检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：李鹏中国科学院大学

学位级别：博士

一切生命活动的关键问题均可在细胞中寻求到最终答案，因为细胞是生命体的结构与功能的基本单元。人类对细胞的研究随着实验研究手段的更新而日益发展。目前，单细胞层次的科学研究对生物学基础问题研究、重大疾病早期诊断及个性化医疗... 详细信息

一切生命活动的关键问题均可在细胞中寻求到最终答案，因为细胞是生命体的结构与功能的基本单元。人类对细胞的研究随着实验研究手段的更新而日益发展。目前，单细胞层次的科学研究对生物学基础问题研究、重大疾病早期诊断及个性化医疗等领域发挥着重大作用，代表了细胞研究最新的发展方向与研究热点。　　扫描离子电导显微镜(Scanning ion conductance microscope: SICM)由于可实现无损、高分辨率、液态环境下的成像，以及可提供简单、高效及细胞低损伤的生物/化学物质激励，成为极具发展潜力的单细胞分析工具。　　但目前现有SICM成像仍存在系统漂移、噪声、扫描速度慢等问题，实现活体细胞的高质量、高效观测仍面临巨大挑战。此外，SICM激励仍存在缺乏定量化分析的问题，无法满足面向活体细胞的精准、高效的生物化学物质激励的需求。　　本论文针对基于SICM的高质量、高效的单细胞成像研究所面临的问题以及单细胞定量化物质激励研究所面临的巨大挑战，在系统地研究分析SICM作业机理的基础上，重点开展了以下研究工作:　　(1)新型成像模式研究:针对SICM传统成像模式存在的抗干扰能力差、扫描速度慢等问题，本研究创新性地提出了基于交流激励的同相电压调制成像方法，有效解决了直流模式与跳跃模式的抗干扰能力差问题;同时，该方法具有比距离调制模式更高的调制频率，有效提高了成像效率。　　(2)微弱信号优化方法:SICM新型成像模式中存在信噪比低、成像质量较差、调制频率受限等问题。本研究提出了基于电容补偿的信号优化方法，有效解决了信噪比低、成像质量较差、调制频率受限等问题;同时优化了工作距离参数以及系统带宽参数。实验表明:这种优化方法使得成像效率与成像质量均有了进一步提升。　　(3)激励定量化方法:目前尚未有有效手段实现SICM定量化的生物/化学物质激励。本研究提出了基于库尔特计数原理的精密操控方法，能够实现对激励量的精密操控，通过调整驱动方式的极性控制激励量的运动方向，通过同步监测电脉冲信号的个数表征激励量的多少。以聚苯乙烯小球与腺病毒颗粒为生物/化学物质代表样本的激励实验表明了该方法的有效性，且操控精度可精确到单颗粒级别。　　(4)实时反馈、高速闭环的系统构建技术。本研究攻克了微弱信号检测与系统去噪等难题，完成了硬件集成、实时系统构建以及软件开发等研究工作，最后利用该实验平台开展了大量实验研究，验证了本文提出的新型成像模式与定量化激励方法的正确性与优越性。　　本论文通过理论分析、系统构建、及实验研究工作，丰富了SICM的成像机制，提高SICM抗干扰能力与速度，拓展了SICM的功能和应用范围。SICM在单细胞分析方面的独特优势，将进一步推动单细胞分析技术的发展。

关键词：单细胞分析扫描离子电导显微镜同相电压调制模式电容补偿技术定量激励方法

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基于拉曼镊子的发酵过程单细胞分析:进展与问题

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广西科学 2021年

作者：王桂文黄庶识陶站华广西科学院生物物理与环境科学研究中心

微生物发酵是个复杂的过程,而细胞间的异质性对微生物发酵性能有重要的影响。通过单细胞分析了解微生物细胞的异质性,利于发酵环境的优化,从而减少细胞间的异质性,提高发酵性能。整合显微拉曼光谱和光学微操控的拉曼镊子是实时、无损、... 详细信息

微生物发酵是个复杂的过程,而细胞间的异质性对微生物发酵性能有重要的影响。通过单细胞分析了解微生物细胞的异质性,利于发酵环境的优化,从而减少细胞间的异质性,提高发酵性能。整合显微拉曼光谱和光学微操控的拉曼镊子是实时、无损、无需标记且快速灵敏的单细胞分析方法。本文重点回顾拉曼镊子在聚酯、类胡萝卜素、脂肪酸、生物乙醇以及重组蛋白等发酵过程的应用,并分析其在应用上存在的不足。在克服自身不足、融合新的分析技术与数据处理方法后,拉曼镊子将是了解细胞异质性、认知复杂生物过程的有力手段。

