检索结果-内蒙古大学图书馆

中国预防兽医学报 2002年第6期24卷 474-476页

作者：张国中赵继勋中国农业大学实验动物研究所北京100094

以禽副粘病毒 2型 (Yucaipa株 )群特异性单抗 7E5为基础建立了检测PMV_2抗原的双抗体夹心elisa方法。该方法对Yucaipa病毒的最低检出量为 1.6 96 2 μg/ml,对PMV_2不同形式病毒及各分离株也都有很好的检出率。用Yucaipa病毒尿囊液人工感... 详细信息

以禽副粘病毒 2型 (Yucaipa株 )群特异性单抗 7E5为基础建立了检测PMV_2抗原的双抗体夹心elisa方法。该方法对Yucaipa病毒的最低检出量为 1.6 96 2 μg/ml,对PMV_2不同形式病毒及各分离株也都有很好的检出率。用Yucaipa病毒尿囊液人工感染 10日龄SPF鸡 ,于感染后不同时间采集心、肝、脾、肺、肾、法氏囊、气管等病科及泄殖腔拭子 ,经处理后用建立的方法进行检测 ,结果表明PMV_2病毒在感染鸡的法氏囊组织内大量存在 ,感染后 3天就可从法氏囊组织内检测到PMV_2病毒 ,粪便中仅个别有检出阳性者。

关键词：双抗体夹心elisa方法禽副粘病毒2型单克隆抗体抗原检测

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PRRSV-2纳米抗体的制备及双抗体夹心elisa方法的建立

PRRSV-2纳米抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立

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作者：孙悦中国农业科学院

学位级别：硕士

猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSvirus,PRRSV）引起的严重危害养猪业的重要传染病。由于PRRSV不断出现变异毒株，因此该病的检测显得尤为重要。纳米抗体（Nanob... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSvirus,PRRSV）引起的严重危害养猪业的重要传染病。由于PRRSV不断出现变异毒株，因此该病的检测显得尤为重要。纳米抗体（Nanobody,Nb）是骆驼科动物体内存在的一种轻链缺失抗体，是目前已知具有完整抗原识别功能的最小的抗体片段，其特异性强、稳定性高、易于基因改造、适合在原核和真核系统大量表达，目前已被用于人和动物疫病的诊断和治疗，具有广泛应用的前景。目前，纳米抗体在PRRSV检测中的应用鲜有报道。　　本研究利用凝胶层析方法纯化PRRSVHuN4株，获得了纯度较高的PRRSV，经多次免疫羊驼后，采集羊驼的外周血淋巴细胞并提取总RNA，经巢氏PCR扩增的纳米抗体编码基因片段，克隆到噬菌体载体pCANTAB5E，构建了PRRSV的纳米抗体文库，该文库容量为1.7×108PFU/mL。经过3轮淘选和elisa筛选得到92株候选的PRRSV纳米抗体。从中选择与PRRSV反应信号强、抗体氨基酸序列多样的13株纳米抗体，将其基因片段克隆到pET-24a载体进行原核表达，通过Ni-NTA亲和层析和凝胶层析纯化，获得较高纯度的纳米抗体。间接免疫荧光试验结果表明，这13株纳米抗体均可识别PRRSV。病毒中和试验结果显示，这13株纳米抗体均无中和活性。　　为建立PRRSV的纳米双抗体夹心elisa方法，本研究对这13株纳米抗体与PRRSV的结合力进行了探查，其中纳米抗体Nb12和Nb35对PRRSV特异性结合的能力较强。将纳米抗体Nb35进行原核表达纯化，作为捕获抗体;将Nb12与辣根过氧化物酶（Horseradishperoxidase,HRP）在HEK293T细胞中进行融合表达，Nb12-HRP融合蛋白作为检测抗体，经条件优化后建立了检测PRRSV抗原的双抗体夹心elisa方法。该方法可以检测出不同分支谱系的PRRSV-2毒株，与PRRSV-1及其他猪源病毒无交叉反应，表明该方法具有良好的PRRSV-2通用性和特异性。通过对临床样品的检测，初步显示出该方法具有良好的应用潜力。　　综上，本研究利用纯化的PRRSV-2免疫羊驼，构建了PRRSV-2的纳米抗体文库，并表达纯化了13株PRRSV-2的纳米抗体。在此基础上，建立了PRRSV-2的纳米双抗体夹心elisa方法，该方法可检测出不同分支谱系的PRRSV-2。本研究建立的双抗体夹心elisa方法可为PRRSV-2抗原检测与流行病学调查提供一种新的检测技术。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒双抗体夹心elisa方法纳米抗体流行病学

