检索结果-内蒙古大学图书馆

生物化学与生物物理学报 2002年第6期34卷 763-768页

作者：董文吉祖振响刘德培郝德龙郭志晨梁植权中国医学科学院基础医学研究所中国协和医科大学基础医学院医学分子生物学国家重点实验室中国医学科学院基础医学研究所中国协和医科大学基础医学院医学分子生物学国家重点实验室北京100005

以人 β 珠蛋白基因簇基因座控制区DNaseI高敏位点 2和高敏位点 3组合的微小基因座控制区作为调控元件 ,以 374bp第二内含子部分缺失的 2 .0kbβ 珠蛋白基因作为结构基因的反转录病毒重组体 ,通过建立 ψ 2产病毒细胞系和瞬时转染双向... 详细信息

以人 β 珠蛋白基因簇基因座控制区DNaseI高敏位点 2和高敏位点 3组合的微小基因座控制区作为调控元件 ,以 374bp第二内含子部分缺失的 2 .0kbβ 珠蛋白基因作为结构基因的反转录病毒重组体 ,通过建立 ψ 2产病毒细胞系和瞬时转染双向性包装细胞系 ψ A两种方法获得重组病毒。感染鼠红白血病细胞后 ,Southern杂交鉴定前病毒整合完整性 ,用RNase保护实验检测人 β 珠蛋白基因的表达 ,通过PCR产物测序确定前病毒结构。结果表明 ,在瞬时转染 ψ A来源的重组病毒转导和质粒转染的鼠红白血病细胞中 ,人 β 珠蛋白基因的表达水平分别达到内源性鼠α 基因表达的 (5 2 .4± 11.2 ) % (n =12 )和 (73.8± 14 .3) % (n =12 ,未确定整合拷贝数 ) ;而在 ψ 2产病毒细胞系来源的病毒转导的细胞中 ,表达水平低于 3% ,前病毒序列分析发现其高敏位点 2中出现一个点突变 ,这可能是人β 珠蛋白基因呈低水平表达的一个原因。

关键词： β-地中海贫血基因治疗反转录病毒载体位置效应 RNA干扰

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反转录病毒载体介导含增强子的人β－珠蛋白基因在小鼠胎肝细胞中的表达

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中国医学科学院学报 1996年第4期18卷 246-251页

作者：王宏伟章静波徐炎韦启泽刘世广陶吉中刘德培中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所

将人β－珠蛋白基因（３．１ｋｂ）反向克隆入反转录病毒载体Ｎ２Ａ，并在Ｎ２Ａ的ＬＴＲ插入３６ｂｐ的增强子ＨＳ２（简称Ｎ２Ａ．β．Ｅ３６）。将此反转录病毒重组体转染ψ－２和ＰＡ３１７包装细胞系，经Ｇ４１８筛选后，分离出完... 详细信息

将人β－珠蛋白基因（３．１ｋｂ）反向克隆入反转录病毒载体Ｎ２Ａ，并在Ｎ２Ａ的ＬＴＲ插入３６ｂｐ的增强子ＨＳ２（简称Ｎ２Ａ．β．Ｅ３６）。将此反转录病毒重组体转染ψ－２和ＰＡ３１７包装细胞系，经Ｇ４１８筛选后，分离出完整整合的并能产生较高病毒滴度的产病毒细胞系。利用产病毒细胞系，将含增强子人β－珠蛋白基因转入小鼠胎肝细胞，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交表明人β－珠蛋白基因可以完整地整合到靶细胞的基因组上，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交显示人β－珠蛋白基因可在小鼠胎肝细胞中表达。

关键词：反转录病毒载体 β-珠蛋白基因基因治疗

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反转录病毒载体转染小鼠骨髓细胞

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中国组织工程研究与临床康复 2011年第40期15卷 7437-7440页

