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排序：

室间隔缺损生物标志物的蛋白质组学研究

室间隔缺损生物标志物的蛋白质组学研究

引用

作者：张永波桂林医学院

学位级别：硕士

先天性心脏病(Congenital Heart Disease, CHD)是人类最常见的出生缺陷之一,在活产新生儿中发病率估计为4‰-5‰,是婴幼儿期非感染死亡的首位病因。室间隔缺损(Ventricular Septal Defect,VSD)约占CHD的25%-50%,在出生缺陷中占有重要地... 详细信息

先天性心脏病(Congenital Heart Disease, CHD)是人类最常见的出生缺陷之一,在活产新生儿中发病率估计为4‰-5‰,是婴幼儿期非感染死亡的首位病因。室间隔缺损(Ventricular Septal Defect,VSD)约占CHD的25%-50%,在出生缺陷中占有重要地位。VSD的病因及发病机制十分复杂,可能涉及多种因素、多个基因和多条信号通路的改变,以往的研究主要集中在遗传基因、环境危险因素领域,但是要完整了解VSD发生的机制,仅把易感基因定位,明确环境危险因素是不够的,必须要了解心脏在向异常分化发育的过程中与之密切相关蛋白质组及其功能。蛋白质组学作为生命科学研究的一个重要分支发展十分迅速,一系列新技术融入了蛋白质组学研究中。同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术是由美国应用生物系统公司(Applied Biosystems Incorporation,ABI)研发的一种体外多肽同位素标记相对和绝对定量技术,该技术结合串联质谱的方法可对血清、细胞裂解产物等样品进行相对和绝对定量研究,是一种寻找生物标志物的理想方法。本研究旨在利用蛋白质组学技术筛选出潜在的VSD生物标志物,为进一步从蛋白组学角度探索VSD的发病机制以及应用生物标志物孕早期诊断CHD做出基础工作。目的：1.通过比较血清高丰度蛋白去除方法,建立血清蛋白质组学研究中有效富集低丰度蛋白的方法并评价富集效果。2.应用蛋白质组学技术筛选潜在的VSD血清蛋白标志物,为进一步从蛋白组学角度探索VSD的发病机制奠定基础。方法：1.分别应用乙腈沉淀法、乙醇沉淀法、MARS-Human14多重亲和去除系统去除血清中高丰度蛋白,利用预制凝胶电泳和双向凝胶电泳评价高丰度蛋白去除情况和低丰度蛋白富集效果。2.收集VSD患者血清和与之相匹配的健康对照者、房间隔缺损患者、法洛氏四联症患者血清各15例,组内等量混合后利用MARS-Human14多重亲和去除系统去除14种高丰度蛋白,应用iTRAQ试剂标记后进行二维液相色谱分离,串联质谱鉴定VSD相关差异蛋白,并进行生物信息学分析。结果：1.三种方法均有去除血清高丰度蛋白作用,但乙腈沉淀法和乙醇沉淀法在去除血清高丰度蛋白的同时亦造成低丰度蛋白的丢失,其中乙腈沉淀法以丢失较高分子量蛋白为主,乙醇沉淀法以丢失低分子量蛋白为主。MARS-Human14多重亲和去除系统在特异地去除血清高丰度蛋白的同时使低丰度蛋白得到有效富集。2.质谱鉴定出置信度>95%的蛋白质共329种,其中表达量有显著差异的蛋白质有26种,VSD组较健康对照组、房间隔缺损组、法洛氏四联症组表达量均上调>1.3倍的蛋白有15种,下调<0.78倍的蛋白有11种。生物信息学分析发现这些差异蛋白主要参与的生物学过程109个、细胞成分23个、分子功能17个、代谢通路2条,预测相互作用蛋白50个。结论：1. MARS-Human14多重亲和去除系统是血清蛋白质组学研究中富集血清低丰度蛋白的有效方法。2.筛选出一系列对VSD患者具有潜在标志意义的血清差异表达蛋白,为进一步利用生物标志物探索VSD的发病机制奠定基础。

关键词：先天性心脏病室间隔缺损同位素标记相对和绝对定量技术蛋白质组学血清蛋白标志物

来源：评论

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精原干细胞动态标记物的初步筛选

精原干细胞动态标记物的初步筛选

引用

作者：田稼宁夏医科大学

学位级别：硕士

精原干细胞移植对男性不育的治疗具有潜在的临床应用价值,尤其对青春期前接受大剂量化疗致生精功能严重受损的非梗阻性无精子症患者,具有独特的临床应用价值。只要在非梗阻性无精子症患者睾丸内找到精原干细胞,就有可能促使其增殖分化... 详细信息