关键词：微生物发酵拉曼光谱拉曼镊子异质性单细胞分析

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微流控芯片动态胞吞和高通量单细胞分析的研究

微流控芯片动态胞吞和高通量单细胞分析的研究

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作者：徐春秀浙江大学

学位级别：博士

细胞是生物体的形态结构和生命活动的基本单元,人们要了解生物体生命活动的规律,必须以研究细胞为基础,考察细胞的结构和功能,探索细胞的生命活动。细胞的胞吞是将细胞外基质、病毒、微组织或纳米粒子运送到细胞内部的一个重要生理过程... 详细信息

细胞是生物体的形态结构和生命活动的基本单元,人们要了解生物体生命活动的规律,必须以研究细胞为基础,考察细胞的结构和功能,探索细胞的生命活动。细胞的胞吞是将细胞外基质、病毒、微组织或纳米粒子运送到细胞内部的一个重要生理过程。目前研究纳米粒子的胞吞主要采用的是静态法,即将纳米粒子和细胞在静止的状态下共培养。而人体的实际情况有所不同,被人体摄入的纳米粒子处在血液循环当中,用传统的细胞培养方法无法模拟纳米粒子在血液循环中的环境。单细胞分析对生物、医学及重大疾病早期诊断、药物筛选等领域的具有重要意义。然而,细胞内的物质含量极低,给单细胞分析构成了严重的挑战。迄今为止,绝大多数芯片电泳单细胞分析的方法分析通量都较低,因此大大限制了其在实际分析中的应用。微流控芯片的微通道尺寸和细胞的大小十分匹配,使得微流控芯片尤其适合用于细胞的引入、操纵、溶膜、分离及检测。因此,芯片系统用于胞吞和单细胞分析引起了极大的兴趣。但是,大部分体细胞倾向于吸附在细胞容器如玻璃或塑料表面,因此,高通量分析单细胞的难度很大。本文用微流控芯片在体外模拟人体血液流动状态下细胞胞吞二氧化硅纳米粒子的方法和特性。通过调节储液池的液面差,细胞从微通道入口流入并在通道内沉积贴壁生长。将含有贴壁细胞的微流控芯片放入37℃and 5% C02的培养箱中,使细胞培养液连续流过贴壁细胞,培养24小时后,在流动的培养液中加入作为荧光标记物的500 nm粒径掺杂异硫氰酸荧光素(FITC)的二氧化硅微球(MSN),继续培养6 h后,用荧光显微镜测定细胞胞吞二氧化硅纳米粒子后的荧光强度,考察了不同流速下细胞对二氧化硅微球摄入量的影响。与传统的静态实验方法对比,本方法首次模拟了人体中血液流动对药物吸收的影响。在动态条件下,细胞对二氧化硅微球的吞噬量明显下降,当流速从0.022 mm/s增加至0.74mm/s时,吞噬量从静态测得值的74.7%下降至7.1%。本文建立了高通量的单细胞分析芯片系统,该芯片系统集成了单细胞连续引入、快速动态溶膜、芯片电泳及激光诱导荧光(LIF)检测等功能于一体。设计了带两支鞘流的十字芯片。通过调节储液池的液面,被标记的细胞在液面差的作用下被鞘流水力聚焦排成一条直线并有序地通过十字交叉口。在分离通道方向加上一个电场,排列好的细胞拐进分离通道并在分离通道入口处被加在鞘流缓冲液中的Triton X-100快速溶膜(溶膜时间少于33 ms)。该方法最快的单细胞进样速度可达到150 cells/min。样品通道两边引入鞘流液能显著减少进入分离通道的PBS溶液并降低在电泳分离中由此产生的热效应。该方法用于测定人血红细胞中的谷胱甘肽(GSH)和活性氧(ROS)组分,能达到38 cells/min的分析通量。该方法简单易行且分析通量高,能快速分析大量的细胞从而给出统计结果。本文还建立了一种基于3D聚焦连续快速分析HepG2贴壁细胞中活性氧(ROS)和还原型谷胱甘肽(GSH)的芯片电泳方法,设计了带有三条鞘流通道的十字芯片,在样品通道左右和下方各引入一条鞘流通道,样品流底部的鞘流有效地防止了细胞的沉降贴壁。标记的细胞在鞘流的3D聚焦下逐个顺利地流经过十字交叉口,在分离通道上施加电场时,排列好的细胞依次拐入分离通道并在入口处被加在鞘流中的SDS快速溶膜(<400 ms),最大的单细胞引入速度可达151 cells/min。在系统中引入鞘流通道不仅保证了高通量单细胞进样还避免进样过程中由于细胞的贴壁效应所引起的样品通道堵塞。该芯片系统用于分析单个HepG2细胞中的活性氧和谷胱甘肽,结果满意。