作者：王存邦白海葸瑞张茜周进茂赵强潘耀柱解放军兰州军区总医院血液科甘肃省兰州市730050

背景:为方便、准确检测外源细胞在体内的存活情况,需在外源细胞转移标记基因。目的:观察多种细胞因子联合刺激下反转录病毒载体对BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞基因转移效率的影响。方法:以PA317-GCGPXSN细胞制备病毒上清,NIH3T3... 详细信息

背景:为方便、准确检测外源细胞在体内的存活情况,需在外源细胞转移标记基因。目的:观察多种细胞因子联合刺激下反转录病毒载体对BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞基因转移效率的影响。方法:以PA317-GCGPXSN细胞制备病毒上清,NIH3T3细胞测定病毒滴度后,取经过干细胞因子、白细胞介素3、白细胞介素6预培养刺激后的BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞,实验组实施基因转移,流式细胞仪及PCR方法测定基因转移效率。阴性对照组不做基因转移。阳性对照组为PA317-GCGPXSN细胞株。结果与结论:①病毒滴度为1.9×108CFU/L。②对照组 BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞测定的荧光强度数值为0.63%,实验组为76.04%,两组相比差异有显著性意义(P<0.01)。PCR方法扩增到了NeoR基因的特异性片断,结果证实细胞因子预刺激后实施基因转移,可有效地将外源基因转移进入BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞基因组中。

关键词：小鼠骨髓细胞细胞因子反转录病毒载体基因转移绿色荧光蛋白 NeoR基因

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反转录病毒载体介导RNA干扰抑制EphA2在Hela细胞中的蛋白表达

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中国组织工程研究与临床康复 2007年第37期11卷 7401-7404页

作者：吴丹李珊珊索振河上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院上海市200030 郑州大学第一附属医院病理科河南省郑州市450052 威奥斯陆大学附属肿瘤医院癌症研究中心

目的:课题前期发现EphA2和配体EphrinAl在宫颈鳞癌细胞和肿瘤相关血管内皮细胞均呈高表达,为基因治疗宫颈癌提供了理想的靶向。以此为基础,利用反转录病毒载体介导的RNA干扰抑制EphA2在Hela宫颈癌细胞中的蛋白表达。方法:实验于2006-01... 详细信息

目的:课题前期发现EphA2和配体EphrinAl在宫颈鳞癌细胞和肿瘤相关血管内皮细胞均呈高表达,为基因治疗宫颈癌提供了理想的靶向。以此为基础,利用反转录病毒载体介导的RNA干扰抑制EphA2在Hela宫颈癌细胞中的蛋白表达。方法:实验于2006-01/06在河南省肿瘤病理重点实验室完成。①实验材料:PA317细胞、Hela229细胞购自上海生化细胞所,小鼠NIH3T3细胞为本室保存。EphA2兔抗人多克隆抗体,Actin兔抗人多克隆抗体(美国SantaCruz公司)。②实验方法:从EphA2的mRNA全序列中筛选出1个19nt的靶序列,设计双链发夹结构。以siRNA互补双链寡核苷酸,构建反转录病毒表达载体pSIREN-EphA2,提取质粒,用BglⅡ和EcoRⅠ双酶切进行鉴定。选择经酶切鉴定的正确克隆测序。挑选pSIREN-EphA2抗性克隆细胞扩增,检测转染后Hela细胞中EphA2蛋白的表达水平。结果:①pSIREN-EphA2重组质粒的酶切鉴定:双酶切后形成328bp和6182bp两条电泳条带。②pSIREN-EphA2重组质粒测序:结果与已知序列完全一致。③EphA2蛋白的表达:经Westernblot分析,重组pSIREN-EphA2转染的Hela细胞中EphA2蛋白表达水平明显降低。结论:通过反转录病毒载体介导的RNA干扰,能够抑制EphA2在Hela细胞中的蛋白表达,为以EphA2为靶点的宫颈癌基因治疗提供新的思路和手段。

关键词： EphA2 反转录病毒载体 RNA干扰

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反转录病毒载体介导的EGFP基因在SK-N-SH神经母细胞瘤细胞中的表达

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西安交通大学学报（医学版） 2007年第1期28卷 10-13页