精原干细胞移植对男性不育的治疗具有潜在的临床应用价值,尤其对青春期前接受大剂量化疗致生精功能严重受损的非梗阻性无精子症患者,具有独特的临床应用价值。只要在非梗阻性无精子症患者睾丸内找到精原干细胞,就有可能促使其增殖分化获得精子;或通过特异性标志物分选,体外获得纯度较高的精原干细胞用于增殖培养或移植。然而,如何确定所获得细胞是精原干细胞,成为此项工作的首要条件。精原干细胞在增殖和分化的过程中细胞表面和细胞内会表达许多蛋白质,这些蛋白质如果有较好的特异性和敏感性,作为精原干细胞标志物,将对分离及鉴定精原干细胞发挥重要作用。我们将不同年龄阶段小鼠精原干细胞采用复合酶消化、免疫磁珠分选技术分离纯化出后,通过双向凝胶电泳及蛋白质质谱分析技术动态观测各年龄阶段精原干细胞蛋白质表达的差异,运用生物信息学蛋白质组数据库筛选并确定差异性蛋白质或发现新的蛋白质。目的:利用i TRAQ蛋白质质谱分析技术观测各年龄阶段精原干细胞(SSCs)蛋白的表达,进一步分析SSCs标志物表达的动态变化,运用生物信息学蛋白质组数据库筛选并发现新的标志物。方法:以健康雄性C57BL/6小鼠为研究对象,按照年龄段不同分为8组,无菌提取各组小鼠睾丸组织,采用复合酶消化、免疫磁珠分选的方法纯化SSCs后提取蛋白,利用双向电泳及i TRAQ标记蛋白质质谱分析技术并结合蛋白质数据库对各组蛋白质进行分析鉴定。结果:质谱实验共得到谱图248510张,通过Mascot软件进行分析,共鉴定到1132种蛋白。以蛋白丰度差异倍数达到1.2倍以上,且经统计学检验P?0.05视为存在差异性蛋白,8组共检测到差异蛋白298种。鉴定到目前已知的SSCs标志物9种(PCNA、GFRA1、CDH1、Annexin A7、UCHL1、VASA、CD49f、CD29、PLZf),通过各组对比获得在不同年龄段内表达变化趋势,其中GFRA1、CD49f、CD29在SSCs中的变化趋势与以往文献一致,并筛选出10种蛋白质(P63、CD71、CD98、K19、ACE、K18、K15、K17、SH2、SH3)作为SSCs标志物进一步研究的对象。结论:SSCs内的蛋白随着机体年龄的变化表达存在差异,i TRAQ蛋白质质谱分析技术可以对SSCs蛋白质组学信息进行分析与比较,获得各年龄阶段差异性表达蛋白,为进一步分析和研究这些差异性蛋白的功能与作用提供了新的方法。

关键词：精原干细胞蛋白质组学生物标记物同位素标记相对和绝对定量技术

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应用iTRAQ技术对阿尔茨海默病患者和正常老人颞叶组织进行差异蛋白分析

应用iTRAQ技术对阿尔茨海默病患者和正常老人颞叶组织进行差异蛋...

引用

作者：耿艳中国人民解放军医学院

学位级别：硕士

研究目的及意义：阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)是痴呆最常见的一种类型,约占老年痴呆的55%，其病理特征是细胞外β-淀粉样蛋白沉积所致老年斑(senile plaques, SP)和细胞内过度磷酸化的tau蛋白所致神经元纤维缠结(neurofibri... 详细信息