关键词：胞吞微流控芯片纳米粒子二氧化硅微球单细胞分析芯片电泳鞘流高通量 3D鞘流聚焦

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基于微流控技术的单细胞分析及分子检测研究

基于微流控技术的单细胞分析及分子检测研究

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作者：叶一霏中国科学院大学

学位级别：博士

高通量的单细胞定量分析和精准的细胞内递送方法，以及快速的生物分子检测方法在生物医学和临床诊疗领域有着广泛的应用需求和研究价值。微流控技术，一种以在亚毫米尺度操纵流体为特征的技术，以其微型化、集成化的特点，在细胞分析和... 详细信息

高通量的单细胞定量分析和精准的细胞内递送方法，以及快速的生物分子检测方法在生物医学和临床诊疗领域有着广泛的应用需求和研究价值。微流控技术，一种以在亚毫米尺度操纵流体为特征的技术，以其微型化、集成化的特点，在细胞分析和分子检测的研究上表现出了巨大的前景。在细胞分析领域，微流控芯片由于具有与细胞相似的尺度量级能够提供传统细胞研究中不具备的精细可控的研究条件。利用微流控芯片实现单细胞的捕获、操纵、刺激与分析是目前研究的热点。而在分子检测研究领域，微流控芯片所具备的微尺度下独特的流体性质可用于实现多样化的驱动方式，为快速、小型化的检测提供了可能性。本论文研究了基于微流控技术的单细胞分析及分子检测，主要内容如下:　　(1)针对单细胞重要的生物物理特性——电学特性的研究缺乏高通量定量方法的难题，本文构建了基于微流控的高通量单细胞电学特性检测系统。利用交叉压缩通道的敏感机理，克服了高速流动检测中高阻抗封接的技术挑战。结合提出的等效电学模型及实时计算算法，实现了单细胞固有电学特性参数（如细胞膜比电容、细胞质电导率）的定量分析。所构建的系统的实时检测通量比金标方法——膜片钳快1万倍，达到10万细胞/小时。通过检测大量肿瘤细胞系单细胞，发现不同类型细胞的电学特性存在着显著的统计性差异，验证了所建立的方法具有区分不同类型细胞的能力。　　(2)活化的巨噬细胞存在两个极化的极端状态M1型和M2型，稳定可靠的分型对研究肿瘤、脑卒中等疾病有着重要意义，但是目前缺乏单一有效的生物标记物。本文探索研究了基于巨噬细胞电学特性区分极端状态和表征药物作用效果的可行性。基于(1)建立的方法研究发现，M1型和M2型两种状态细胞的电学特性定量值可以稳定重现并存在显著的统计学差异，显示出了电学特性作为分型标志物的特异性和稳定性。进一步研究M1型巨噬细胞在不同剂量药物作用下的电学特性变化，发现电学特性定量值与作用药物存在剂量依赖，具有明显的量效关系。选取两种药物进行的动物实验结果表明，电学特性变化量更大的药物，其疗效更加明显。系列研究表明高通量的单细胞电学特性检测方法有潜力用于可靠巨噬细胞免疫分型和相关药物效力研究。　　(3)电穿孔方法可以被用于将外源分子精准导入细胞内实现治疗和基因编辑的目的，但是对作用条件要求苛刻。针对目前的精准的电穿孔方法存在通量低、无法同步评估穿孔效果的技术难题，本文提出了基于压缩通道的单细胞电穿孔并通过阻抗变化同步评估穿孔效果的高通量方法。通过压缩通道的电场集中作用和单细胞流动中高阻抗封接的优势，实现了低电压下的高效率高活性的单细胞电穿孔，同时实现了高灵敏的穿孔程度的检测。细胞应用试验表明，所建立的方法可以灵敏调节穿孔条件，同步监测的阻抗变化规律与荧光示踪标记效果一致。该方法为单细胞电穿孔的进一步应用研究提供了有力工具。　　(4)面对快速分子检测中对于自驱动上样技术的应用需求，本文设计并开发了基于毛细驱动的微流控分子检测技术。通过对芯片的亲水化修饰，实现了在数月内稳定的低接触角维持。通过引入蛇形通道作为流阻结构、微柱阵列作为毛细泵，实现了进样液体的自驱动与连续的毛细流动。在示范应用中，基于研究的自驱动微流控芯片，在极低的样品消耗下完成了分子样本的自动上样、冲洗，实现了快速的DNA杂交检测，表明了该芯片在多步快速生物分子检测上的应用潜力。

关键词：单细胞分析分子检测微流控电学特性

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毛细管电泳—激光诱导荧光检测应用于单细胞分析和多药耐药性研究

毛细管电泳—激光诱导荧光检测应用于单细胞分析和多药耐药性研究

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作者：肖华中国科学院研究生院（大连化学物理研究所）

学位级别：博士

本论文在自行搭建的毛细管电泳-激光诱导荧光检测(CE-LIF)装置上实现了单细胞水平分析,并应用到多药耐药性研究领域。选取白血病细胞系(K562)作为研究对象,开展了多药耐药性相关机理研究,考察了碳纳米管作为载体在药物运输中的可能性,... 详细信息

