检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：梁立君沈阳农业大学

学位级别：硕士

玉米是全球第一大粮食作物,对人类的粮食安全起着至关重要的作用。由于可耕地面积的限制,玉米生产面临着提高单产水平的压力。从光合碳同化过程入手,探索提高玉米光合效率的机制是提高其单产水平的重要途径。Rubisco是Calvin循环的限速... 详细信息

玉米是全球第一大粮食作物,对人类的粮食安全起着至关重要的作用。由于可耕地面积的限制,玉米生产面临着提高单产水平的压力。从光合碳同化过程入手,探索提高玉米光合效率的机制是提高其单产水平的重要途径。Rubisco是Calvin循环的限速酶,其活性直接影响光合效率。本文从深红红螺菌中克隆Ⅱ型Rubisco大亚基基因,构建玉米叶绿体表达载体,为玉米维管束鞘细胞的异源Rubisco基因表达和分析CO2固定机制奠定基础,也为玉米光合作用的基因改造提供思路。主要结果如下：1.利用PCR法克隆的深红红螺菌Ⅱ型Rubisco大亚基基因(CbbM)编码序列含有1401个核苷酸,与玉米Rubisco大亚基的同源性为39.18%。2.利用PCR法克隆玉米叶绿体Rubisco大亚基(RbcL)的启动子和终止子,作为CbbM基因玉米表达的启动子和终止子,最终在pBluescriptⅡ KS(+)载体上将三者组装成重组基因。3.分析玉米叶绿体基因组序列,确定以叶绿体DNA的trnA和trnI片段作为CbbM重组基因插入玉米叶绿体DNA的同源重组序列。本研究从玉米全基因组提取物成功克隆到trnA和trnI片段,并分别连接到pMD19-T载体上。4.根据文献,确定aadA为标记基因,以玉米的16SrRNA基因启动子作为启动序列,以玉米RbcL的终止子作为终止序列。本研究从玉米全基因组提取物成功克隆到16SrRNA的启动子和RbcL的终止子,并分别成功连接到载体pMD19-T上。5.最后,通过构建中间载体,将CbbM重组基因和aadA标记基因成功连接到pBluescript Ⅱ KS(+)载体上,构建了CbbM基因的玉米叶绿体表达载体,并且成功在大肠杆菌中表达,其抗性得到初步验证。6.本研究还利用荧光定量PCR法对深红红螺菌CbbM基因表达进行了分析,结果表明：在20℃、25℃、30℃、35℃、40-C的条件下,CbbM基因在25℃时相对表达量最高；在黑暗、1000 lux、2000 lux、3000 lux、4000lux、 5000lux的光照强度下,CbbM基因在4000 lux下相对表达量最高；在培养基中氯化铵含量分别为0.5g/L、0.75g/L、 1g/L、1.25g/L、1.5 g/L的条件下,CbbM基因在1.25 g/L时表达量最高；在培养基中苹果酸含量分别为1g/L、2.5g/L、4 g/L、5.5g/L、7g/L的条件下,CbbM基因在4 g/L时相对表达量最高。

关键词：玉米深红红螺菌 Rubisco CbbM 叶绿体表达载体

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一种人源碱性成纤维细胞生长因子、烟草叶绿体表达载体及生产方法

一种人源碱性成纤维细胞生长因子、烟草叶绿体表达载体及生产方法

引用

作者：邢少辰蔡玉红王云鹏韦正乙仲晓芳林春晶张玉英马建刘艳芝孙卉 130000 吉林省长春市净月开发区彩宇大街1363号

本发明公开了一种人源碱性成纤维细胞生长因子，该基因序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了一种用于生产人源碱性成纤维细胞生长因子的烟草叶绿体表达载体，命名为pWX-Nt03；本发明还公开了一种携带并可扩增上述载体的宿主细胞Mach1... 详细信息

