组(即联合组)。每组单独饲养,采用单侧输尿管结扎术制作肾衰竭幼鼠模型,10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,在左侧耻骨上切口,钝性剥离左肾下极寻到左输尿管,用4-0号丝线在左肾的输尿管上上下结扎两道,上一道丝线结扎在左肾下极,从两道结扎点中间剪断输尿管,造成输尿管的梗阻,然后给予逐层缝合关闭幼鼠腹腔。假手术组同期也进行两次手术,手术环境和方法同其余4个手术组,但每次打开腹腔后仅剥离脏被膜,关腹。第一次手术后第2天,对所有幼鼠进行灌胃:虫草组(1.2mg/g/d溶于等体积蒸溜水灌胃)。假手术组(等体积蒸溜水灌胃),模型组(等体积蒸溜水灌胃),芪黄保肾方组按芪黄保肾方4mg/g/d溶于等体积蒸馏水灌胃,联合组为4mg/g/d芪黄保肾方+1.2mg/g/d虫草菌丝粉溶于等体积蒸馏水灌胃。每天06:00和18:00各灌胃一次。每周据新测体重计算一次药量。在术后21天后每组处死10只,麻醉剖腹后用采血针在腹主动脉采血2-3ml,测血清中肌酐、尿素氮的含量,迅速摘下梗阻侧肾脏,观察其外观,生理盐水清洗干净后,取一半肾脏组织浸于10%福尔马林中固化,光镜观察病理学改变,免疫组化检测PAX2的表达。结果:1.与模型组比较,芪黄组、联合组及虫草组幼鼠一般状态较好,幼鼠体征均优于模型组。2.与模型组比较,芪黄组、联合组及虫草组幼鼠血清肌酐及尿素氮含量均低于模型组。其中联合组血清肌酐及尿素氮含量均优于其他各组。3.对梗阻侧肾组织的光学显微镜观察:假手术组可见小球、肾小管间质未见增生。模型组(图2)可见部分肾组织肾小球呈现局灶性或全部硬化,本次实验以小球系膜细胞及基质重度增生,球基底膜增厚,管扩张、萎缩,间质有大量炎性细胞浸润,同时伴有纤维组织增多,间质呈现纤维化。虫草组(图3)及芪黄组(图5)小部分肾小球局灶性硬化,部分肾组织小管有扩张、系膜轻度增生,轻度间质纤维化,伴炎症细胞浸润。联合组(图4)表现在间质细胞轻度增生,部分小管扩张,管壁变薄,少量炎症细胞浸润。4.与模型组比较,免疫组化半定量分析显示芪黄组及虫草组、联合组肾小管PAX2的表达均少于模型组。且联合组(图10)下调PAX2蛋白的表达最明显。结论:1.芪黄保肾方能够改善肾衰竭幼鼠的生存状态。2.芪黄保肾方能够改善肾衰竭幼鼠的肾功能。3.芪黄保肾方能够减轻肾衰竭幼鼠肾脏病理损害,降低肾小管的损害,起到拮抗肾间质纤维化的作用。4.芪黄保肾方能够下调肾衰竭幼鼠肾组织PAX2的表达,使细胞外基质成分合成减少,减缓肾间质纤维化的发展,推测其可能为芪黄保肾方防治肾衰竭的作用机制之一,可为临床治疗儿童肾衰竭提供依据。

关键词：芪黄保肾方单侧输尿管结扎术 PAX2 幼鼠

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螺内酯对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织中骨形成蛋白-7的表达的影响

螺内酯对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织中骨形成蛋白-7的表达的影响

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作者：郑慧河北医科大学

学位级别：硕士

目的:肾间质纤维化是多种原因引起的细胞外基质成分在肾间质内过度沉积。肾间质纤维化是多种肾脏疾病进展至终末期肾衰竭的共同通路。近年研究显示肾间质纤维化是导致慢性肾功能损伤的主要因素之一,肾间质纤维化的程度与肾功能的相关性... 详细信息

