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中华危重病急救医学 2022年第4期34卷 394-399页

作者：李一鸣徐冬雪张婧锁进猛姜军钱瑶瑶彭志勇武汉大学中南医院重症医学科重症医学国家临床重点专科湖北省重症医学临床医学研究中心武汉430071

目的探讨Toll样受体9(TLR9)信号通路激活对肾小管细胞转录组的影响。方法提取并培养小鼠原代肾小管上皮细胞,在细胞融合度达80%时分为两组,分别加入10μL磷酸盐缓冲液(PBS,PBS对照组)和终浓度为5μmol/L的TLR9激活剂胞嘧啶-鸟嘌呤寡脱... 详细信息

目的探讨Toll样受体9(TLR9)信号通路激活对肾小管细胞转录组的影响。方法提取并培养小鼠原代肾小管上皮细胞,在细胞融合度达80%时分为两组,分别加入10μL磷酸盐缓冲液(PBS,PBS对照组)和终浓度为5μmol/L的TLR9激活剂胞嘧啶-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸(CpG-ODN,CpG-ODN处理组)。提取细胞RNA后在Illumina平台进行测序,使用差异基因分析软件DEGseq分析两组细胞中基因的差异表达情况,通过Goatools和KOBAS在线软件分析差异基因所参与的信号通路,应用Homer软件预测转录因子。结果与PBS对照组相比,CpG-ODN处理后有584个显著的差异表达基因,其中102个基因表达上调,482个表达下调。差异表达基因富集最显著的基因本体(GO)为β-干扰素响应、病毒响应或防御等炎症反应相关条目;京都基因与基因组百科全书数据库(KEGG)信号通路富集结果显示,富集系数最显著的信号通路包括2’-5’-寡腺苷酸合成酶活性、核糖核酸酶活性的调节、病毒生命周期的负调控、β-干扰素响应和对原生动物的防御反应等。转录因子预测结果显示,干扰素调节因子3(IRF3)是差异基因启动子序列上富集最显著的转录因子;IRF3是TLR9下游表达差异最显著的转录因子,转录因子21(TCF21)、锌指蛋白135(ZNF135)和阳性调节域4(PRDM4)等转录因子可能是TLR9信号通路的新候选靶标。结论CpG-ODN激活TLR9信号通路,原代肾小管上皮细胞能直接响应CpG-ODN的刺激并发生转录组学变化,为进一步探究TLR9信号通路在脓毒症相关性急性肾损伤中的分子机制研究提供了基础。

关键词：原代肾小管上皮细胞胞嘧啶-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸脓毒症相关性急性肾损伤 Toll样受体9通路

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纤维网状细胞通过促进线粒体凋亡对脓毒症急性肾损伤改善作用的研究

引用

临床内科杂志 2022年第6期39卷 409-413页

作者：李一鸣王冰清胡畅王月锁进猛彭志勇武汉大学中南医院重症医学科武汉430071

目的探讨纤维网状细胞(FRC)通过促进线粒体凋亡对脓毒症急性肾损伤(AKI)的改善作用。方法取10~12周龄的C57BL/6雄性小鼠分别进行小鼠原代肾小管上皮细胞(TECs)及小鼠肠系膜脂肪组织来源的FRC的分离培养,采用流式细胞术鉴定FRC和原代TEC... 详细信息