本论文在自行搭建的毛细管电泳-激光诱导荧光检测(CE-LIF)装置上实现了单细胞水平分析,并应用到多药耐药性研究领域。选取白血病细胞系(K562)作为研究对象,开展了多药耐药性相关机理研究,考察了碳纳米管作为载体在药物运输中的可能性,并探讨了以多药耐药性研究为核心的单细胞分析在方法学和实际临床中的意义和应用前景。主要研究内容如下: 第一,采用CE-LIF联合流式细胞仪高通量地对单个白血病细胞系母细胞系(K562S)细胞中的荧光物质罗丹明123进行了定量检测,并将CE-LIF与流式细胞仪的测定结果进行了关联。定量计算了罗丹明123对K562S细胞的转运速度以及表观渗透系数。第二,建立了CE-LIF表征单个K562细胞上渗透性糖蛋白(Pgp)的方法,同时引入多药耐药性参数来评价细胞系之间的多药耐药性差异。单细胞分析、多细胞分析和流式细胞仪得到的结果一致。第三,考察了氧化多壁碳纳米管作为药物转运载体的可能性,将氧化多壁碳纳米管与异硫氰酸荧光素反应生成荧光探针(CNTP)后,分别用CE-LIF和流式细胞仪检测CNTP在多药耐药性细胞K562A和K562S中的分布,结果表明CNTP可以被动透过细胞膜并停留在细胞中而不会被Pgp所泵出,说明氧化多壁碳纳米管有可能成为药物转运载体。第四,采用CE-LIF定量检测了CNTP在酵母细胞中的分布,定量获取了CNTP在酵母中流入时间和温度依赖曲线,定量计算了CNTP流入酵母的表观渗透系数,结果表明CNTP可以通过内吞的方式进入酵母细胞内,这将有助于评价氧化多壁碳纳米管对于细胞膜的渗透性。

关键词：单细胞分析多药耐药性毛细管电泳激光诱导荧光氧化多壁碳纳米管流式细胞仪渗透性糖蛋白

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PD--L1--CTCs分型和多重PCR突变检测在单细胞分析中的应用

PD--L1--CTCs分型和多重PCR突变检测在单细胞分析中的应用

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作者：岳春燕中国科学院大学

学位级别：博士

目的:肿瘤是一种无论是瘤内还是瘤间都具有极强异质性的疾病，由于重复活检样本的难以获取，大样本分析容易丢失特征性信息等问题，肿瘤的个性化治疗发展受到了极大的限制，因而从单细胞水平对肿瘤标志物进行分析有着极其巨大的临床意... 详细信息

目的:肿瘤是一种无论是瘤内还是瘤间都具有极强异质性的疾病，由于重复活检样本的难以获取，大样本分析容易丢失特征性信息等问题，肿瘤的个性化治疗发展受到了极大的限制，因而从单细胞水平对肿瘤标志物进行分析有着极其巨大的临床意义。在本研究中，我们开发了两种对单细胞进行分析的方法，分别从蛋白和基因水平对单细胞进行考察，并探索其潜在的临床应用价值。\n 方法:①在单细胞蛋白表达分析中，我们采用靶向EpCAM的多肽纳米磁珠技术来分离CTCs，并通过免疫细胞化学的方法建立一套针对单个CTC上的PD-L1表达评分系统，通过免疫荧光染色强度定量，我们将单细胞上PD-L1表达水平定义为四个水平:阴性，低表达，中表达，高表达(PD-L1negative，PD-L1low，PD-L1medium和PD-L1high)。随后，我们进一步收集了接受PD-1单抗治疗的晚期消化道肿瘤患者血样，评估了该评估体系的临床适用性。②在单细胞基因突变研究中，我们首先设计了10对靶向EGFR、KRAS、PIK3CA、BRAF和ERBB2基因的10个外显子的引物，建立和优化了10重PCR扩增的反应体系;然后直接对单细胞进行原位裂解和多重PCR扩增，并通过加入8个核苷酸序列的标识码对来自同一细胞的PCR产物进行标记，随后将标记的多个细胞来源的PCR片段混合浓缩成一个库，进行NGS;对NGS数据进行分析，通过BWA MEM(0.7.12)算法比对到UCSC hg38人类基因组参考序列上，考察10重PCR在单细胞上的可行性和覆盖率。\n 结果:①在PD-L1在CTCs的分布检测中，在IBI308用药前，97％(34/35)的患者中检测到有CTCs，数量从1到70不等（中位值为7）。74％(26/35)具有PD-L1阳性CTC，60％(21/35)具有至少一个PD-L1high CTC。含有PD-L1highCTC的患者的疾病控制率(DC)(48％)要比没有PD-L1high CTC的患者(14％)高。PD-L1high CTCs比例≥20％的患者的DC率高达64％(9/14)，PD-L1high CTCs比例＜20％的患者仅为14％DC(3/21)。我们还观察到，总CTCs，PD-L1阳性CTCs和PD-L1high CTCs数目的动态变化与治疗效果相关(P＜0.001，P=0.002和0.007)。此外，基线时PD-L1high CTCs的比例对无进展生存期(PFS)具有预测意义。②单细胞多重PCR分析中，我们开发了一种基于多重PCR和二代测序的单细胞基因突变检测方法(Multiplexed PCR-based barcoding of Single cell for mutation detection using Sequencing，MSC-Seq)。首先，我们通过条件优化，确保了靶向这10个外显子区域扩增的引物具有高度的特异性;其次，通过理论计算，我们将第一轮预扩增所需的引物量降至fmol级别以下，确保引物尽量消耗，并吸取少量产物用于第二轮标记扩增，从而避免第一轮PCR引物在第二轮扩增时与新的通用引物形成非特异性扩增，降低背景噪声;再次，我们通过原位裂解单细胞并进行PCR，消除操作引起的DNA损失，通过原位裂解和多重PCR直接对单细胞进行目的片段扩增，并通过PCR引入标识码对单细胞进行标记，在NGS中，成功在单个细胞上检测到十重PCR扩增产物。\n 结论:我们证明了基于单个CTC上PD-L1表达进行分型的可行性，这种分型在PD-1单抗用药的筛选和监测中具有极大的潜在应用价值。MSC-Seq无需进行WGA，可以直接对单细胞进行原位裂解，对单细胞中低至2个拷贝的基因进多种突变检测。