目的:肾间质纤维化是多种原因引起的细胞外基质成分在肾间质内过度沉积。肾间质纤维化是多种肾脏疾病进展至终末期肾衰竭的共同通路。近年研究显示肾间质纤维化是导致慢性肾功能损伤的主要因素之一,肾间质纤维化的程度与肾功能的相关性比肾小球硬化与肾功能的相关性更为密切。阻止或延缓这一过程的发生与发展,可延缓慢性肾衰的发生。肾间质纤维化的机制较为复杂,多种细胞因子和生长因子均参与肾间质纤维化的发生和发展,其中研究最多、作用最明显的是转化生长因子β1(transforming growth factor, TGF-β1)。它是一种强效的致纤维化因子,在肾间质纤维化时表达增加,并成为目前抗纤维化治疗的主要靶标。骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein7, BMP-7)是转化生长因子超家族的另一成员,在肾脏疾病中表现正相反。国外有实验证明BMP-7对于防止肾小管间质纤维化,保护肾功能起有益的作用,并被认为是一种潜在的内源性肾脏保护因子,具有很好的应用前景,但国内对BMP-7在肾脏方面的研究还不是很完善。细胞外基质(extra cellular matrix, ECM)产生增加和(或)降解减少导致的ECM异常积聚,是肾间质纤维化重要机制之一。TGF-β1通过增加ECM成分如I、II、III、IV型胶原及纤维连接蛋白促使ECM沉积,因此,下调TGF-β1制其在肾间质纤维化发生、发展中的作用,是一种有效的防止纤维化的手段。在肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)中,血管紧张素II受体拮抗剂对肾脏的保护作用已得到人们的公认,但对醛固酮研究较少。近年研究证明,醛固酮作为独立的因素参与了心、肝、肺等器官组织的纤维化。醛固酮也是肾纤维化过程中一个重要因素,越来越受到各国学者的重视。新近国外文献报道,在单侧肾切除致高血压大鼠模型、残余肾衰竭模型、慢性环胞霉素A肾毒性的大鼠模型中发现,醛固酮能增加前炎症基因MCP-1、IL-6、IL-1β的表达,上调TGF-β1、刺激肾间质Ⅰ型胶原合成和纤维连接蛋白分泌,导致ECM堆积,醛固酮加速了肾间质纤维化的形成,加重蛋白尿和肾功能衰竭。这些实验研究同时应用醛固酮受体拮抗剂,其能减低上述炎症因子及TGF-β1的表达。减轻了ECM的沉积,明显减轻了肾小球及肾间质纤维化。然而,醛固酮受体拮抗剂应用于预防及减轻肾间质纤维化的报道在国内尚不多见。本实验以大鼠单侧输尿管结扎术(unilateral ureteral obstruct, UUO)建立肾间质纤维化模型,以醛固酮受体拮抗剂螺内酯灌胃法作用于该模型,通过观察肾脏病理改变,观察BMP-7在肾组织中的分布和表达,及其与肾小管间质损害之间的关系,免疫组织化学方法检测BMP-7蛋白表达变化,同时应用反转录PCR方法观察BMP-7 mRNA的表达情况,进一步证明BMP-7在肾间质纤维化中的作用,研究螺内酯在肾间质纤维化中对BMP-7的影响,本实验通过对肾间质纤维化机制的进一步揭示,为慢性肾脏病的临床治疗提供了理论指导。方法:选择健康雄性SD大鼠36只(清洁级),体重180～200 g。随机分为假手术组(A组)、UUO组(B组)、UUO+螺内酯治疗组(C组),每组各12只。每组又因于术后第7、14天分批处死而分为N7、N14组,每组各6只。10%水和氯醛(3 mg/kg体重)经腹腔注射麻醉后,行左侧输尿管结扎术,建立单侧输尿管梗阻模型,假手术组只游离输尿管但不结扎。C组给予螺内酯20 mg/Kg,溶于适量生理盐水中灌胃,A组和B组给予等量生理盐水灌胃,每日一次。分别于术后第7、14天处死。迅速切取左肾,去掉包膜,按冠状位纵形剖开,一部分立即置于Eppendorf管中液氮冷冻,随后于-70℃低温冰箱中保存以备提组织RNA,另一部分置于10%中型甲醛中固定后行石蜡包埋。左侧肾组织行HE染色,光镜观察肾脏病理改变。采用免疫组织化学染色测定肾间质BMP-7蛋白表达,结果应用图像分析系统进行分析。反转录PCR检测BMP-7 mRNA水平,结果应用凝胶成像系统分析成像。所有结果用均数±标准差(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,利用SPSS 10.0软件进行统计学分析。结果:HE染色肾脏组织学检查假手术组无明显病理改变。梗阻组随时间延长,梗阻侧肾脏间质纤维化逐渐形成并进展,而肾小球改变不明显。可见: 1肾小管逐渐扩张,14天肾小管扩张同时伴肾小管结构破坏。 2纤维化由轻到重,肾间质逐渐增宽,胶原成分逐渐增加。 3炎症细胞浸润增加。 4血管壁逐渐增厚,纤维化。 5肾小球囊增厚,纤维化。 6肾小球病变轻,常到轻度系膜增生。Masson染色上显示的病理改变同HE染色,而胶原纤维被染成兰色,细胞染成红色,随梗