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H9亚型禽流感病毒双抗体夹心elisa方法的建立

H9亚型禽流感病毒双抗体夹心ELISA方法的建立

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第四届全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会

作者：亓文宝穆光慧罗开健焦培荣廖明农业部动物疫病防控重点开放实验室华南农业大学兽医学院广东广州510642

禽流感(AI)是由正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒(AIV)引起的一种禽类感染和/或疾病综合征。本文利用抗禽流感病毒H9亚型血凝素单克隆抗体和兔抗H9亚型AIV多克隆抗体，建立了双抗体夹心elisa方法，旨在为H9亚型禽流感病毒的临床检测提... 详细信息

禽流感(AI)是由正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒(AIV)引起的一种禽类感染和/或疾病综合征。本文利用抗禽流感病毒H9亚型血凝素单克隆抗体和兔抗H9亚型AIV多克隆抗体，建立了双抗体夹心elisa方法，旨在为H9亚型禽流感病毒的临床检测提供切实可行的方案。

关键词：禽流感病毒病毒感染免疫学检验抗体测定双抗体夹心elisa方法

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猪传染性胃肠炎病毒双抗体夹心elisa检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2013年第5期35卷 364-368页

作者：屈月葛俊伟唐丽杰乔薪瑗姜艳平尹光昕李一经东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的快速检测方法,本研究以抗TGEV N蛋白单克隆抗体(MAb)为包被抗体,纯化的抗TGEV N蛋白多克隆抗体(PcAb)为检测抗体建立了TGEV双抗体夹心elisa方法,优化其反应条件为:抗TGEV N蛋白MAb包被浓度为0.4μg/mL,... 详细信息

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的快速检测方法,本研究以抗TGEV N蛋白单克隆抗体(MAb)为包被抗体,纯化的抗TGEV N蛋白多克隆抗体(PcAb)为检测抗体建立了TGEV双抗体夹心elisa方法,优化其反应条件为:抗TGEV N蛋白MAb包被浓度为0.4μg/mL,抗TGEV N蛋白PcAb和酶标二抗的工作浓度分别为3.5μg/mL和1∶5 000,以P/N>2,同时OD490nm≥0.316作为阳性判定标准。该elisa的重复性变异系数小于10%,与猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪轮状病毒等无交叉反应。对22份临床猪粪便样品RT-PCR的阳性检出率为31.8%;elisa的阳性检出率为22.7%,二者符合率达81.8%,结果表明本研究建立的双抗体夹心elisa方法检测TGEV具有较高的特异性和敏感性,可以用于TGEV的病原学检测。

关键词：猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体高免血清双抗体夹心elisa方法

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A型塞内卡病毒单克隆抗体的制备及双抗体夹心elisa检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2024年第10期46卷 1034-1042页

作者：周函蓉苏世博孙明霞蒙靓杨巍史鑫琪李鑫安同庆蔡雪辉王海伟孟凡丹中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室黑龙江哈尔滨150069 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所黑龙江省兽用生物药物工程技术研究中心黑龙江哈尔滨150069 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所黑龙江省免疫学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为建立一种快速检测A型塞内卡病毒(SVA)的方法,本研究利用氯化铯密度梯度离心法纯化的SVA粒子免疫BALB/c小鼠3次,采用杂交瘤技术制备SVA单克隆抗体(MAb)。结果显示,共获得7株能够稳定分泌SVA MAb的杂交瘤细胞株。采用过碘酸钠法将其中5... 详细信息

