检索结果-内蒙古大学图书馆

家蝇丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin2的诱导表达条件优化及原核重组蛋白纯化

贵州农业科学 2025年第04期 66-72页

作者：王玮王丽国果修江帆尚小丽张昌容贵州省感染免疫与抗体工程特色实验室贵州医科大学基础医学院现代病原生物学特色实验室贵州省生物技术研究所

【目的】通过诱导表达获取大量纯化的家蝇丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin2重组蛋白，为后续深入分析模式昆虫家蝇的Serpin体内外免疫调节功能奠定基础。【方法】使用pET-28a(+)作为表达载体构建家蝇Serpin2的原核表达系统并导入到大肠杆菌（B... 详细信息

【目的】通过诱导表达获取大量纯化的家蝇丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin2重组蛋白，为后续深入分析模式昆虫家蝇的Serpin体内外免疫调节功能奠定基础。【方法】使用pET-28a(+)作为表达载体构建家蝇Serpin2的原核表达系统并导入到大肠杆菌（BL21）中，设置不同IPTG浓度、不同诱导温度和不同诱导时间以探索最佳诱导条件，在此条件下进行Serpin2原核重组蛋白大量诱导表达和纯化，并通过SDS-PAGE凝胶电泳和蛋白质谱对纯化的Serpin2重组蛋白进行鉴定。【结果】成功构建了pET28a(+)-Serpin2的重组质粒并转化至感受态细胞中，明确在30℃条件下以终浓度为0.2 mmol/L的IPTG诱导表达15 h，可使家蝇Serpin2重组蛋白在大肠杆菌BL21中获得较优表达，且在上清和包涵体内均有表达，经鉴定纯化后的蛋白即为家蝇Serpin2重组蛋白。【结论】最佳诱导条件（30℃、0.2 mmol/L IPTG、15 h）下可获得大量纯化的家蝇Serpin2重组蛋白。

关键词：家蝇丝氨酸蛋白酶抑制剂2 原核表达优化蛋白纯化重组质粒重组蛋白

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革胡子鲶GH成熟肽在大肠杆菌中表达条件的优化

引用

生物技术通报 2010年第10期26卷 182-184页

作者：杨学明何荆洲张立黄雄军郭亚芬蒋和生广西水产研究所南宁530021 广西大学动物科技学院南宁530005 贵港扬翔饲料有限公司贵港537100

将携带革胡子鲶(Clarias lazera)生长激素(GH)成熟肽cDNA序列的重组表达载体pRSET-mGH转化入大肠杆菌***21(DE3)pLysS中进行融合蛋白的表达。表达条件优化试验表明,表达菌株接种SOB培养基,培养2-3h后可用IPTG进行融合蛋白诱导表达;IPTG... 详细信息

将携带革胡子鲶(Clarias lazera)生长激素(GH)成熟肽cDNA序列的重组表达载体pRSET-mGH转化入大肠杆菌***21(DE3)pLysS中进行融合蛋白的表达。表达条件优化试验表明,表达菌株接种SOB培养基,培养2-3h后可用IPTG进行融合蛋白诱导表达;IPTG最佳诱导浓度为1.5 mmol/L,最佳诱导时间为4 h。本试验构建的原核表达体系为下一步革胡子鲶生长激素促生长制剂的研制奠定了基础。

关键词：革胡子鲶生长激素原核表达优化

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寡雄腐霉NLP功能及蛋白稳定性的初步研究

寡雄腐霉NLP功能及蛋白稳定性的初步研究

引用

作者：李佳露南京农业大学

学位级别：硕士

寡雄腐霉（Pythium oligandrum）属卵菌门（Oomycetes）腐霉属（Pythium）,是一种非致病卵菌,不仅可以能够定殖在多种重要农作物根系周围,具有诱导植物免疫和拮抗病原菌的作用,还可以重寄生土壤中多种病原真菌和卵菌,具有极大的生防价... 详细信息