关键词：单侧输尿管结扎术螺内酯肾间质纤维化转化生长因子-β1 骨形成蛋白-7

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阿魏酸钠对单侧输尿管结扎大鼠骨桥蛋白和CD44表达的影响

阿魏酸钠对单侧输尿管结扎大鼠骨桥蛋白和CD44表达的影响

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作者：曹小会河北医科大学

学位级别：硕士

目的:肾间质纤维化(Renal interstitinal fibrosis, RIF)是各种慢性肾损害的共同特征。与肾小球硬化相比,肾间质纤维化的程度与肾功能损害的程度有更高的相关性,故常以间质纤维化作为评价各种肾脏病进展程度的可靠指标。肾间质纤维化的... 详细信息

目的:肾间质纤维化(Renal interstitinal fibrosis, RIF)是各种慢性肾损害的共同特征。与肾小球硬化相比,肾间质纤维化的程度与肾功能损害的程度有更高的相关性,故常以间质纤维化作为评价各种肾脏病进展程度的可靠指标。肾间质纤维化的发病机制及因素较多,其中肾间质巨噬细胞的积聚程度与随后相应部位的纤维化程度密切相关,是启动肾间质纤维化病变的重要始动环节。由于间质的巨噬细胞来源于血液中的单核细胞,因此肾间质产生的趋化因子在该过程中发挥重要作用。而骨桥蛋白(osteopontin OPN)是吸引肾间质巨噬细胞最重要的趋化因子,其表达量与间质炎症和纤维化程度密切相关。OPN不但趋化循环中的单核巨噬细胞到肾小管间质,而且直接刺激肾固有细胞如肾小管上皮细胞,启动或扩大炎症反应,而炎症反应可导致肾小管变性损伤,继而肾间质成纤维细胞活化、肾小管萎缩消失。研究发现在肾小管最初受损时,OPN还可促进肾小管上皮细胞再生和重建,帮助其功能的恢复,但随着病情的发展,病变逐渐严重,这种作用失代偿。由此可推断通过局部阻断OPN因子,抑制单核巨噬细胞在肾间质的聚集与增殖,可达到减轻炎症反应,减轻肾小管损伤、抑制纤维化的目的。CD44是OPN的主要配体,已有的研究表明, CD44在炎症过程中发挥重要作用。阿魏酸钠(sodium ferulate,SF)是阿魏酸的合成钠盐,普遍存在于当归、川芎等常用植物药中,水溶性好,已证实SF为一种非肽类内皮素受体拮抗剂,可清除自由基,防治脂质过氧化损伤;拮抗内皮素引起的血管收缩、升压、血管平滑肌细胞增殖,减轻血管内皮损伤、增加一氧化氮(NO)合成、松驰血管平滑肌等特征,可以延缓肾间质纤维化,发挥保护肾功能的作用。目前尚未检索到阿魏酸钠在UUO模型中对于OPN及CD44调节作用,本实验选用经典的UUO模型来进行小管间质纤维化发病机制及干预的实验研究,通过病理及免疫组化的方法观测肾脏中OPN及CD44的表达情况,并观察经阿魏酸钠干预后,OPN、CD44及单核巨噬细胞抗原阳性(ED-1+)细胞表达的改变情况,以阐明OPN参与了肾间质纤维化的发生发展及阿魏酸钠发挥肾脏保护作用机理之一是通过下调OPN和CD44的表达。