标准号: CN104946656A

本发明公开了一种人源碱性成纤维细胞生长因子，该基因序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了一种用于生产人源碱性成纤维细胞生长因子的烟草叶绿体表达载体，命名为pWX-Nt03；本发明还公开了一种携带并可扩增上述载体的宿主细胞Mach1；本发明还公开一种利用烟草叶绿体作为生物反应器生产人源碱性成纤维细胞生长的方法；利用叶绿体表达bFGF能够较传统的动物血液中分离提取法和现行生物工程制药中的微生物发酵法不仅大幅度降低成本，且由于植物中往往不含有或极少含有能够导致人及动物过敏反应的热源蛋白，因此，相对利用微生物生产bFGF具有更好的临床应用前景。

关键词：一种人源碱性成纤维细胞生长因子公开烟草碱性成纤维细胞叶绿体表达载体微生物发酵法生物反应器微生物生产叶绿体表达动物血液分离提取过敏反应基因序列临床应用热源蛋白宿主细胞可扩增叶绿体制药生物工程携带命名生产生长前景导致

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一种对衣藻叶绿体表达载体进行构建的方法

一种对衣藻叶绿体表达载体进行构建的方法

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作者：刘军 116000 辽宁省大连市西岗区信诚街3号1617

本发明公开了一种对衣藻叶绿体表达载体进行构建的方法。步骤如下：首先选取目标质粒，并以其为模版，用引物进行扩增psbA;在95摄氏度环境下进行变性，时间至少5分钟；随后，92-93摄氏度的环境下，变性1分钟；反复上述步骤3次；然后退... 详细信息

标准号: CN103757045A

本发明公开了一种对衣藻叶绿体表达载体进行构建的方法。步骤如下：首先选取目标质粒，并以其为模版，用引物进行扩增psbA;在95摄氏度环境下进行变性，时间至少5分钟；随后，92-93摄氏度的环境下，变性1分钟；反复上述步骤3次；然后退火，时间至少2分钟，75摄氏度延伸至少一分钟；PCR产物经电泳检测；切胶回收目的条带；将回收的片段进行TA克隆，构件质粒；上述步骤循环3次即可；阳性菌落需要经过PCR和双酶切鉴定，选取鉴定正确的菌液留用；DNA连接酶连接回收的片段，需要在15摄氏度的环境下转化到感受态细胞中，并且在琼脂平板上培养过夜。本发明的有益效果是，成本较低、重复性好，与预期相符，说明质粒构建的合理性和成果性。

关键词：变性回收质粒叶绿体表达载体退火电泳检测目标质粒琼脂平板阳性菌落连接酶双酶切菌液扩增模版条带衣藻引物合理性克隆细胞连接延伸转化培养成果

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菊苣叶绿体表达载体的构建及对菊苣和烟草的转化

菊苣叶绿体表达载体的构建及对菊苣和烟草的转化

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作者：巩智刚西北大学

学位级别：硕士

细胞核转化存在转基因沉默和转基因逃逸等不可避免的问题。高等植物叶绿体转化因具有外源基因可按设计位点整合、叶绿体基因组单亲母性遗传、高拷贝表达目的蛋白等优点,被作为细胞核转化的互补技术。目前,扩大叶绿体转化的受体植物种类... 详细信息