作者：刘朝晖杨宇庄鹏辉许杰华马延兵胡海涛西安交通大学医学院人体解剖与组织胚胎学系陕西西安710061 吉林大学第一医院神经内科吉林长春130021 西安交通大学医学院第一附属医院胸外科陕西西安710061

目的构建携带报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的反转录病毒载体,并且探讨病毒载体对SK-N-SH神经母细胞瘤细胞株的感染效率。方法使用基因重组技术构建携带EGFP基因的反转录病毒载体(RV/EGFP)。将稀释的RV病毒液感染NIH3T3细胞,计数NIH... 详细信息

目的构建携带报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的反转录病毒载体,并且探讨病毒载体对SK-N-SH神经母细胞瘤细胞株的感染效率。方法使用基因重组技术构建携带EGFP基因的反转录病毒载体(RV/EGFP)。将稀释的RV病毒液感染NIH3T3细胞,计数NIH3T3荧光表达细胞的数量来确定病毒的浓度;使用RV载体感染SK-N-SH细胞,通过流式细胞学荧光检测明确RV在SK-N-SH细胞的感染效率。结果成功构建了基因转移载体RV/EGFP,确定重组病毒的浓度为8.3×106病毒颗粒/mL。在SK-N-SH细胞RV/EGFP稳定转染并有效表达。在SK-N-SH细胞EGFP的荧光表达显示RV的转移并且表达的效率达到30%以上。结论SK-N-SH细胞能被RV病毒载体有效感染,在转基因细胞株外源基因的表达长期稳定并且显示RV病毒载体具有良好的基因转移效率。

关键词： SK—N—SH神经母细胞瘤细胞增强型绿色荧光蛋白反转录病毒载体

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反转录病毒载体-HSV-tk-GCV系统进行脑胶质瘤基因治疗的实验研究以及GCV、CDDP诱导转导、非转导C6胶质瘤细胞凋亡的实验研究

反转录病毒载体-HSV-tk-GCV系统进行脑胶质瘤基因治疗的实验研究...

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作者：马文斌中国协和医科大学

学位级别：博士

在成人及儿童中，恶性脑胶质瘤是一类最恶性的肿瘤，是致残及致死的主要原因；发病率约为2—3／10万。尽管诊断及治疗的进步（手术，辅助放疗，化疗），但仍只有10％多形性胶母细胞瘤患者，40％间变性星形细胞瘤患者能够生存2年以上，... 详细信息

在成人及儿童中，恶性脑胶质瘤是一类最恶性的肿瘤，是致残及致死的主要原因；发病率约为2—3／10万。尽管诊断及治疗的进步（手术，辅助放疗，化疗），但仍只有10％多形性胶母细胞瘤患者，40％间变性星形细胞瘤患者能够生存2年以上，因此本病的预后仍然不佳。探索更新更有效的恶性脑胶质瘤治疗方法是十分必要的。当今将目的基因转移至体细胞被认为是治疗人类许多难治性疾病的崭新方法。药敏基因疗法（或自杀基因疗法）是基因治疗方法中的一种，以单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV-tk基因）做为目的基因在药敏基因疗法中应用最广。95年底统计近120项临床肿瘤基因治疗／标记方案中，21项采用药敏基因疗法，其中有12项针对恶性脑胶质瘤。单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK酶）能够将核苷类似物Ganciclovir（GCV，环丙鸟苷），一种对正常哺乳动物细胞无毒性的抗病毒药物，三磷酸化后成为GCVTP（这一过程需要有细胞TK酶的协助）。GCVTP成为DNA链延伸的终止物阻断了DNA的复制合成，最终导致含有HSV-tk基因的细胞被杀灭。在转导细胞（HSV-tk+）被杀灭同时，邻近非转导细胞（HSV-tk-）也被杀灭，这一现象被称为“旁观者效应”，此为HSV-tk-GCV系统杀灭肿瘤细胞的另一重要机理。鉴于恶性脑胶质瘤是在正常脑细胞这一非分裂细胞环境中生长，而反转录病毒的前病毒能整合到分裂细胞的基因组中，因此反转录病毒载体将目的基因转移至恶性脑胶质瘤是很特异的。反转录病毒携带HSV-tk基因并将其转移至脑肿瘤细胞然后给予GCV治疗是治疗脑肿瘤的新方法；体内，体外实验均获得成功，初步临床报道表明该方法治疗脑肿瘤效果令人鼓舞。看来反转录病毒载体介导的HSV-tk-GCV系统（Rv Vector-HSV-tk-GCV系统）对恶性脑胶质瘤的治疗是很适合的。本实验组利用NTK（含HSV-tk基因）反转录病毒载体，以磷酸钙共沉淀法转染包装细胞PA317细胞系，分离并扩增抗G418克隆，Southern-blot杂交证实前病毒的整合；测定上清病毒滴度；建立了能产生反转录病毒载体的双向性包装细胞系（VPC细胞）PA317／NTK。体外利用VPC的上清感染C6大鼠脑胶质瘤细胞，经G418筛选出C6／NTK11并扩增之。Southern-blot杂交及

