检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：刘莉新疆农业大学

学位级别：硕士

随着转基因技术的发展，目前在许多物种上都成功获得了转基因动物，但外源基因在转基因动物中的表达效率依然是转基因技术中的障碍之一。DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式，调节着机体的许多生物学过程。发生在启动子区域的甲基... 详细信息

随着转基因技术的发展，目前在许多物种上都成功获得了转基因动物，但外源基因在转基因动物中的表达效率依然是转基因技术中的障碍之一。DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式，调节着机体的许多生物学过程。发生在启动子区域的甲基化修饰通常参与该基因在转录水平的表达调控。在转基因动物中，外源基因及其启动子的甲基化都可能影响着外源基因的表达。本实验室在前期的研究中通过体细胞克隆，干细胞克隆和卵周隙注射法分别获得转增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，eGFP）、成纤维细胞内生长因子5（fibroblast growth factor5，FGF5）的转基因绵羊。本研究通过检测外源基因eGFP、FGF5编码区及其启动子区的甲基化水平，并对外源蛋白表达效率进行相关性分析。结果表明，干细胞克隆外源基因启动子区的甲基化水平最高，其次是体细胞克隆，卵周隙注射法最低；而对于编码区的甲基化水平则随外源基因不同而存在差异，外源基因eGFP编码区的甲基化水平在卵周隙注射法中最高，其次是干细胞克隆；但外源基因FGF5编码区甲基化水平却在体细胞克隆最高。Western blot检测外源基因的蛋白表达水平，发现外源基因蛋白的表达量同其启动子区域的甲基化水平呈负相关性。结果提示不同的转基因方法可能会影响外源基因的甲基化水平，从而影响到外源基因的表达。纳米材料可使吸附目的基因形成纳米基因复合物，通过内吞或吞噬作用进入细胞质，属于非病毒型基因载体系统，具有易于制备和安全性高等特点。本研究利用纳米材料作为载体探索转基因技术。首先克隆获得绵羊细胞重编程因子SOX2的cDNA序列并构建表达载体pLEX-SOX2-GFP。利用MgCl2、AlCl3、NaOH三种化合物制备直径约100nm呈六边形双层片状结构的Mg2Al-Cl-LDH纳米颗粒。以纳米颗粒Mg2Al-Cl-LDH结合pLEX-SOX2-GFP转染HEK293T，流式细胞仪检测GFP荧光信号评估转染效果。优化后的转染条件是：质粒DNA与LDH共孵育的时间在15min是转染效率最高（6.93%）；质粒DNA与LDH的质量比为4：50时转染率最高（11.17%）。纳米材料浓度与转染效率呈正比，但同细胞的存活率呈反比，在200μg/ml为最佳浓度，细胞存活率最高（87%），转染后的培养时间24h时转染率最好（17.4%）。转染质粒在细胞内均有明显的绿色荧光蛋白的表达，说明该转染方法可靠，表达能力强。总之，本研究发现转基因动物中外源基因蛋白的表达量同其启动子区域的甲基化水平呈负相关，提示不同的转基因方法可能会影响外源基因的表达水平。初步建立并优化了纳米材料转基因的新方法，为转基因动物生物技术的发展提供了新思路和奠定新基础。

关键词：体细胞克隆干细胞克隆卵周隙注射甲基化 Mg2Al-Cl-LDH纳米材料 SOX2基因

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慢病毒载体法在制备转基因小鼠模型中的应用

引用

临床与实验病理学杂志 2009年第5期25卷 527-530页

作者：于莉娜张庆玲丁彦青南方医科大学南方医院病理科南方医科大学基础医学院病理学教研室广东省分子肿瘤病理重点实验室教育部广东省共建人类重大疾病转录组学和蛋白组学重点实验室广州510515

目的改进慢病毒载体法制备转基因小鼠的操作技术,分别从病毒浓缩、受精卵显微注射进针点和如何提高病毒注射效率等方面探讨慢病毒显微注射技术的最佳方案。方法超速离心获得浓缩慢病毒,通过卵周隙显微注射技术感染小鼠受精卵,比较不同... 详细信息

目的改进慢病毒载体法制备转基因小鼠的操作技术,分别从病毒浓缩、受精卵显微注射进针点和如何提高病毒注射效率等方面探讨慢病毒显微注射技术的最佳方案。方法超速离心获得浓缩慢病毒,通过卵周隙显微注射技术感染小鼠受精卵,比较不同注射点显微注射后受精卵存活率及发育情况。结果受精卵1点和5点作为注射点的卵周隙注射组可有效避免注射针与卵膜的直接碰触,减少对受精卵的损伤,胚胎存活率较常规中轴3点作为注射点组显著提高(P<0.01)。适当的病毒滴度和注入量、操作细节、注射针口径等均可影响注射后受精卵存活率和感染率。结论卵周隙显微注射过程中选择适当的注射点以及部分操作的改进,可显著提高受精卵的存活率,为提高转基因小鼠模型的制备效率提供参考。

关键词：慢病毒载体卵周隙注射转基因鼠

来源：评论

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兔精子微注射受精研究:Ⅲ.精子获能对受精和发育的影响(简报)

引用

农业生物技术学报 1996年第3期 301-303页

作者：汪河海范必勤严忠慎丁家桐刘红林江苏省农科院畜牧兽医研究所南京农业大学动物科技学院南京210014

哺乳动物正常受精中,精子必须经过获能成熟的过程,才具受精能力,为探明精子获能在卵子受精及其发育中的生物学作用,需采用精子微注射受精的办法.本研究用兔作为精子微注射动物模型,旨在对这一问题进行探讨.1 材料和方法卵的收集和处理... 详细信息

哺乳动物正常受精中,精子必须经过获能成熟的过程,才具受精能力,为探明精子获能在卵子受精及其发育中的生物学作用,需采用精子微注射受精的办法.本研究用兔作为精子微注射动物模型,旨在对这一问题进行探讨.1 材料和方法卵的收集和处理见作者已发表的资料.精子的采集和制备,用假阴道法采集公兔精液,按常规的体外获能方法制备获能精子,用高渗NaCl溶液(0.5～1mol·L)处理(10～20min)或经低温(-20℃)反复冻融的办法制备死精子,处理后的精子与10%PVP盐溶液作1:2稀释,制成PVP—sperm悬液,用于精子导入.

关键词：精子获能受精能力卵子受精死精子受精率繁殖性能卵周隙注射微注射

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