细胞核转化存在转基因沉默和转基因逃逸等不可避免的问题。高等植物叶绿体转化因具有外源基因可按设计位点整合、叶绿体基因组单亲母性遗传、高拷贝表达目的蛋白等优点,被作为细胞核转化的互补技术。目前,扩大叶绿体转化的受体植物种类及非抗生素选择标记的应用是其发展的新趋向和研究的重点之一。本研究以牧草菊苣为材料,建立其叶片离体再生体系及叶绿体转化体系,不仅扩大叶绿体遗传转化的受体植物种类,而且为将来通过叶绿体转化对菊苣进行遗传改良,或以菊苣叶绿体作生物反应器生产动物口服疫苗等搭建技术平台。实验取得以下成果： 1.优化了普那菊苣叶片离体再生体系,研究了不同激素浓度配比对菊苣叶片不定芽发生及生根的影响。结果显示：菊苣叶片不定芽直接发生的最佳培养基为MSo+6-BA1.5mg/L+NAA0.4mg/L,最佳生根培养基为1/2MS0+NAA0.2mg/L 2.探讨了烟草、菊苣对壮观霉素和甘露糖的敏感性。当壮观霉素浓度分别为500mg/L和100mg/L时,对应烟草和菊苣的叶片外植体生长完全被抑制；当甘露糖+蔗糖浓度分别为30g/L+0g/L和29g/L+1g/L时,对应烟草和菊苣的叶片外植体生长完全被抑制,由此确定壮观霉素500mg/L或甘露糖30g/L为烟草叶绿体转化的选择压力,壮观霉素100mg/L或甘露糖29mg/L为菊苣叶绿体转化的选择压力。 3.通过PCR的方法扩增了0.72kb的GFP基因和1.2kb的6-磷酸甘露糖异构酶基因PMI,利用实验室保存的嵌合有菊苣叶绿体同源片段rpsl2和trnv-16SrDNA序列的载体pJLR1,以及包含菊苣叶绿体基因调控序列和筛选标记基因aadA的载体pARpt,通过常规的DNA体外重组技术,以GFP为报告基因,分别以抗生素标记基因aadA和安全标记基因PMI为筛选标记,构建了四个菊苣叶绿体定点整合表达载体,其中两个为操纵子表达盒载体pJAD-S/F和pJADM,两个为串联表达盒载体pJBC-S/F和pJBCM。各载体经多重酶切检测和测序验证,符合预期设计 4.进行了pJAD-S和pJBC-S对烟草和菊苣叶绿体的基因枪转化,建立了相应的叶绿体遗传转化体系,获得了烟草、菊苣壮观霉素抗性苗。以菊苣基因组总DNA为模板,PCR分别扩增出了GFP、aadA-GFP嵌合序列以及GFP-trnv-16SrDNA嵌合序列,表明外源基因全部整合进了叶绿体基因组；激光共聚焦显微镜下观察到叶绿体中有绿色荧光,证明外源基因在叶绿体中成功表达。

关键词：菊苣烟草叶绿体表达载体遗传转化生物安全

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EPSP合酶基因水稻叶绿体表达载体及其应用

EPSP合酶基因水稻叶绿体表达载体及其应用

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作者：李轶女张志芳王金辉王国增程奇倪丕冲沈桂芳 100081 北京市海淀区中关村南大街12号

本发明公开了EPSP合酶基因水稻叶绿体表达载体及其应用。所述水稻叶绿体表达载体包括：EPSP合酶基因的表达盒，水稻叶绿体基因组中的同源重组片段atpB以及rbcL；其中，EPSP合酶基因的表达盒位于同源重组片段atpB和rbcL之间。本发明还提... 详细信息

标准号: CN102559745A

本发明公开了EPSP合酶基因水稻叶绿体表达载体及其应用。所述水稻叶绿体表达载体包括：EPSP合酶基因的表达盒，水稻叶绿体基因组中的同源重组片段atpB以及rbcL；其中，EPSP合酶基因的表达盒位于同源重组片段atpB和rbcL之间。本发明还提供了叶绿体表达载体的构建方法。本发明进一步将所述水稻叶绿体表达载体应用于提高水稻草甘膦的抗性,包括:将水稻叶绿体表达载体转化水稻愈伤组织或细胞，再生获得草甘膦抗性有显著提高的转基因水稻。本发明能有效提高转基因水稻的草甘膦抗性，所获得的转基因水稻植株遗传稳定，无基因沉默和分离，具有生物安全性高、省时高效、能耗少、成本低等优点。

关键词：水稻叶绿体表达载体合酶基因草甘膦抗性转基因水稻重组片段同源叶绿体表达载体转基因水稻植株水稻愈伤组织生物安全性基因沉默遗传稳定草甘膦基因组抗性省时能耗水稻细胞再生转化