为建立一种快速检测A型塞内卡病毒(SVA)的方法,本研究利用氯化铯密度梯度离心法纯化的SVA粒子免疫BALB/c小鼠3次,采用杂交瘤技术制备SVA单克隆抗体(MAb)。结果显示,共获得7株能够稳定分泌SVA MAb的杂交瘤细胞株。采用过碘酸钠法将其中5株MAb标记HRP(MAb-HRP),并采用elisa法检测标记效果。将7株MAb与5株MAb-HRP两两组合进行抗体配对试验。结果显示,5株MAb均标记上HRP,且其中各稀释度标记的MAb 2C8-HRP的反应性均最强;当MAb 2G7作为捕获抗体,MAb 2C8-HRP作为检测抗体时,P/N值最大,表明这两种MAb的配对效果最好。在此基础上,通过优化各反应条件初步建立检测SVA的双抗体夹心elisa(DAS-elisa)方法。利用建立的DAS-elisa方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、O型和A型口蹄疫病毒和SVA,结果显示,该方法仅能检测SVA,其他常见的猪源病毒均为阴性结果,表明该方法特异性强。利用本研究建立的DAS-elisa方法分别检测系列稀释的SVA上清液(1~1:80000,对应的病毒滴度分别为107.5TCID50/mL~1.25×10^(2.5)TCID_(50)/mL)和2倍倍比稀释的SVA猪阳性猪血清(1:2~1:256),同时采用猪塞内卡病毒抗原(SVA-Ag)elisa试剂盒分别检测上述SVA上清液和SVA猪阳性血清,评估本研究建立DAS-elisa方法的敏感性。结果显示SVA稀释40000倍后,其OD450nm值仍大于临界值0.115,即该方法对SVA上清液的检测限为2.5×10^(2.5)TCID_(50)/mL,且1:64倍稀释的SVA猪阳性血清样品仍为阳性;(SVA-Ag)elisa结果显示,该方法检测的SVA最大稀释度为1:20000,即对SVA上清液的检测限为5×10^(2.5)TCID_(50)/mL,且仅能检测到稀释至32倍的SVA猪阳性血清,均低于本实验建立的DAS-elisa方法,表明该方法敏感性高。对4份SVA猪阳性血清和1份SVA猪阴性血清采用DAS-elisa方法进行批内和批间重复性试验,结果显示批间和批内重复性试验的变异系数均在10%以下,重复性较好。对采集的205份疑似SVA感染的猪扁桃体组织、鼻咽拭子及血清样品分别采用DAS-elisa及RT-PCR方法检测。DAS-elisa的检测结果显示,36份样品为阳性,169份样品为阴性;RT-PCR检测结果显示,50份样品为阳性,155份样品为阴性。经计算两种方法的阳性符合率为72%(36/50),总符合率为93%(191/205)。以上结果表明,本研究建立的DAS-elisa适用于大规模多种临床样品的检测,为SVA的检测及流行病学调查提供技术支撑。

关键词： A型塞内卡病毒单克隆抗体双抗体夹心elisa方法

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耐药蛋白NDM-1的双抗体夹心elisa检测方法研究

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畜牧与兽医 2021年第12期53卷 76-84页

作者：贾良曦杨柳丁亚芳邢维维马立才北京维德维康生物技术有限公司北京100095

旨在建立一种检测细菌中新德里金属β-内酰胺酶(NDM)耐药蛋白双抗体夹心elisa方法。采用化学合成的方法获得优化后的NDM-1蛋白基因序列,构建表达载体pET-28a-NDM-1(G29-R270),并在大肠杆菌中进行IPTG诱导表达,用SDS-PAGE和Western blot... 详细信息

旨在建立一种检测细菌中新德里金属β-内酰胺酶(NDM)耐药蛋白双抗体夹心elisa方法。采用化学合成的方法获得优化后的NDM-1蛋白基因序列,构建表达载体pET-28a-NDM-1(G29-R270),并在大肠杆菌中进行IPTG诱导表达,用SDS-PAGE和Western blot验证重组蛋白。以纯化的NDM-1蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,获得了2株杂交瘤细胞株,分别命名为3H5和4G1,分别作为捕获抗体和检测抗体,通过对包被条件、包被抗体和检测抗体浓度等进行优化,建立双抗体夹心elisa方法,并对所建立方法的敏感性、特异性等进行了评价。结果表明,经15℃条件下诱导16 h后,SDS-PAGE和Western blot显示目的条带清晰,大小正确。经优化后的双抗体夹心elisa方法中,捕获抗体和检测抗体的稀释度分别为1∶2 000和1∶5 000,使用0.05 mol/L碳酸盐缓冲液(pH值9.6),4℃过夜包被。该方法对NDM-1阳性大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的最低检出浓度为1×10^(5)CFU/mL,NDM-1阳性鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的最低检出浓度为1×10^(6)CFU/mL。该方法检测NDM-1、NDM-4、NDM-5和NDM-9,与4种阳性对照菌有明显的交叉,但与大肠杆菌ATCC 25922、大肠杆菌ATCC 35150、鲍曼不动杆菌ATCC 19606、肺炎克雷伯菌ATCC 10031和铜绿假单胞菌ATCC 9027均无交叉反应。板内变异系数小于6%,板间变异系数小于10%,说明本方法具有良好的重复性。综上所述,本研究建立了一种高特异性和高灵敏的双抗体夹心elisa方法,为耐碳青霉烯类细菌中NDM-1耐药蛋白检测提供了一种技术手段。