寡雄腐霉（Pythium oligandrum）属卵菌门（Oomycetes）腐霉属（Pythium）,是一种非致病卵菌,不仅可以能够定殖在多种重要农作物根系周围,具有诱导植物免疫和拮抗病原菌的作用,还可以重寄生土壤中多种病原真菌和卵菌,具有极大的生防价值。因此,解析寡雄腐霉具体诱抗机制,有助于推进植物病害绿色防控进程。寡雄腐霉的MAMPs（microbe-associated molecular patterns）能诱导植物基础抗性的产生,从而提高抵抗外界病原菌侵染的能力。目前在寡雄腐霉中发现的可充当MAMPs激活免疫的有:oligandrins、D型细胞壁蛋白和NLP（Nep1-like proteins）。其中,NLP作为一类广泛分布在多种微生物中的胞外蛋白,已有研究证实其在植物病原微生物侵染和定殖过程中发挥着重要作用,但对于其在具有生防作用的寡雄腐霉中的功能仍然缺乏足够研究。前期研究发现,寡雄腐霉基因组编码的14个NLP（PyolNLP1～14）中,PyolNLP3～7可在本氏烟叶片上引起细胞坏死,并具有抑制疫霉菌侵染的能力。然而,PyolNLP诱导的植物免疫是否依赖于其诱导坏死活性还不清楚。此外,具有诱抗活性的寡雄腐霉NLP蛋白可作为一类潜在的免疫诱抗蛋白,为此本研究对其蛋白稳定性进行了一系列研究和评估。本研究主要取得的结果如下: PyolNLPs诱导细胞坏死的关键氨基酸位点鉴定:根据进化关系,PyolNLPs可分为4组,其中可诱导细胞坏死的PyolNLP3～7与不引起细胞坏死的PyolNLP8同属于Group 1,且进化关系较近。为了鉴定PyolNLPs中引起细胞坏死的关键氨基酸位点,本研究将PyolNLP3～7与PyolNLP8进行多序列比对,初步选出4个在PyolNLP3～7与PyolNLP8的差异氨基酸位点。同时,有报道显示果胶杆菌（Pectobacterium carotovorum）NLPPcc蛋白保守“GHRHDWE”序列中,D和E两个位点与诱导坏死活性相关。因此,本研究利用overlap-PCR法逐个将上述候选位点突变为A,获得相关突变序列后,将其在本氏烟中进行瞬时表达观察和统计突变序列引起细胞坏死的情况。结果显示,D和E的突变使PyolNLP3/5/6完全丧失诱导叶片坏死活性;使PyolNLP4/7丧失部分诱导坏死活性。G或F的突变,使PyolNLP3～7完全丧失诱导坏死活性。I的突变使PyolNLP3/5/6完全丧失诱导叶片坏死活性;但对PyolNLP4/7无影响。V/M的突变对PyolNLP3～7的诱导坏死活性均无影响。以上结果表明Group 1e亚组中PyolNLP3/5/6诱导坏死的关键位点是D、E、G、I和F;Group 1a中PyolNLP4/7诱导坏死的关键位点是G和F,相关位点是D和E。这说明Group 1中不同亚组的NLP引起细胞坏死的关键氨基酸位点与进化相关。 PyolNLP诱导坏死活性与其增强植物抗性能力的关联分析:前期发现PyolNLP5具有增强茄科植物对疫霉菌抗性的能力,而其保守的nlp24在其中是必需的。为进一步探究PyolNLP5诱导叶片坏死和诱导抗性间的关系,本研究将丧失了诱导烟草坏死的PyolNLP5和PyolNLP5在本氏烟叶片上进行瞬时表达,随后进行辣椒疫霉LT263和烟草疫霉025的接种实验,。结果显示,不引起细胞坏死的PyolNLP5D127A、PyolNLP5可抑制辣椒疫霉和烟草疫霉对烟草的侵染能力。进一步对相关序列在烟草叶片中HO的积累情况进行观察,发现PyolNLP5和PyolNLP5不会诱导叶片中HO的积累。上述研究表明,PyolNLP5增强植物对疫霉菌抗性的能力和其诱导坏死活性之间无关。寡雄腐霉诱抗蛋白稳定性的相关研究:除PyolNLP5和PyolNLP7外,实验室前期还从寡雄腐霉和缠器腐霉中筛选鉴定到了具有诱抗活性的POD8、PPOD2和PPOD3等elicitin-like家族的蛋白。为评估上述候选诱抗蛋白成为植物免疫诱抗剂的潜力,我们从原核表达体系的优化和在不同条件下的稳定性两方面开展研究。首先,本研究从诱导温度、诱导时间和诱导剂浓度三个条件入手,以上述候选诱抗蛋白以及前人报道的Oli-D2、POD1两个同属elicitin-like家族的诱抗蛋白为研究对象,对其原核表达条件进行了优化。通过考马斯亮蓝染色结果及蛋白条带的相对灰度值分析,发现在18℃、IPTG终浓度为0.1-0.2 m M、诱导14～18 h的诱导条件下,可获得较高的蛋白量。其次,我们研究了温度和p H条件对这7个重组蛋白稳定性的影响。本研究通过不同p H、温度处理,以其诱导叶片坏死的情况为指标进行研究。结果显示,Oli-D2、POD1、POD8、PPOD2和PPOD3

关键词：寡雄腐霉 NPP1-like家族原核表达优化蛋白稳定性

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