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一种海洋微藻叶绿体表达载体及其应用

一种海洋微藻叶绿体表达载体及其应用

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作者：李宏业朱聪聪杨维东刘洁生 510632 广东省广州市黄埔大道西601号

本发明公开了一种海洋微藻叶绿体表达载体及其应用。该海洋微藻叶绿体表达载体包含同源重组序列I、目的基因表达盒和同源重组序列II；目的基因表达盒位于同源重组序列I和同源重组序列II之间；同源重组序列I的第1～972bp是rns的3’部分，... 详细信息

标准号: CN101948871B

本发明公开了一种海洋微藻叶绿体表达载体及其应用。该海洋微藻叶绿体表达载体包含同源重组序列I、目的基因表达盒和同源重组序列II；目的基因表达盒位于同源重组序列I和同源重组序列II之间；同源重组序列I的第1～972bp是rns的3’部分，第973～1097bp是trnI的5’部分；同源序列II的第1～196bp是trnA基因的3’部分，第197～1483bp是rnl的5’部分。该同源重组序列使得通过电击法即可将表达载体导入海洋微藻叶绿体基因组中，方便了载体导入叶绿体基因组的途径并大大降低了转化成本，为实现利用海洋微藻叶绿体为生物反应器生产高附加值产品提供了技术支撑。

关键词：重组序列同源海洋微藻叶绿体表达载体目的基因表达叶绿体基因组导入附加值产品生物反应器表达载体技术支撑电击法叶绿体基因转化

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水稻叶绿体表达载体的构建及遗传转化

水稻叶绿体表达载体的构建及遗传转化

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作者：谢灵灵中南大学

学位级别：硕士

叶绿体转化技术具有诸多优点,但是该技术在水稻上的应用较少。本实验中,分别克隆了水稻叶绿体表达载体的不同元件,以水稻总DNA为模板,PCR扩增了叶绿体基因组同源重组片段trnl和trnA,与GenBank中水叶绿体基因组比对,同源性分别达到99.93%... 详细信息

叶绿体转化技术具有诸多优点,但是该技术在水稻上的应用较少。本实验中,分别克隆了水稻叶绿体表达载体的不同元件,以水稻总DNA为模板,PCR扩增了叶绿体基因组同源重组片段trnl和trnA,与GenBank中水叶绿体基因组比对,同源性分别达到99.93%和100%；以载体pEGFP-N2为模板,PCR扩增了具有3种含不同RBS序列的增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)；烟草叶绿体启动子Prrn和终止子TpsbA克隆自载体pLM21,与GenBank中烟草叶绿体基因组比对,同源性分别达到97.35%和100%。构建了3种能编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的水稻叶绿体转化载体pIA-EGFP1、pIA-EGFP2和pIA-EGFP3并进行了酶切检测。将上述所构建载体电转入大肠杆菌,观察了大肠杆菌内egfp的表达情况,结果显示,携带的RBS来源于λ噬菌体T7 gene 10的5'UTR的载体pIA-EGFP3荧光最强。以载体pCAMBIA1301为模板,PCR扩增了RBS为T7 gene 10的5'UTR的潮霉素磷酸转移酶基因(hpt),并将该片段连入了载体pIA-EGFP3,构建了载体pIA-EGFP3-HPT,将载体电转入大肠杆菌后检测了潮霉素抗性,转化成功的大肠杆菌具有潮霉素抗性。将载体pIA-EGFP3-HPT通过基因枪轰击洋葱表皮细胞,观察egfp的瞬时表达,结果在洋葱表皮细胞中观测到了明显的绿色荧光,说明载体pIA-EGFP3-HPT在洋葱质体中成功表达,因此认为载体pIA-EGFP3-HPT适合用于水稻叶绿体转化,目前烟草的转叶绿体技术比较成熟,且扩增得到的同源片段与叶绿体基因组有较高的同源性,因此将载体轰击烟草叶片。

关键词：水稻叶绿体表达载体原核表达瞬时表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)