关键词：新德里金属β-内酰胺酶-1 单克隆抗体双抗体夹心elisa方法

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宿迁地区一株鸡星状病毒的分离及双抗体夹心检测抗原elisa方法的建立

宿迁地区一株鸡星状病毒的分离及双抗体夹心检测抗原ELISA方法的...

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作者：钱昊天扬州大学

学位级别：硕士

星状病毒（Astroviruses,AstV）于1975年首次在患有腹泻的儿童粪便中检测出,此后在多种动物体内都有发现,是一种广泛存在的肠道病原体。目前星状病毒分为两个属,分别是哺乳动物星状病毒属（Mamastrovirus,MAstV）和禽星状病毒属（Avastr... 详细信息

星状病毒（Astroviruses,AstV）于1975年首次在患有腹泻的儿童粪便中检测出,此后在多种动物体内都有发现,是一种广泛存在的肠道病原体。目前星状病毒分为两个属,分别是哺乳动物星状病毒属（Mamastrovirus,MAstV）和禽星状病毒属（Avastrovirus,AAstV）。鸡星状病毒（Chicken Astrovirus,CAstV）属于禽星状病毒属,CAstV的感染可导致生长发育迟缓综合征（RSS）、病毒性腹泻、白雏鸡综合征（WCS）、严重的肾脏疾病和内脏痛风等症状。关于CAstV感染的报道在全世界都有,近几年中国的报道日益增多。由于CAstV在外界环境中十分稳定,可以保持相当长时间的感染性,其既可以水平传播又可以垂直传播,因此给该疫病的防控带来较大的困难。本研究为了监测CAstV在江苏宿迁鸡群中的流行和进化情况,从宿迁地区送检的1日龄雏鸡盲肠组织中成功分离出一株B亚群鸡星状病毒,命名为CAstV/SQ2201,空斑纯化后对其进行了全基因序列测序分析、生物信息学预测及致病性研究。同时制备获得了3株抗B亚群鸡星状病毒衣壳蛋白的单克隆抗体,对其进行了生物学特性鉴定。并应用2株单克隆抗体建立了双抗体夹心elisa检测B亚群鸡星状病毒抗原的方法,为CAstV的诊断防控提供了一种高通量、简便的抗原检测方法。 1.宿迁地区一株鸡星状病毒的分离本研究从宿迁某地区孵化场采集了35份1日龄雏鸡盲肠病料,提取组织RNA后进行RT-PCR检测。检测结果显示共有27份样本呈阳性,总阳性率为77.14%。将阳性组织匀浆进行无菌处理后,卵黄囊接种5日龄SPF鸡胚,连续传代后,取全胚胎混合物匀浆再接种LMH细胞,经细胞传代后,成功分离出一株鸡星状病毒,命名为CAstV/SQ2201。随后对其进行空斑纯化以及其他常见家禽病毒检测,得到一株无其他禽源病毒污染的CAstV分离纯化株,滴度为TCID50=6.31×10～5/0.1mL。遗传进化和生物信息学分析,结果显示CAstV/SQ2201与国内其他分离株同源性较高,与本实验室前期分离的毒株同源性在96.7%以上。按照不同的分类原则进行分类CAstV/SQ2201属于鸡星状病毒Ⅱ型和B亚群鸡星状病毒。本研究进行的病毒分离鉴定与遗传进化和生物信息学分析,为完善中国地区鸡星状病毒流行病学研究提供了数据。 2.三株鸡星状病毒的致病性研究本研究将本实验室保存的3株B亚群CAstV分离纯化株CAstV/NJ1701、CAstV/HA2101和CAstV/SQ2201通过口服和腹腔接种途径注射1日龄SPF雏鸡,每日观察其精神状态和生长发育情况,并分别在攻毒后1、3、7、14、21和28天进行称量体重和剖检采样。通过体重变化,排毒量、组织病毒载量、血清抗体效价,来评价不同分离株的致病性。结果显示,3株鸡星状病毒分离株均无明显的致病性,攻毒组与对照组的体重也无明显差异,仅仅在不同毒株攻毒组的排毒情况和组织病毒载量中有一定差异,具体表现为在攻毒后第3天排毒量最高,在攻毒后第7天时,排毒量都呈下降趋势,并且3个攻毒组的排毒量相差不大,攻毒后第14天以后,CAstV/NJ1701组和CAstV/SQ2201组的排毒量降至极低水平,但CAstV/HA2101组在攻毒后第14天时排毒量略有升高,然后在第21天后才降至与其他两个攻毒组的水平;NJ1701组在攻毒后第1天时,肝脏中的病毒载量较高,攻毒后第3-7天,肾脏中的病毒载量最高,攻毒后第14天以后,各组织器官中病毒载量都很低;CAstV/SQ2201组在攻毒后第1天时,只有在脾脏中有少量病毒分布;在攻毒后第3-7天,肾脏中的病毒载量呈上升趋势,攻毒后第14天以后,各组织器官中几乎检测不到病毒;CAstV/HA2101组在攻毒后第1天,脾脏中病毒载量最高,攻毒后第7天肾脏和腺胃的病毒载量均升高,第14天以后,病毒只有在腺胃中还有一定的分布。3个不同毒株攻毒组的血清抗体效价都在攻毒后14天左右开始升高,并在21天左右达到高峰,然后下降。3个不同毒株攻毒组的雏鸡经剖检观察,都没有肉眼可见的病变。 3.鸡星状病毒单克隆抗体的制备及双抗体夹心elisa方法建立本研究以表达重组蛋白Bacmid-CAstV-Cap杆状病毒感染的Sf9细胞作为免疫原,获得了3株针对鸡星状病毒Cap蛋白、并可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为CAstV-Cap-6A12、CAstV-Cap-6D12和CAstV-Cap-5G4,对制备的3株单克隆抗体进行生物学特性鉴定,发现3株单克隆抗体亚类均为Ig G,轻链都为Kappa链,与天然CAstV都具有IFA反应性,但只有5G4与天然CAstV具有Western Blot反应性;3株单克隆抗体都没有中和活性;3株单克隆