研究目的及意义：阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)是痴呆最常见的一种类型,约占老年痴呆的55%，其病理特征是细胞外β-淀粉样蛋白沉积所致老年斑(senile plaques, SP)和细胞内过度磷酸化的tau蛋白所致神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFT)，其常见的沉积部位如海马，额叶和颞叶。老龄脑与AD有着相互重叠的病理和生化改变。应用蛋白质组学技术从整体角度分析细胞内的蛋白质组成和表达水平，将有助于筛选出AD早期诊断的分子标志物,有的或可成为新药设计的分子靶点。本研究旨在分析正常老年人和AD患者颞叶脑皮质组织中的差异蛋白，为进一步研究AD发病机制奠定基础。主要内容：从解放军总医院老年医学研究所老年组织库中选取12例尸检的老年人颞叶脑皮质组织标本，分为正常老年组(n=6)和AD组(n=6),1.利用HE、免疫组织化学方法对病例进行筛选，根据病理诊断标准确诊后，结合临床诊断分组；2.应用同位素标记相对和绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolutequantitation，iTRAQ)及二维液相色谱-串联质谱(two-dimensional liquidchromatography-tandem mass spectrometry,2D LC-MS/MS)方法鉴定蛋白，利用生物信息学分析工具DAVID对质谱鉴定的蛋白进行GO功能注释、蛋白质功能富集分析及PATHWAY定位分析，并分析差异蛋白在AD发病机制中的作用。3.对差异蛋白进行western blot验证，验证蛋白质组分析的稳定性和准确性。结果：在正常老年组和AD组尸检的颞叶脑皮质组织中，经质谱鉴定共获得3071种蛋白，生物信息分析差异蛋白质有146种，与正常老年组相比，AD组中，有62种蛋白质表达上调和84种蛋白质表达下调。进一步分析从146种差异蛋白中发现7种AD通路相关蛋白（p=7.8E-3)，即基因转录翻译的差异蛋白质：丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen activated protein kinase-1,MAPK-1)、NADH脱氢酶(nicotinamide adenine dinucleotide [H], NADH)亚基Ⅵ、亚基Ⅹ和细胞色素C氧化酶(cytochrome c oxidase, COX)亚基Ⅰ、亚基Ⅱ、亚基Ⅲ和亚基Ⅳ。western blot验证显示，MAPK-1蛋白在AD组中较正常老年组中表达上调，是正常老年组的1.473倍，而iTRAQ蛋白质组学分析显示AD组MAPK-1蛋白表达也是同样上调，AD组是正常老年组的1.57倍，证明蛋白质组学结果较好的可信度和准确性。结论：iTRAQ技术快速、有效地筛选出多种与AD相关的差异蛋白，为AD疾病采取有效预防措施或寻找治疗靶点的研究提供了基础性数据资料。本文旨在研究正常增龄和阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)小脑结构异同点。将收集的20例尸检的老年男性小脑皮层组织分为3组：中年组、正常老年组和阿尔茨海默病（AD）组。Nissl染色用于测量小脑皮层颗粒细胞数量和小脑皮层的厚度变化、免疫组织化学观察胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫染色的星型胶质细胞和钙结合蛋白D28K（CB）免疫染色的蒲肯野细胞(Purkinje cells, PCs)数量的变化。结果显示,与中年组相比，在正常老年组，分子层、颗粒层和小脑总皮层厚度显著减小(p<0.05),蒲肯野细胞(Purkinje cells, PCs)和颗粒细胞密度均减小（p<0.05）；星型胶质细胞的数目显著增加；在AD组与正常老年组比较显示，AD组分子层和小脑总皮层厚度明显减小（p<0.05)，星型胶质细胞数量有所增加。结果提示，正常增龄和AD的过程均影响人小脑皮层结构变化，主要表现在PCs和颗粒细胞数目减少，而星型胶质细胞数目的增加。

关键词：阿尔茨海默病蛋白质组学同位素标记相对和绝对定量技术尸检颞叶组织免疫印记小脑皮层正常增龄阿尔茨海默病胶质纤维酸性蛋白钙结合蛋白-D28k

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胃癌的中医证型分布情况及脾胃虚寒型胃癌的iTRAQ研究和个体化治疗分子检测

胃癌的中医证型分布情况及脾胃虚寒型胃癌的iTRAQ研究和个体化治...

引用

作者：高志华锦州医科大学

学位级别：硕士

目的通过对胃癌进行中医辨证分型,统计每个中医证型的胃癌在整体中所占的比例,并收集其中最常见中医证型(脾胃虚寒型)的胃癌患者的组织标本,进行iTRAQ和个体化分子治疗检测相关的研究。方法1.通过中医证型调查表,收集胃癌患者的基本病... 详细信息