关键词： HSV-tk-GCV 大鼠胶质瘤包装细胞系胶质瘤细胞反转录病毒载体细胞凋亡基因治疗

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反转录病毒载体介导可溶性Fas的体外表达

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中国实验血液学杂志 2002年第2期10卷 97-99页

作者：王良利邹萍胡中波刘凌波李爱香马艳萍华中科技大学同济医学院附属协和医院血液病研究所武汉430022

将含全长FascDNA的质粒利用PCR技术进行特定片段删除 ,获得sFascDNA。通过DNA重组技术 ,将sFascDNA插入到反转录病毒载体 pLXIN ,构建了重组表达载体pLXIN sFas。经酶切鉴定及测序 ,表明成功地构建了重组表达载体 pLXIN sFas。该载体经P... 详细信息

将含全长FascDNA的质粒利用PCR技术进行特定片段删除 ,获得sFascDNA。通过DNA重组技术 ,将sFascDNA插入到反转录病毒载体 pLXIN ,构建了重组表达载体pLXIN sFas。经酶切鉴定及测序 ,表明成功地构建了重组表达载体 pLXIN sFas。该载体经PA317细胞包装后 ,感染靶细胞COS 7,分别采用ELISA及凋亡抑制实验检测其蛋白表达量为 (2 .2± 0 .7) μg/ml,且具有良好的生物学活性 ,能明显抑制抗 Fas(CH 11)介导的T淋巴瘤细胞株Jurkat的凋亡。

关键词：反转录病毒载体可溶性Fas 基因表达基因转移体外表达白血病免疫监视

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牛sox2基因的克隆及重组反转录病毒载体的构建

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生物工程学报 2009年第10期25卷 1464-1469页

作者：辛晓玲吕长荣陈冬梅窦忠英西北农林科技大学动物医学院陕西省农业分子生物学重点实验室国家干细胞工程技术研究中心陕西分中心杨凌712100 河南省农业科学院畜牧兽医研究所郑州450002

为了构建包含牛sox2基因编码序列的重组反转录病毒载体,获得有感染性的病毒颗粒,本研究以胎牛原始生殖嵴为材料,用RT-PCR方法克隆出牛sox2基因的开放阅读框序列,将其亚克隆至pMD18-T载体并测序。结果表明获得的基因片段与发表的牛sox2... 详细信息

为了构建包含牛sox2基因编码序列的重组反转录病毒载体,获得有感染性的病毒颗粒,本研究以胎牛原始生殖嵴为材料,用RT-PCR方法克隆出牛sox2基因的开放阅读框序列,将其亚克隆至pMD18-T载体并测序。结果表明获得的基因片段与发表的牛sox2基因序列(Gen Bank Accession ***-001105463)高度同源;将测序正确的重组T载体用EcoRI和BglII酶切,基因片段插入反转录病毒载体pMSCVneo的相同酶切位点,成功构建了重组反转录病毒载体pMSCV-sox2。采用脂质体法用pMSCV-sox2转染包装细胞PT67,同时用pMIG(含绿色荧光蛋白)作为阳性对照,经流式细胞仪测定,该载体转染效率达到68.3%;转染后PT67细胞经G418筛选得到稳定的产毒细胞株,其病毒滴度达8.16×107CFU/mL,为下一步特定因子诱导牛体细胞转变为牛iPS细胞的研究奠定了基础。