关键词：肿瘤学单细胞分析程序性细胞死亡蛋白配体-1 蛋白表达基因突变

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基于活体微萃取和表面等离激元光学检测的单细胞分析方法研究及应用

基于活体微萃取和表面等离激元光学检测的单细胞分析方法研究及应...

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作者：刘佳南京大学

学位级别：博士

细胞是生命体的基本单位。为了揭示生命活动的规律,必须以研究细胞为基础,深入探索细胞的生长与分化、代谢与繁殖、运动与通讯、衰老与凋亡、遗传与进化等生命过程中的化学本质和规律。由于细胞体积极小、细胞内物质种类繁多以及细胞内... 详细信息

细胞是生命体的基本单位。为了揭示生命活动的规律,必须以研究细胞为基础,深入探索细胞的生长与分化、代谢与繁殖、运动与通讯、衰老与凋亡、遗传与进化等生命过程中的化学本质和规律。由于细胞体积极小、细胞内物质种类繁多以及细胞内重要生物分子的含量极低等研究难点,通常的细胞生物学研究主要是以大量的细胞为研究对象,得到的是基于细胞群体水平的平均化结果,这种基于细胞群体的研究方法忽略了细胞异质性这一根本的生物学问题,因而难以反映出单细胞水平上真实的生命活动本质和规律。因此,基于单细胞的研究得到越来越广泛的关注和重视。尽管目前已经发展了很多种单细胞分析技术,例如毛细管电泳、微流控芯片,质谱、流式细胞术、成像和单细胞印迹技术等。然而,现有的技术主要存在以下明显的不足:第一、绝大多数现有技术由于灵敏度不够,通常只适用于分析单细胞中高表达水平的生物分子,例如微流控芯片、质谱和单细胞印迹技术等;第二、绝大多数现有技术无法进行活细胞分析,这些技术需要裂解细胞或者经过分析后细胞已经死亡,例如毛细管电泳、微流控芯片和质谱等;第三、少数几种现有单细胞技术具有较高的灵敏度,并且能对细胞中低浓度的生物分子进行分析,例如激光诱导荧光检测、成像等,但是,这些技术往往依赖于多种报告分子系统,标记试剂的引入必然会改变细胞原有的化学组成和细胞生理环境,因而对检测结果产生一定的影响。表面增强拉曼散射是一种很有发展前景的超灵敏检测技术,该技术具有超高的检测灵敏度,甚至低至单分子水平;并且,该技术不存在光漂白或自淬灭等现象,而且受样品和检测环境的影响较小。然而,目前表面增强拉曼散射在单细胞内生物分子检测方面的报道较少。本论文针对单细胞分析的难点,将活体微萃取技术和表面等离激元光学检测技术相结合,以单细胞内特定生物分子为目标,根据不同类型生物分子的特征,设计并制备了多种不同亲和配基功能化的微萃取材料和纳米标记材料,实现了对单细胞内低拷贝数生物分子的定性与定量分析。首先,本文建立了一种“表面等离激元免疫夹心法(Plasmonic Immunosandwich Assay,PISA)”的新颖方法,用于单细胞中低拷贝数蛋白质的定性及定量分析。该方法与现有的单细胞蛋白质分析方法相比有以下显著的优点:第一,专一性强,该方法以分子印迹聚合物和抗体为亲和配基,保证了方法的高专一性;第二,高灵敏度,该方法考虑了双金属协同增强作用,采用独特的微、纳探针组合获得特殊的表面等离激元光学效应,极大地增强了检测信号,检测限低至单细胞单分子水平;第三、分析速度快,从单细胞中特定目标蛋白的萃取到最终信号的获取,仅需要20 min左右;第四、该方法对单细胞损伤较小,经过分析后细胞仍能存活并且可以继续用于其它相关研究。该方法在多种基于单细胞分析的医学领域具有重要的应用前景,例如细胞质量控制、癌症的诊疗与预后、脑科学等。其次,本文建立了一种基于核酸识别的“表面等离激元亲和夹心法(Plasmonic Affinity Sandwich Assay,PASA)”的新型方法,用于单细胞中低拷贝数microRNAs的定性及定量分析。与传统的microRNAs分析方法相比,本文建立的单细胞microRNAs方法具有以下优点:第一,该方法是一种非PCR扩增的方法,主要利用碱基互补配对原则,设计与目标microRNAs序列互补的探针,直接对单细胞内目标microRNAs进行萃取;第二,该方法分析速度快,且灵敏度高,整个分析过程大约需要20 min左右,检测限低至单细胞单分子水平;第三,该方法是一种微创、低干扰的检测方法,可以从复杂的细胞内环境中萃取出特定目标microRNAs,并且分析后细胞仍保持活性也不影响细胞正常的生理功能;第四,该方法应用范围广,不仅可以分析单个活细胞内目标microRNAs,还可以分析极小体积复杂样品中(例如单细胞裂解液)的目标microRNAs;第五、该方法所需实验材料的制备简单、快速且产率较高,能实现批量化生产。该新型的单细胞microRNAs分析方法为单细胞转录组学的研究、新的核酸类癌症标志物的鉴定和筛选提供了新的研究思路和有力的分析手段。最后,本文在已经建立的单细胞分析方法的基础上,对其应用范围作了进一步拓展,对单细胞内生物分子的空间分布进行深入研究。从原先针对细胞质中目标生物分子的定性及定量分析方面,逐渐深入到可以同时对单个细胞的细胞核、核与质不同区域中目标生物分子进行定性及定量分析。如果配置更高分辨率的显微镜,本应用还适用于其它更小的细胞器中目标生物分子的分析。该应用具有较高的空间分辨率,为研究单细胞生物分子的定位、揭示生理活动相关分子的信号通路、代谢途径及调控规律提供了新的方法学手段。