关键词：鸡星状病毒病毒分离与纯化致病性实验单克隆抗体双抗体夹心elisa方法

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小鼠肝炎病毒双抗体夹心elisa检测方法的建立

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实验动物与比较医学 2015年第1期35卷 6-9,36页

作者：周洁高诚胡建华上海实验动物研究中心上海201203

目的建立小鼠肝炎病毒（MHV）双抗体夹心elisa检测方法。方法将4株特异性抗MHVN蛋白的单克隆抗体进行抗体配对试验确定3D4H9为捕获抗体，以辣根过氧化物酶（HRP）标记的4G9F2为检测抗体；通过方阵试验确定了3D4H9和4G9F2-HRP的最佳工作... 详细信息

目的建立小鼠肝炎病毒（MHV）双抗体夹心elisa检测方法。方法将4株特异性抗MHVN蛋白的单克隆抗体进行抗体配对试验确定3D4H9为捕获抗体，以辣根过氧化物酶（HRP）标记的4G9F2为检测抗体；通过方阵试验确定了3D4H9和4G9F2-HRP的最佳工作浓度分别为12．8ng／mL和70．84ng／mL，以P／N〉2，同时D450nm≥0．248作为阳性临界值的判定。结果该elisa方法重复性变异系数小于10％，与小鼠细小病毒、仙台病毒、小鼠肺炎病毒、呼肠孤病毒3型等无交叉反应，对358份血清样品进行检测，与美国EBI公司的间接elisa试剂盒检测结果无明显差异。结论本研究建立的双抗体夹心elisa方法检测MHV具有较高的特异性和敏感性，可以用于MHV的病原学检测。