关键词：牛 sox2基因 iPS细胞反转录病毒载体

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内含子在人凝血Ⅸ因子反转录病毒载体中的表达及剪接作用

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Acta Genetica Sinica 1998年第6期25卷 471-477页

作者：邢永娜卢大儒高晓波邱信芳薛京伦复旦大学遗传学研究所上海200433

构建了带有内含子的反转录病毒表达载体，研究内含子对hFⅨ的表达影响。反转录病毒载体经过PA317细胞包装后，稳定保留内含子是进一步研究内含子对hFⅨ表达影响的关键。首先构建了GlNaC－i－Ⅸ、GlNaC－i'-Ⅸ表达元件正向插入的反... 详细信息

构建了带有内含子的反转录病毒表达载体，研究内含子对hFⅨ的表达影响。反转录病毒载体经过PA317细胞包装后，稳定保留内含子是进一步研究内含子对hFⅨ表达影响的关键。首先构建了GlNaC－i－Ⅸ、GlNaC－i'-Ⅸ表达元件正向插入的反转录病毒载体。其中，GlNaC－i－Ⅸ带有源于IL－2的异源内含子，GlNaC－i'－Ⅸ带有来自hFⅨ自身的第一内含子；其中间部分顺序缺失，只包括剪接供体和剪接受体位点。用RT－PCR方法发现，反转录病毒介导基因转移的载体中的内含子都被剪切掉。为避免内含子的剪切，又构建了表达元件反向插入的反转录病毒载体GlNaC－i'－ⅨR、GlNaPAi'ⅨBAM。用同样的方法证明，反向插入载体中的内含子被保留下来。证明表达元件反向插入的反转录病毒载体可以得到稳定的含有内含子的表达载体，ELISA检测证明内含子能提高hFⅨ表达。为进一步提高hFⅨ在体外细胞和体内的表达水平提供依据。

关键词：内含子反转录病毒载体血友病B hFIX

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牛Klf4基因重组反转录病毒载体的构建及产毒细胞株的建立

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畜牧兽医学报 2010年第12期41卷 1636-1641页

为了克隆牛Klf4基因并构建重组反转录病毒载体,得到稳定的产毒细胞株,本研究设计了带有酶切位点的一对引物,以接触抑制生长状态的MDBK细胞为材料,用RT-PCR方法克隆出牛Klf4基因的开放阅读框序列,将之插入干细胞反转录病毒载体pMSCVneo... 详细信息

为了克隆牛Klf4基因并构建重组反转录病毒载体,得到稳定的产毒细胞株,本研究设计了带有酶切位点的一对引物,以接触抑制生长状态的MDBK细胞为材料,用RT-PCR方法克隆出牛Klf4基因的开放阅读框序列,将之插入干细胞反转录病毒载体pMSCVneo构成真核表达载体pMSCV-Klf4;采用脂质体法将pMSCV-Klf4转染包装细胞PT67,通过G418筛选得到稳定的产毒细胞株,电镜观察培养液上清中的病毒颗粒,同时病毒感染NIH3T3细胞测定其病毒滴度。结果表明,本研究克隆的牛Klf4基因开放阅读框序列与已发表序列(NM-001105385)比对有99.9%的高同源性;构建的重组载体质粒可正常包装,电镜下可观察到典型的病毒颗粒,筛选出的产毒细胞株病毒滴度达7.16×107CFU·mL-1。本研究成功构建的真核表达载体pMSCV-Klf4和得到的产毒细胞株,为进一步开展有关牛iPS细胞的研究奠定了基础。

关键词：牛 Klf4基因 iPS细胞反转录病毒载体

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