目的探讨纤维网状细胞(FRC)通过促进线粒体凋亡对脓毒症急性肾损伤(AKI)的改善作用。方法取10~12周龄的C57BL/6雄性小鼠分别进行小鼠原代肾小管上皮细胞(TECs)及小鼠肠系膜脂肪组织来源的FRC的分离培养,采用流式细胞术鉴定FRC和原代TECs、免疫荧光检测TECs AQP1的表达、油红染色鉴定FRC的干细胞特性。将TECs分为NC组、LPS组与LPS-FRC组,采用流式细胞术检测3组TECs JC-1单体百分比、qRT-PCR检测炎症因子[白细胞介素(IL)-1和IL-6]mRNA表达水平、Western Blot检测自噬相关蛋白(Pink1、PARKIN)及氧化应激蛋白(HO-1)表达水平、CCK-8试剂盒检测TECs活力并进行比较。结果成功分离并鉴定FRC及小鼠原代TECs。LPS组IL-6、IL-1的mRNA表达水平和JC-1单体百分比均高于NC组及LPS-FRC组,LPS-FRC组IL-6、IL-1的mRNA表达水平均高于NC组(P<0.05)。LPS组OD值低于NC组,LPS-FRC组OD值高于LPS组(P<0.05)。和NC组比较,LPS组Pink 1、PARKIN、HO-1蛋白表达水平均增高;和LPS组相比,FRC-LPS组细胞Pink 1和PARKIN蛋白表达水平增加,HO-1蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论FRC可促进TECs的线粒体自噬,改善脓毒症AKI。

关键词：脓毒症急性肾损伤纤维网状细胞原代肾小管上皮细胞线粒体膜电位线粒体自噬

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BAFF/BAFF-R信号对小鼠肾小管上皮细胞的作用及机制初探

BAFF/BAFF-R信号对小鼠肾小管上皮细胞的作用及机制初探

引用

作者：宋丹苏州大学

学位级别：硕士

本项目组前期研究发现,肾移植受者发生抗体介导排斥反应时移植肾组织肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells,RTECs)异常高表达B细胞活化因子(B cell activating factor belong to the tumor necrosis factor family,BAFF)及其受体(BAFF receptor,BAFF-R)。系列研究结果提示BAFF/BAFF-R信号增强可能经RTECs参与肾移植抗体介导的慢性排斥反应过程。为进一步了解BAFF/BAFF-R在RTECs的表达及其意义,开展了本项研究。研究中以小鼠原代RTECs为研究对象,分析了BAFF信号对RTECs生长特性的影响及可能机制。第一部分目的:旨在建立获得纯度较高的小鼠原代RTECs分离、培养方法,为后续研究奠定基础。方法:选用40周龄的C57BL/6小鼠,取其肾皮质,以酶消化法结合筛网过滤法分离RTECs。选择含10%胎牛血清、1%双抗、1%胰岛素-转铁蛋白-硒-X和50nmol/L氢化可的松的DMEM/F12完全培养基用以细胞培养;细胞免疫荧光法检测上皮细胞特异性表达的细胞角蛋白18(cytokeratin-18,CK-18)及荧光素钠转运功能对RTECs进行鉴定。结果:融合成单层的RTECs衔接紧密,呈现出多边形鹅卵石样的典型形态,折光性好;免疫荧光检测结果显示细胞呈现黄绿色荧光,且阳性率在90%以上;荧光素钠转运实验结果显示随着时间延长胞内荧光强度逐渐增强,提示该细胞具有RTECs的离子转运功能。