目的通过对胃癌进行中医辨证分型,统计每个中医证型的胃癌在整体中所占的比例,并收集其中最常见中医证型(脾胃虚寒型)的胃癌患者的组织标本,进行iTRAQ和个体化分子治疗检测相关的研究。方法1.通过中医证型调查表,收集胃癌患者的基本病例资料,统计我院的胃癌的中医证型分布情况。2.收集最常见的中医证型(脾胃虚寒型)的胃癌患者的组织标本,分胃癌组和癌旁正常对照组(简称:对照组),进行iTRAQ的研究,并利用western blot的方法对其中的五个蛋白(FLNA、VASP、CAV1、COL4A2、PRKCA)进行验证。3.对脾胃虚寒型胃癌患者的甲醛浸泡处理固定后的组织标本进行了6个基因的个体化分子治疗检测,并讨论其中的切除修复交叉互补基因1和TOPOⅡA m RNA的表达情况,及对应的靶向化疗药物。结果1.胃癌的中医证型分布频率由多到少的分布情况如下:脾胃虚寒型(42.9%),气血两虚型(24.1%),瘀血内结型(13.4%),胃热阴虚型(8.9%),肝胃不和型(7.1%),痰湿阻滞型(3.6%)。2.胃癌组和对照组的iTRAQ实验结果提示:同对照组相比,胃癌组一共鉴定到了2770个蛋白质,其中上调倍数大于1.2倍的蛋白质有147个(P<0.05),下调倍数小于0.8倍的有159个(P<0.05)。其中,有明显差异的蛋白质(P<0.05)共参与了41个KEGG信号通路,在差异蛋白数量最多的Focal adhesion通路中,有统计学意义的差异蛋白有14个,具体的蛋白质为:COL6A3、MYLK、VASP、FLNC、FLNA、ACTN2、PARVA、ACTN1、ITGA5、CAV1、VCL、PRKCA、COL4A2、ITGA1。利用western blot的方法对其中的五个目的蛋白质(FLNA、VASP、CAV1、COL4A2、PRKCA)进行验证,验证结果提示其表达趋势和iTRAQ结果中这五个蛋白质的表达趋势大致相同,均呈下降趋势。具体的iTRAQ结果如下:(1)FLNA蛋白又称为细丝蛋白A,胃癌组的FLNA表达量比对照组下降了0.502倍。(2)血管扩张刺激磷蛋白(VASP),胃癌组的VASP表达量比对照组下降了0.472倍。(3)CAV1(Caveolin 1)也称小凹蛋白,胃癌组的CAV1的表达量比对照组下降了0.604倍。(4)COL4A2是Collagen IV(4型胶原蛋白,COL IV)的一种,胃癌组的COL4A2的表达量比对照组下降了0.604倍。(5)PRKCA也称蛋白激酶Ca,是蛋白激酶C(PKC)的一种,胃癌组的PRKCA的表达量比对照组下降了0.645倍。3.对胃癌患者的手术标本进行了6个基因的个体化分子治疗检测,并对其中两个基因进行探讨。(1)当患者的切除修复交叉互补基因1(ERCC1)低表达时,可以通过核苷酸切除修复途径,识别DNA链上的损伤部位,接着进行剪切、转录、编码等,此时,铂类药物对肿瘤细胞的敏感性较高,应用含有铂类药物的化疗方案,可提高患者化疗的临床疗效。(2)根据检测报告的推荐意见和相关的文献研究发现,依托泊苷通过抑制TOPOⅡA的活性发挥抗肿瘤作用,当TOPOⅡA m RNA的表达水平高时,其对依托泊苷的敏感性较高,可在临床治疗时选择含有依托泊苷的化疗方案进行化疗。结论1.在胃癌的中医证型的分型中,脾胃虚寒型最多见,治疗可以选用附子理中汤、补中益气汤等加减。2.在胃癌组和对照组的iTRAQ实验中,一共鉴定到了2770个蛋白质,这些蛋白共参与了41个信号传导通路,其中,Focal adhesion通路的五个蛋白FLNA、VASP、CAV1、COL4A2、PRKCA的表达量,胃癌组均比对照组明显下降。这五个蛋白经western blot验证其表达趋势和iTRAQ数据中大致相同,也都呈下降趋势。推测可能是细胞外的COL4A2表达下调后,通过信号传导,使细胞膜上的CAV1表达下调,进而影响细胞内FLNA、VASP、PRKCA的表达也下调。3.对部分胃癌患者的手术标本进行了6个基因的个体化分子治疗检测,观察到:当胃癌患者的切除修复交叉互补基因1(ERCC1)低表达时,表明其对铂类药物的敏感性较高,可选择含有铂类药物的化疗方案;当TOPOⅡA m RNA的表达水平高时,表明其对依托泊苷的敏感性较高,可选择含依托泊苷的化疗方案。

关键词：胃癌中医证型蛋白质组学同位素标记相对和绝对定量技术差异蛋白个体化治疗分子检测

来源：评论

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精索静脉曲张患者精浆蛋白质组学的初步研究

精索静脉曲张患者精浆蛋白质组学的初步研究

引用

作者：李勉洲青岛大学

学位级别：硕士

目的:应用同位素标记相对和绝对定量技术(i TRAQ)结合二维液相色谱-串联质谱技术(2D LC-MS/MS)筛选精索静脉曲张(varicocele,VC)不育患者和正常生育男性差异表达蛋白,探讨VC导致男性不育的可能分子机制。方法:收集左侧VC不育患者(II度或... 详细信息