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一种海洋微藻叶绿体表达载体及其应用

一种海洋微藻叶绿体表达载体及其应用

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作者：李宏业朱聪聪杨维东刘洁生 510632 广东省广州市黄埔大道西601号

标准号: CN101948871A

关键词：重组序列同源海洋微藻叶绿体表达载体目的基因表达叶绿体基因组导入附加值产品生物反应器表达载体技术支撑电击法叶绿体基因转化

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一种可稳定自发光的重组载体的构建方法及其应用

一种可稳定自发光的重组载体的构建方法及其应用

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作者：丁莉萍魏建华王宏芝李瑞芬张杰伟陈亚娟张中保黄义 100097 北京市海淀区曙光花园中路9号

本发明公开了一种可稳定自发光的重组载体的构建方法及其应用。本发明的重组载体是将叶绿体rps7基因上游同源臂、脂肪酸还原酶编码基因、转移酶编码基因、荧光素酶α亚基编码基因、荧光素酶β亚基编码基因、合成酶编码基因、黄素还原酶... 详细信息

标准号: CN104711285B

本发明公开了一种可稳定自发光的重组载体的构建方法及其应用。本发明的重组载体是将叶绿体rps7基因上游同源臂、脂肪酸还原酶编码基因、转移酶编码基因、荧光素酶α亚基编码基因、荧光素酶β亚基编码基因、合成酶编码基因、黄素还原酶编码基因和叶绿体ndhB基因下游同源臂插入叶绿体表达载体中得到的载体。本发明的重组载体上有两段来源于杨树(山新杨)叶绿体DNA的序列作为同源重组片段，将来可将发光基因定点插入杨树叶绿体基因组的rps7基因和ndhB基因之间的间隔区，并使之在杨树叶绿体基因组中高效表达，可以获得自发光的转基因杨树，具有很好的应用前景。

关键词：编码基因重组载体还原酶编码杨树叶绿体荧光素酶基因组同源臂叶绿体自发光合成酶编码基因叶绿体表达载体转基因杨树脂肪酸叶绿体DNA 发光基因高效表达同源重组基因间隔区转移酶构建黄素两段应用杨树上游

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甘薯叶绿体表达载体构建及其融合基因在叶绿体中的瞬间表达

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西北植物学报 2009年第9期29卷 1747-1755页

作者：王玉华张秀海吴忠义王永勤黄丛林贾敬芬西北大学生命科学学院/陕西省生物技术重点实验室/西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室西安710069 北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心北京100097

利用叶绿体基因组进化中高度保守的特点,根据烟草叶绿体基因组全序列设计引物,从甘薯(Ipomoeabatatas)叶绿体基因组中克隆了2个相邻的功能基因rbcL(GenBank登录号为AY942199)和accD(GenBank登录号为AY942200),并以此作为定点整合外源基... 详细信息

利用叶绿体基因组进化中高度保守的特点,根据烟草叶绿体基因组全序列设计引物,从甘薯(Ipomoeabatatas)叶绿体基因组中克隆了2个相邻的功能基因rbcL(GenBank登录号为AY942199)和accD(GenBank登录号为AY942200),并以此作为定点整合外源基因的同源重组片段。以来自叶绿体基因组的强启动子Prrn和Rps-bA-pro分别驱动选择标记基因aadA及phaC-gfp融合基因,构建成表达盒prrn-aadA-TpsbA-ter与RpsbA-pro-phaC-gfp-RpsbA-ter,然后将这2个表达盒串联在一起克隆进甘薯叶绿体同源片段中,获得甘薯叶绿体定点整合表达载体pSC-GFP。酶切分析证明,所构建的载体符合预期设计;采用该载体对甘薯叶片进行基因枪转化,结果显示,phaC-gfp融合基因可在叶绿体特异启动子和终止子的调控下在甘薯幼嫩叶片中瞬间表达,证明构建的载体pSC-GFP可用于甘薯叶绿体转化。

关键词：甘薯叶绿体同源片段叶绿体表达载体瞬间表达中长链聚羟基脂肪酸酯

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