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1 篇 理学
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1 篇 医学
- 1 篇 药学(可授医学、理...

主题

1 篇 双砷染料-四半胱氨...
1 篇 应激反应
1 篇 持留菌
1 篇 单细菌分析
1 篇 纳米流式
1 篇 毒素-抗毒素系统

机构

1 篇 厦门大学

作者

1 篇 章苗苗

语言

1 篇 中文

检索条件"主题词=单细菌分析"

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详细简洁

排序：

毒素—抗毒素系统介导细菌应激与持留菌形成的单细菌水平研究

毒素—抗毒素系统介导细菌应激与持留菌形成的单细菌水平研究

引用

作者：章苗苗厦门大学

学位级别：硕士

毒素—抗毒素(toxin-antitoxin,TA)系统几乎存在于所有环境微生物和众多致病微生物中。TA系统通常由同一启动子下的两个共转录基因组成,分别编码不稳定的抗毒素分子(蛋白或RNA)和稳定的毒素蛋白。TA系统调控细胞内多个重要的细胞过程,... 详细信息

毒素—抗毒素(toxin-antitoxin,TA)系统几乎存在于所有环境微生物和众多致病微生物中。TA系统通常由同一启动子下的两个共转录基因组成,分别编码不稳定的抗毒素分子(蛋白或RNA)和稳定的毒素蛋白。TA系统调控细胞内多个重要的细胞过程,如翻译、DNA复制、细胞壁合成等,并在协助细菌应对应激环境、耐受抗生素作用中发挥了重要作用。研究表明TA系统的异质性表达是细菌进入休眠状态形成小部分(占细菌群体的10-4-10-6)多药耐受持留菌的关键,对TA系统的表达与作用机制进行研究有望发现新的药物作用靶标,减少或者消除持留菌的形成,从而减少临床上的反复感染与慢性疾病,缓解严峻的细菌耐药形势。目前TA系统的研究主要在基因水平与转录水平,如:实时定量逆转录PCR、RNA印迹技术等。但是蛋白质是生物体中各种生理功能的主要执行者,TA系统主要在蛋白水平调控细菌的代谢,仅在转录水平分析TA系统将遗漏导致持留菌形成的关键因素。蛋白质印迹技术(western blot,WB)是蛋白水平常用的研究方法,但集权平均的研究方法会掩盖TA系统在细菌个体间的异质性表达,无法揭示少数细菌形成持留菌时TA系统的表达情况,也无法准确研究TA系统的作用机制。采用荧光显微镜在单细菌水平对TA系统进行分析受限于通量低而难以得到具有统计代表性的数据。因此建立一种快速、灵敏、高通量的对单个细菌内毒素与抗毒素蛋白进行同时分析的检测方法至关重要。本论文利用实验室自行研制的纳米流式检测装置(nano-flow cytometer,nFCM)高灵敏、多参数表征的优势,结合适用于活体标记的双砷染料一四半胱氨酸(FlAsH-TC)体系,发展了毒素与抗毒素的单细菌水平研究方法,发现抗毒素在细菌应激中的调控作用并探讨毒素抗毒素比例与持留菌的关系。本论文包括以下主要内容:第一章为文献综述,主要介绍TA系统在细菌应激反应、持留菌的形成中发挥的重要作用以及研究方法和研究现状,并阐述了本论文的选题思路和研究内容。第二章通过单细菌水平研究解析抗毒素蛋白在细菌应激中的调控作用。基于nFCM-TC-FlAsH体系,以MqsR/MqsATA系统为模型建立抗毒素蛋白与细菌生长同时检测的方法。我们首次发现天然启动子指导下的TA系统,在无环境压力时存在高表达与低表达MqsA抗毒素蛋白的两个细菌亚群。在环境压力如胆汁应激、热激和氨基酸饥饿条件下,这两个细菌亚群通过不同的反应来调控MqsA降解或表达。此外,我们发现MqsA抗毒素蛋白在氨基酸饥饿时先降解后重新增长。同时分析MqsA抗毒素蛋白与细菌生长,发现细菌生长在环境压力下的反应与MqsA抗毒素蛋白的表达一致,但反应时间滞后60 min。以上研究结果表明,MqsA的随机增加有助于细菌存活,并且两个不同表型的亚群使得细菌能够应对变化的环境。本章发展的方法将为TA系统的异质性分析提供先进的技术手段。第三章为单细菌水平毒素、抗毒素同时检测nFCM-TA-双荧光检测法的建立,T/A比例的获取及其与持留菌形成关系的探讨。基于nFCM-TC-FlAsH体系,我们在单细菌水平检测到天然启动子指导下微量表达的MqsR毒素蛋白。通过双砷染料对MqsR-TC毒素蛋白进行标记,免疫荧光技术对MqsA-His抗毒素蛋白进行标记,结合nFCM建立nFCM-TA-双荧光检测法,在单细菌水平实现低丰度毒素与抗毒素蛋白的同时检测。为了揭示T/A比例与持留菌的关系,通过利福平诱导持留菌形成,nFCM-TA-双荧光检测法对单个细菌内的毒素与抗毒素蛋白进行同时检测。我们发现利福平作用前存在MqsA高表达MqsR低表达和MqsA与MqsR均低表达的两个亚群,前者在利福平作用后消失。特别值得注意的是在利福平作用12h时出现了第三个亚群:MqsR高表达(是同时间MqsR低表达亚群的25倍)MqsA低表达的亚群,其比例随着利福平作用时间增加而增加,24h时达到24.7%。进一步结合nFCM-TC-FlAsH体系与非跨膜型核酸染料碘化丙啶(propidiumiodide,PI)对MqsR毒素蛋白的表达与细菌生理状态进行分析,发现高表达MqsR毒素蛋白的细菌PI信号强度介于死菌和活菌之间,共聚焦显微镜观察其形态与活菌无异,说明MqsR高表达MqsA低表达的亚群依然具有生物活性。结合持留比例分析,在利福平作用下细菌个体通过先降解MqsA抗毒素蛋白,后增加MqsR毒素蛋白的双重作用来不断增加T/A比例,从而协助细菌耐受高浓度抗生素的作用。论文第四章为总结与展望。总结本论文在TA系统调控细菌应激及持留菌形成中的工作,展望TA系统与细菌耐药及TA系统交互作用方面的研究。

关键词：毒素-抗毒素系统应激反应持留菌单细菌分析双砷染料-四半胱氨酸体系纳米流式

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