关键词：单细胞分析拉曼光谱表面等离激元光学单分子检测蛋白质微小核糖核酸空间分布

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基于微流控技术的细胞分选和单细胞分析用于肿瘤药物敏感性研究

基于微流控技术的细胞分选和单细胞分析用于肿瘤药物敏感性研究

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作者：裴海盟山东师范大学

学位级别：博士

患者的遗传信息、生活环境的差异会导致不同患者对同一药物的敏感性存在明显的差异。在肿瘤的治疗过程中,患者的药物敏感性差异以及患者对药物产生的耐药性都会导致难以实现对肿瘤精准用药,从而影响药物的治疗效果。准确的药物敏感性分... 详细信息

患者的遗传信息、生活环境的差异会导致不同患者对同一药物的敏感性存在明显的差异。在肿瘤的治疗过程中,患者的药物敏感性差异以及患者对药物产生的耐药性都会导致难以实现对肿瘤精准用药,从而影响药物的治疗效果。准确的药物敏感性分析是实现肿瘤精准用药的前提。基于标准细胞系的肿瘤药物药敏性分析是一种常用的手段,该方法是在药物作用后检测细胞的增殖或细胞活性的变化来评估细胞对药物的敏感性。然而,这种方法并不能很好的反映肿瘤患者对药物敏感的真实情况。针对患者来源的肿瘤细胞进行药物敏感性分析有助于探究患者对药物响应的真实情况,该方法通过统计在药物作用后大量细胞的活性变化来实现肿瘤细胞对药物的敏感性分析,这种基于群体细胞的分析方式忽略了细胞间异质性,掩盖了某些特殊细胞的重要信息,无法全面获取细胞对药物的敏感性信息。此外,患者来源的肿瘤细胞需要通过手术获得病理组织,这种侵入性的获取方式无法满足实时、多次的药物敏感性分析。针对上述问题,首先需要寻找能够代替肿瘤患者病理组织并且能够反应患者肿瘤信息的细胞,构建一种无创、实时地分选和获取方法。其次,针对获取的肿瘤细胞,需要发展高效、精准的细胞操控技术和高灵敏的分析方法用于在单细胞水平精准解析细胞对药物的敏感性。此外,为了全面地获取肿瘤细胞的药物敏感性信息,除了关注细胞的活性,我们还可以从细胞表型、细胞黏附性、细胞分泌水平等多个角度分析肿瘤细胞的药物敏感性。微流控技术是一种可以在微纳米尺度精准操控流体的技术。在微流控芯片中,多样化的微尺度结构和微尺度的限域空间使得反应体积小、反应速率快、试剂消耗少,通过联用光、电、质谱等多种检测手段可以实现单细胞进样、反应、分离、检测的集成。基于上述优势,微流控技术已经广泛地用于细胞分选和单细胞分析,它为患者来源的稀有细胞的获取和在单细胞水平上的肿瘤药物敏感性分析提供了契机。基于微流控技术,本论文主要工作如下:1.构建了一个集成的微流控芯片用于全血中循环肿瘤细胞(CTCs)的快速分选和计数。该芯片首先利用惯性聚焦原理在螺旋通道内进行CTCs快速初步分选,再利用确定性侧向偏移(DLD)原理实现CTCs进一步纯化和浓缩。该芯片能够从全血中快速分选CTCs,呈现出了高纯度(92±3%)和高通量(6 m L全血/小时)的优势。