关键词：小鼠肝炎病毒(MHV) 单克隆抗体双抗体夹心elisa方法

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PCT单克隆抗体的制备及其elisa检测方法的初步建立

PCT单克隆抗体的制备及其ELISA检测方法的初步建立

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作者：胡俊峰河南工业大学

学位级别：硕士

目的:降钙素原(PCT)是一种在感染的情况下由细菌、寄生虫和真菌感染等感染诱导刺激产生释放的一种蛋白质。在健康状态下,PCT的含量处于较低的水平(2 ng/mL)。目前PCT检测在临床中得到了广泛应用,相关检测方法和产品不断涌现。但PCT检测... 详细信息

目的:降钙素原(PCT)是一种在感染的情况下由细菌、寄生虫和真菌感染等感染诱导刺激产生释放的一种蛋白质。在健康状态下,PCT的含量处于较低的水平(<0.1 ng/mL),但是在细菌感染、脓毒症、败血症等情况下PCT水平显著升高(>2 ng/mL)。目前PCT检测在临床中得到了广泛应用,相关检测方法和产品不断涌现。但PCT检测试剂的核心成分-PCT抗体国内一直未解决,国内PCT酶联免疫检测方法的研究尚处于起步阶段。制备可用于临床的单克隆抗体和建立PCT酶联免疫检测方法是目前研究的热点。本实验旨在利用单克隆抗体制备技术,制备符合临床使用要求的PCT单克隆抗体,并用其建立PCT酶联免疫定量检测方法,为临床判别细菌性感染疾病和抗生素合理应用提供一种有效的方法和应用指导。方法:用his-hrPCT抗原作为免疫原免疫BaLb/c小鼠,间接elisa法检测免疫效价。采用免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合制备杂交瘤细胞,利用trx-hrPCT蛋白作为包被抗体,HRP-抗鼠IgG作为酶标抗体,通过间接elisa法筛选阳性细胞株,并通过有限稀释法筛选、获得稳定的单克隆抗体细胞株,从而制备单克隆抗体。采用双抗体夹心法筛选获得配对的PCT单抗,通过对其包被液及包被条件选择、封闭液及封闭条件选择、最佳包被抗体浓度和酶标抗体浓度确定、最佳反应时间、线性范围、批内精密性、回收率、稳定性、灵敏度及特异性、干扰因素、临床标本检测等研究,建立PCT酶联免疫双抗体夹心法的检测方法。结果:当小鼠免疫效价达到1:105后,以脾细胞与骨髓瘤细胞进行3次细胞融合,筛选得到10株阳性细胞株,通过有限稀释法3次克隆化最终获得4株阳性细胞株,分别命名为F1D5,F2H3,F3B7,F3D2。注射腹腔制备腹水,间接elisa检测效价均达到3.2×105,以辛酸-硫酸铵法纯化抗体。标记抗体,获得一组(F1D5、F3B7)配对单抗,并以此为基础研究确定PCT双抗体夹心elisa检测的相关条件:包被液及包被条件为0.05 mol/L、pH 9.6的CB缓冲液4℃包被12 h;封闭液及封闭条件为0.6%BSA 37℃封闭2 h;最佳包被抗体F1D5浓度为400 ng/mL,酶标抗体F3B7浓度为1:8000;37℃孵育30 min,酶标二抗孵育30 min,显色20 min的反应模式。建立的检测方法线性范围为0.5 ng/mL-10ng/mL(R2=0.9912);批内精密性小于10%;高中低值平均回收率分别为99.00%、98.68%、108.69%;稳定性检测显示:37℃可稳定保存9天;灵敏度为95.6%,特异性为97.8%;PCT阴性及阳性干扰物质对本实验结果无明显干扰;与罗氏检测试剂盒对比检测200份临床血清,显示相关性良好(R2=0.9391)。结论:获得一组配对的PCT单克隆抗体,并初步建立了双抗体夹心elisa检测PCT的定量检测方法。

关键词： PCT 单克隆抗体双抗体夹心elisa方法细菌感染

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不同G型轮状病毒VP7蛋白表达及抗体制备和应用

不同G型轮状病毒VP7蛋白表达及抗体制备和应用

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作者：赵颖甘肃中医药大学

学位级别：硕士

目的:表达和纯化人A组轮状病毒不同G型VP7蛋白;制备VP7型别特异的单克隆抗体并进行抗体功能鉴定及初步应用,为下一步不同G型轮状病毒特异检测方法的建立奠定基础,对不同G型多价轮状病毒疫苗的开发和评价具有重要意义。方法:利用昆虫杆... 详细信息