结论:本实验建立了简单、快速、重复性强且纯度较高的小鼠原代RTECs培养方法。第二部分目的:研究BAFF及其受体BAFF-R在小鼠原代RTECs的表达及BAFF/BAFF-R信号对RTECs生长特性的影响。方法:以500U/m L干扰素(interferon,IFN)-γ刺激小鼠原代RTECs,48h后流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测RTECs细胞膜上BAFF及BAFF受体(BAFF-R)的表达;以重组BAFF蛋白和/或阻断性B细胞活化因子受体-Fc融合蛋白(BAFF-R-Fc)刺激RTECs,48h后以荧光素钠转运实验检测RTECs离子转运功能、细胞免疫荧光法检测CK-18的表达、四唑氮化合物(MTS)法检测RTECs增殖情况、FCM法检测细胞凋亡情况。采用SPSS17.0软件对数据进行统计分析,P<0.05被认为差异具有统计意义。结果:小鼠RTECs经IFN-γ作用后,BAFF-R表达水平较未受IFN-γ刺激组显著上调(4166.250±913.914vs3602.750±875.584,P<0.05)。荧光素钠转运实验结果显示,BAFF刺激组的平均光密度为(0.011±0.003),显著低于BAFF-R-Fc+BAFF组(0.020±0.007)和对照组(0.016±0.006),差异均具有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光结果显示,BAFF刺激组平均光密度为(0.032±0.005),显著低于BAFF-R-Fc+BAFF组(0.043±0.007)和对照组(0.041±0.008),差异均具有统计学意义(P<0.05)。5ng/m L、20ng/m L BAFF刺激组细胞增殖OD值分别为(1.532±0.058)、(1.509±0.056)显著高于对照组(1.473±0.045),差异均具有统计学意义(P<0.05);且5ng/m L BAFF刺激组显著高于BAFF-R-Fc+BAFF组(1.477±0.050),差异具有统计学意义(P<0.05)。BAFF刺激组细胞凋亡率为(39.850%±8.544%),显著低于BAFF-R-Fc+BAFF组(42.950%±8.330%)和对照组(44.467%±7.642%),差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:BAFF/BAFF-R信号增强能促进RTECs增殖、抑制RTECs凋亡,但使其上皮细胞特性和离子转运功能显著下降。第三部分目的:研究BAFF信号增强对RTECs间质样转变的影响及可能机制。方法:以重组BAFF蛋白和/或阻断性BAFF-R-Fc刺激小鼠RTECs,48h后提取细胞全蛋白,Western blot法检测上皮标志蛋白E-钙粘蛋白(E-cadherin)、间质标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、β-链蛋白(β-catenin)及肽脯氨酰基顺反异构酶1(Pin1)的表达;Pin1si RNA瞬时转染小鼠RTECs,48h后RT-PCR检测Pin1m RNA的表达,72h后Western blot法检测Pin1蛋白的表达;以重组BAFF蛋白和/或阻断性BAFF-R-Fc刺激经Pin1si RNA或对照si RNA转