我们通过分析异种移植荷瘤小鼠和不同肿瘤阶段的结直肠癌患者中的CTCs个数,探究了CTCs数量与药物响应的相关性。2.在第一个工作的基础上,将CTCs分选芯片与分析芯片结合,实现了全血中CTCs分选、富集、在线标记和单细胞表型分析的连续操作。通过建立上皮间质转换(EMT)标志物Ep CAM和N-Cadherin单细胞定量曲线,在单细胞水平上实现了细胞EMT表型的定量区分,分析了结肠直癌病人中的CTCs表型,探究了EMT表型与药物敏感性的相关性。3.基于无标记分离肿瘤干细胞的微流控芯片,我们利用细胞黏附差异性从群体细胞中分离出低粘附性的细胞亚群并对其进行了干细胞特性的验证。低黏附细胞可代替稀有的肿瘤干细胞(CSCs)进行药物敏感性分析。我们评估了药物作用细胞后的细胞成球抑制率,结果显示只有低黏附细胞对CSCs特异性药物有较好的响应。临床组织样本的分析也显示了患者来源的低黏附细胞对CSCs特异性药物有较好的响应。4.基于含有微孔阵列的微流控芯片实现了肿瘤细胞和外囊泡(EVs)的同时分析,分析了耐药细胞和敏感细胞分泌外囊泡的差异,探究了肿瘤细胞分泌外囊泡与细胞耐药性的关联性,证实了细胞在低浓度药物刺激时能够释放更多的EVs以增强细胞的存活率。我们推测抑制EVs的释放可成为干预肿瘤细胞耐药的一种策略。

关键词：微流控技术细胞分选单细胞分析药物敏感性分析

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毛细管电泳/安培检测生物物质及单细胞分析

毛细管电泳/安培检测生物物质及单细胞分析

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作者：董谦山东大学

学位级别：博士

该文第一章首先对毛细管电泳(CE)的基本原理及其与联用的常见检测器(紫外、激光诱导荧光和电化学检测器)进行了简单的介绍.其次对CE电化学检测中应用较少的电导和电势检测器的原理和典型的装置进行了简述.然后详细的综述了应用最多的安... 详细信息

该文第一章首先对毛细管电泳(CE)的基本原理及其与联用的常见检测器(紫外、激光诱导荧光和电化学检测器)进行了简单的介绍.其次对CE电化学检测中应用较少的电导和电势检测器的原理和典型的装置进行了简述.然后详细的综述了应用最多的安培检测及其应用.第二章涉及到乳酸钠、丙酮酸钠及转铁蛋白的CZE/柱端安培检测.第三章研究的是CZE/柱端安培检测19种常见的氨基酸,采用萘-2,3-二缩醛(NDA)及NaCN柱前衍行的方法.第四章研究了用CZE/柱端安培检测法,在pH7.0的Na<,2>HPO<,4>-NaH<,2>PO<,4>缓冲液中用Au/Hg电极检测单个巨噬细胞中的谷胱肽甘肽(GSH).第五章中采用细胞电穿孔这咱将物质导入细胞中的技术,实现了将双氯灭痛这种药物入人血红细胞,并对单个血红细胞中导入的双氯灭痛的含量用CZE/柱端安培检测法进行测定.第六章中我们对CZE/柱端安培检测法检测了单个人血红细胞(人细胞中直径最小体积也最小的细胞)中的氨基酸.