目的:表达和纯化人A组轮状病毒不同G型VP7蛋白;制备VP7型别特异的单克隆抗体并进行抗体功能鉴定及初步应用,为下一步不同G型轮状病毒特异检测方法的建立奠定基础,对不同G型多价轮状病毒疫苗的开发和评价具有重要意义。方法:利用昆虫杆状病毒表达载体系统表达不同G型VP7蛋白,分别尝试了VP7全长序列(1—326位氨基酸)及78—311位氨基酸截短体蛋白表达;通过镍柱亲和层析及凝胶过滤层析进行蛋白纯化;SDS-PAGE及蛋白免疫印迹(Western blot,WB)进行蛋白表达验证。将纯化后的不同G型可溶VP7蛋白作为免疫原,免疫BALB/c雌性小鼠,利用杂交瘤细胞技术得到能够产生特异性抗体的杂交瘤细胞;通过包被纯化后的不同G型VP7蛋白及轮状病毒进行间接elisa法检测,包被VP7多抗进行双抗体夹心elisa检测,进行杂交瘤细胞株的筛选。选定的杂交瘤细胞株体外培养后注入小鼠腹腔获取腹水,借助Protein G HP柱从腹水中纯化单克隆抗体;通过间接elisa法检测腹水效价,以及纯化后抗体与VP7蛋白结合的EC50值;WB鉴定单克隆抗体与不同G型VP7蛋白的结合情况;通过间接免疫荧光试验(Immunofluorescence assay,IFA)检测单克隆抗体与不同基因型轮状病毒的结合情况。将纯化后的单克隆抗体作HRP标记,根据棋盘格法进行抗体配对,通过双抗体夹心elisa进行不同G型轮状病毒或VP7蛋白的检测。结果:利用杆状病毒表达系统成功获得人A组轮状病毒G1、G2、G3、G4、G8、G9 VP7蛋白,蛋白表达量较高、以可溶蛋白形式存在、纯度较好。利用杂交瘤细胞株筛选得到8株单抗:1C3与10F6两株广谱单抗,6G1与6G2两株G1特异单抗,2A11与14F12两株G4和G8特异单抗,18C1与18E8两株G8特异单抗。经抗体亚型鉴定,8株单抗均为Ig G型。测定单抗与相应VP7蛋白结合的EC50值,多株单抗具有较低的EC50值。WB实验结果显示:1C3单抗广谱地结合不同G型VP7蛋白,10F6单抗只与G8 VP7蛋白结合比较突出,6G1及6G2单抗特异结合G1 VP7蛋白;2A11、14F12、18C1、18E8这4株单抗都与G8 VP7有明显的结合,2A11、14F22单抗与G4 VP7蛋白有弱的结合条带;条带大小均与SDS-PAGE目的条带位置对应。间接免疫荧光试验结果显示:单克隆抗体1C3明显结合G1/G2/G3/G8/G9型A组轮状病毒,10F6单抗也可以结合不同型别的轮状病毒,但是荧光强度没有1C3清晰。单克隆抗体6G1可以结合不同A组轮状病毒;6G2单抗只识别G1型轮状病毒。单克隆抗体2A11结合A组轮状病毒WHG1(基因型G1P[3])、SA11(基因型G3P[2])、G8P[8]株、G9P[8]株;14F12及18E8单抗均与WHG1、SA11、G8P[8]株轮状病毒结合明显;18C1单抗与SA11、G8P[8]株轮状病毒结合明显。结论:本研究通过昆虫杆状病毒表达系统成功表达了G1、G2、G3、G4、G8、G9不同基因型的轮状病毒VP7可溶蛋白,蛋白表达量较高、纯度较好,且实验证明VP7蛋白具有三聚体结构。成功制备了2株可以广谱结合不同G型轮状病毒VP7的单克隆抗体(1C3和10F6),2株G1 VP7特异的单抗(6G1和6G2),2株G4和G8 VP7特异的单抗(2A11和14F12),2株G8 VP7特异单抗(18C1和18E8),通过elisa、WB、IFA鉴定,证明8株单抗与相应VP7蛋白具有良好的结合活性。双抗体夹心elisa方法初步应用得到特异检测G1和G8型RV VP7的抗体配对方案。

关键词：轮状病毒 VP7蛋白单克隆抗体双抗体夹心elisa方法

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