方法:选择清洁级健康雄性SD大鼠54只,体重(210±10)克,随机分为三组:假手术组(A组n=18),输尿管结扎组(B组n=18),阿魏酸钠治疗组(C组n=18)。将各组大鼠以水合氯醛(0.1ml/kg)腹腔注射麻醉后,行左侧耻骨上切口,沿左肾下极寻找到左侧输尿管,在中上1/3处用4号线上下结扎两处,然后从中剪断输尿管,以防逆行性感染,A组除不结扎和剪断输尿管外,其他手术过程同前。术后各组大鼠均正常饮食。A组和B组大鼠用生理盐水2ml灌胃,1次/日;C组大鼠以阿魏酸钠混悬液110mg/kg/d灌胃,1次/日。三组均于术前一天开始灌胃至术后第3、7、14d每组大鼠各取6只处死,快速取出左肾,按冠状位纵形切开,取肾组织的1/2置于10%福尔马林固定液固定48小时,然后行石蜡包埋,制成5μm切片,分别用于光镜、苏木苏伊红染色(HE染色)、马松染色(Masson染色)观察肾脏病理改变,采用免疫组织化学染色测定OPN、CD44的表达及肾间质单核巨噬细胞数的变化,结果应用图像分析系统进行半定量分析。实验结果均以均数±标准差(x±s)表示,各组间比较采用单因素方差分析,相关分析采用直线相关分析,应用SPSS 11.0统计分析软件对实验数据进行统计学处理,P<0.05为有统计学意义。结果:光镜下观察,HE及Masson染色A组未见异常,B组及C组各时相点大鼠肾脏肾小球无明显变化。HE染色B组术后3天肾小管扩张不明显,间质中少量单核细胞与淋巴细胞浸润,肾间质宽度增加;B组7天可见肾小管扩张明显,上皮细胞变性、水肿、甚至坏死,肾间质大量炎症细胞浸润,间质宽度明显增加,偶见萎缩肾小管;B组14天上述病变加重,可见弥漫的肾小管基底膜增厚皱缩,小管基底膜不同程度断裂,皮质及外髓萎缩的肾小管较多,间质中大量淋巴单核细胞浸润,纤维化较明显。Masson染色可见B组术后3天肾小管扩张,肾间质宽度增加,胶原纤维增加,染色加深;此后,病变逐渐加重。C组与B组平行相比肾小管间质病变程度明显减轻,肾间质相对面积明显减少(P<0.05)。三组间比较均有统计学差异(P<0.05)。免疫组织化学结果显示:①OPN在A组肾组织的亨利氏襻升支粗段、远曲小管、集合管均有少量持续表达,而在肾小球内基本无表达。B组大鼠梗阻侧肾小管-间质中OPN表达较A组明显增加(P<0.05)且表达随小管损伤范围的增加及肾间质纤维化的加重呈明显升高趋势。OPN主要分布在肾小管上皮细胞胞浆及肾小管上皮刷状缘,部分间质细胞亦有表达。

关键词：阿魏酸钠单侧输尿管结扎术肾间质纤维化骨桥蛋白 CD44 单核巨噬细胞

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