关键词：毛细管电泳安培检测生物物质单细胞分析

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原位衍生质谱分析及其在单细胞分析中的应用

原位衍生质谱分析及其在单细胞分析中的应用

引用

作者：庄美慧中国科学技术大学

学位级别：博士

细胞异质性是一个普遍存在的现象,相较于常规的细胞群体数据(大量细胞分析的均值结果),单个细胞的特征信息会在平均化过程中被掩盖,而丢失了细胞之间的异质性结果,这些信息可能会在癌症的早期诊断和治疗中起到至关重要的作用。单细胞分... 详细信息

细胞异质性是一个普遍存在的现象,相较于常规的细胞群体数据(大量细胞分析的均值结果),单个细胞的特征信息会在平均化过程中被掩盖,而丢失了细胞之间的异质性结果,这些信息可能会在癌症的早期诊断和治疗中起到至关重要的作用。单细胞分析有望在基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学水平上对细胞异质性有新的认识,有助于我们进一步了解生物变异,疾病和治疗的敏感性差异。特别是直接反映细胞响应和细胞表型的小分子代谢物,作为细胞内环境的重要组成部分,参与能量平衡,细胞间通讯,渗透调节等诸多过程。但是,单个细胞的体积小(皮升量级),细胞内代谢物质的种类极其多样,浓度范围极广,物质含量极低且动态多变,并缺少放大技术,在单细胞层次仍有大量物质无法被检测,无一不对单细胞代谢物检测方法的灵敏度提出巨大的考验。近年来,原位衍生反应发展迅速。通过多种衍生反应引入电荷标签来增强目标分析物的质谱响应的方法,被广泛应用于血清/血浆,组织等生物样品中化学物质的原位分析。目前在细胞层次的原位衍生仍存在重大挑战,因为要实现单细胞层次的衍生需要必须满足原位和细胞兼容的条件,大的细胞扰动或是细胞状态的改变都会导致细胞内代谢物质的种类和浓度水平的改变。但是由于目前的衍生多使用有机试剂,UV光照等条件,限制了其在单细胞水平的应用。因此开发新型的原位衍生反应,将其应用在单细胞水平上增强其代谢物质谱分析的灵敏度是迫切需求的。该博士论文开发了多种新型的原位衍生反应,分别实现了原位的亚硝胺降解,以及血清、尿样中同型半胱氨酸的原位衍生和分析,并最终将细胞兼容的点击反应成功的应用于单细胞水平的原位衍生反应,在保持细胞活性的前提下,增强单细胞的灵敏度并进行原位实时的分析。具体从以下三个方面开展工作:1.大气压电晕放电原位降解亚硝胺反应。我们利用大气压下的电晕放电,产生高活性的自由电子,快速、高效的与亚硝胺反应,将其降解为对应的二级胺。我们进行实时,在线,原位的反应监测。并通过调节电压,鞘气组成毛细管到质谱口的距离以及溶剂组成等参数条件监测二乙基亚硝胺,甲基乙基亚硝胺和亚硝基吡咯烷的降解效率的变化,进一步确认该降解反应与电晕放电密切相关。为了进一步确认该降解反应是电晕放电过程产生的某种活性物质参与,通过对电晕放电所产生的物质施加偏转电场,发现是电负性的活性物质参与降解反应,并提出了可能是高活性的自由电子参与反应的假设,并通过理论计算进一步确认反应路径。2.点击反应用于血清,尿样中中总同型半胱氨酸和相关代谢物的检测。我们设计并合成了含有电荷标签的探针,可以通过生物兼容的点击反应与含有1-氨基-2-巯基或是1-氨基-3-巯基的反应物结合,以此来提高分析物的质谱信号。血清/血浆中的总半胱氨酸浓度的升高,已被认为是多种心血管疾病的独立影响因素。首先我们用含有电荷标签的探针在血清和尿液中特异性的快速的原位衍生以此提高同型半胱氨酸的信号,并结合感应电喷雾技术,无需与其他分离技术结合,能够直接定量总同型半胱氨酸在血清和尿液中的含量。而且该探针能够同时提高半胱氨酸和半胱氨酰甘氨酸的质谱信号,并在存在大量衍生试剂的情况下,不干扰其他未衍生且与同型半胱氨酸代谢相关的代谢物的信号。3.在复杂生物流体中成功结合生物兼容的点击反应进行原位衍生引入电荷标签,提高同型半胱氨酸的检测灵敏度的前提下,我们尝试将合成的含有电荷标签的探针直接应用于单个活细胞中半胱氨酸信号的提高。要实现这个目标,首先我们证明了该探针可以在生理条件下与半胱氨酸原位衍生引入电荷标签,在生理pH条件(pH=7.4)下具有最高的反应效率。其次,细胞在进行探针孵育后,细胞仍能够保持活性,表明该反应是细胞兼容的。随后结合课题组之前报道的单细胞取样技术,成功在单细胞层次检测到了衍生后的半胱氨酸的质谱信号并进行了定量。最后,该方法也可以在单细胞层面监测半胱氨酸的动态变化,在胱氨酸转运蛋白抑制剂的作用下细胞内半胱氨酸含量发生了下调。该方法虽然只是在单细胞层面以提高半胱氨酸灵敏度为例,但是提供了在单细胞水平提高物质灵敏度的普适性策略。

关键词：原位衍生单细胞分析质谱电荷标签点击反应

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