关键词：原代肾小管上皮细胞细胞免疫荧光荧光素钠转运 B细胞活化因子(BAFF) 肾小管上皮细胞(RTECs) 细胞角蛋白18(CK-18) 离子转运增殖凋亡 B细胞活化因子肾小管上皮细胞(RTEC) E-Cadherin α-SMA 肽脯氨酰基顺反异构酶1(Pin1)

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去乙酰化组蛋白酶1在马兜铃酸肾病发病机制中的作用研究

去乙酰化组蛋白酶1在马兜铃酸肾病发病机制中的作用研究

引用

作者：杨洋内蒙古农业大学

学位级别：博士

马兜铃酸肾病(Aristolochic Acid Nephropathy, AAN)指长期或过量使用含有马兜铃酸(Aristolochic Acid, AA)成分的中草药导致的肾小管间质病变。马兜铃酸Ⅰ(aristolochc acid I,AA I)是AA中含量最高、毒性最强的成分,可引起上皮细胞转... 详细信息

马兜铃酸肾病(Aristolochic Acid Nephropathy, AAN)指长期或过量使用含有马兜铃酸(Aristolochic Acid, AA)成分的中草药导致的肾小管间质病变。马兜铃酸Ⅰ(aristolochc acid I,AA I)是AA中含量最高、毒性最强的成分,可引起上皮细胞转分化为肌成纤维细胞、肾小管上皮细胞坏死或凋亡,触发肾间质纤维化。在纤维化过程中,上皮、内皮细胞间质转分化(EMT/EnMT)为肌成纤维细胞,被认为是在肾脏纤维化疾病的发病机制中发挥作用的重要因素之一。EMT的信号由各种生长因子／细胞因子集调节,其中转化生长因子-β(transforming growth factor-β)被认为是EMT产生肌成纤维细胞最有力的生长因素之一。通常认为与其相关的受体、Smads蛋白、辅助因子、转录调节的靶基因共同组成了一个TGF-p信号传导通路。Smads蛋白有三种亚型：受体激活Smads蛋白(R-Smad);共同介质型Smads蛋白(Co-Smad4);抑制型Smads蛋白(I-Smad6、7).其中I-Smads在蛋白降解方面以及对TGF-β信号的调节过程中发挥着重要的作用。乙酰化的Smad7可定向结合去乙酰化组蛋白酶1(histone deacetylases1, HDAC1)使其去乙酰化而进行泛素化作用促进蛋白的降解,当HDAC1过度表达并被转录因子募集时,就会导致与其相关的特定基因被非正常性抑制,从而导致疾病的产生。因此,阐明Smad7的去乙酰化作用在TGF-β/Smad7信号通路中对AAN的调控,了解分析HDAC1在AAN发病过程中的基因和蛋白表达以及蛋白定位,对于进一步揭示马兜铃酸肾病具有重要的意义。为此,本研究复制了小鼠AAN模型和小鼠原代RTECs细胞AAN模型,观察了AAⅠ所致小鼠AAN的病理学特征,研究了AAⅠ作用下小鼠RTECs肾纤维化中相关因子及TGF-β1/Smads信号通路分子相关基因及蛋白表达水平变化,分析了引起细胞纤维化的分子机制,探讨了在AAⅠ作用下小鼠肾间质纤维化的发病机理。其主要研究内容如下： AAⅠ对AAN和TGF-β1/Smads信号通路中相关因子的基因和蛋白表达的影响通过复制小鼠马兜铃酸肾纤维化(AAN)模型,检测肾组织中转化生长因子-p1(TGF-β1)、Smad7和去乙酰化蛋白酶1(HDAC1)的mRNA和蛋白,分析AAN模型TGF-β1信号通路中HADC1和Smad7蛋白的分布与表达变化。免疫组织化学检测CK-18、α-SMA的蛋白表达,定位HADC1和Smad7蛋白；HE染色观察肾脏的病理学变化；RT-PCR检测TGF-β1、Smad7和HDAC1的mRNA表达；ELASA检测TGF-β1的蛋白表达；Western Blot和免疫共沉淀检测HADC1和Smad7蛋白表达及相互作用。结果表明,免疫组化结果显示染毒组小鼠CK-18表达阴性,CK-18表达依次减弱趋势；SMA表达阳性,并随给药剂量逐渐增强。肾脏病理表现为肾小管浊肿、变性和肿(?)等急性小管间质损伤并随着染毒时间的延长而呈现逐渐加重的趋势。AAN模型肾组织中TGF-β1和HDAC1mRNA表达呈时间依赖性升高,TGF-β1mRNA表达较对照组具有显著性差异(P<0.05),TGF-β1蛋白从28d开始显著升高,且与对照组比较差异极显著(P<0.01)；Smad7mRNA和蛋白表达均呈下降趋势,且自35d开始校对照组有显著性的下降(P<0.05)；HDAC1mRNA和蛋白表达量随着时间的延长.增多,28d开始AAN组中HDAC1mRNA水平极显著高于对照组(P＜0.01)；HDAC1蛋白免疫组化染色强度呈上调趋势,且HDAC1阳性着色主要分布于上皮细胞和间质细胞的细胞核；免疫共沉淀试验结果证实,在AAN中HDAC1与Smad7形成蛋白复合物。结论为成功复制了小鼠AAN模型,证实AAⅠ对小鼠肾脏具有明显的损害作用,表现为早期肾间质纤维化,证实了肾小管上皮细胞是AAⅠ作用的主要靶细胞。AAⅠ对AAN的发展具有时间和剂量依赖型作用,TGF-β1/Smad7信号参与了AAⅠ诱导的EMT,Smad7是AAⅠ作用的靶点之一。HDAC1蛋白高表达并与Smad7蛋白形成蛋白复合物,参与了TGF-β/Smad信号通路介导的AAN形成过程。 AAⅠ对小鼠原代RTECs中TGF-β1/Smads信号通路中相关因子的影响通过构建小鼠原代RTECs的AAN模型,探讨AAⅠ对RTECs的作用及TGF-β1/Smads信号中相关因子的变化,阐明AAN的发病机制。培养小鼠原代RTECs细胞,通过细胞形态学观察和免疫荧光染色鉴定细胞；RealTime-PCR检测TGF-β1、 T

关键词：马兜铃酸肾病马兜铃酸Ⅰ 转化生长因子β Smad7 去乙酰化蛋白酶1 原代肾小管上皮细胞小干扰RNA

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