目的:应用同位素标记相对和绝对定量技术(i TRAQ)结合二维液相色谱-串联质谱技术(2D LC-MS/MS)筛选精索静脉曲张(varicocele,VC)不育患者和正常生育男性差异表达蛋白,探讨VC导致男性不育的可能分子机制。方法:收集左侧VC不育患者(II度或III度)精液标本10份为实验组,正常生育男性精液标本10份作对照组。精浆样本i TRAQ标记后(117标记VC不育组,114标记正常生育对照组)进行2D LC-MS/MS分析。采用Proteome Discoverer1.3软件对质谱数据进行分析,差异表达蛋白上下调倍数≥1.3,P≤0.05为差异有统计学意义。所得差异表达蛋白进行生物信息学分析。结果:共鉴定出1100种蛋白。相对于正常生育组,VC不育组差异表达蛋白共89个,其中上调蛋白45个,下调44个。基因本体论(Gene ontology,GO)分析表明,这些差异表达蛋白的生物学过程主要富集分布于:损伤反应、防御反应、炎性反应、急性炎性反应、急性时相反应。与精子发生及生殖相关蛋白共3个,分别为:zona pellucida-binding protein 1 isoform 2 precursor,phosphoglycerate kinase2(PGK2),semenogelin-1 preproprotein。结论:精索静脉曲张对男性生育的影响可以通过精浆中蛋白的表达变化体现出来,这些差异蛋白参与的复杂的生物学过程如损伤反应、炎性反应等综合作用导致了男性生育能力的下降,然而具体的分子机制尚不清楚。我们筛选出来3个生育相关蛋白有望作为评估男新生育能力的分子标记物,有待于进一步的研究去验证。i TRAQ技术可以很好的应用于男性不育的研究中,并为深入研究精索静脉曲张导致男性不育的分子机制奠定了基础。

关键词：精索静脉曲张蛋白质组学同位素标记相对和绝对定量技术二维液相色谱-串联质谱技术

来源：评论

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炭样小单孢菌JXNU-1产抗生素JX对嗜根考克氏菌的拮抗作用机理研究

炭样小单孢菌JXNU-1产抗生素JX对嗜根考克氏菌的拮抗作用机理研究

引用

作者：陈鹏江西师范大学

学位级别：硕士

炭样小单孢菌JXNU-1是一株具有广谱抗菌活性的稀有放线菌,前期已系统地研究了该菌发酵产抗生素的工艺过程,建立了分离纯化抗生素的方法,并获得了层析纯的单组分、粉末状抗生素产品,经初步分析确定其为一核苷类抗生素。在此基础上,本文... 详细信息

炭样小单孢菌JXNU-1是一株具有广谱抗菌活性的稀有放线菌,前期已系统地研究了该菌发酵产抗生素的工艺过程,建立了分离纯化抗生素的方法,并获得了层析纯的单组分、粉末状抗生素产品,经初步分析确定其为一核苷类抗生素。在此基础上,本文对其抗菌机理进行了系统探究。主要研究结果如下:(1)研究了炭样小单孢菌JXNU-1产抗生素JX对嗜根考克氏菌的体外抗菌活性,结果表明,抗生素JX对嗜根考克氏菌的最低抑菌浓度为3.64 ug/mL。12 h后,抗生素JX对嗜根考克氏菌的杀菌率达到99.6%。显微镜观察表明,抗生素处理后的菌体的形态变大。(2)DAPI染色结果显示,DAPI可以和嗜根考克氏菌内的DNA和RNA结合,经过抗生素JX作用12 h后,菌体内的DNA和RNA含量呈无明显变化,表明抗生素JX对菌体核酸的合成无明显影响。(3)分析了嗜根考克氏菌分别在0、1/2MIC、4/5MIC和MIC的抗生素JX作用下的细胞壁含量变化,发现在一定的抗生素浓度范围内,嗜根考克氏菌细胞壁的含量随抗生素作用浓度增加而呈现上升趋势,当抗生素浓度达到MIC时,嗜根考克氏菌细胞壁含量比对照组细胞壁增加了76.5%。由此可知,抗生素JX显著促进了嗜根考克氏菌细胞壁的合成。(4)研究分析了嗜根考克氏菌在终浓度为0、1/2MIC、4/5MIC和MIC的抗生素JX作用下的蛋白质含量变化,发现在一定浓度范围内,嗜根考克氏菌蛋白质的含量随抗生素JX的含量增加而呈现下降趋势。嗜根考克氏菌在不含抗生素的NB肉汤中培养时的蛋白质含量为38 mg/g,而在MIC的抗生素条件下培养的细胞蛋白质含量为18 mg/g。由此可知,抗生素JX显著抑制了嗜根考克氏菌蛋白质的合成。(5)采用iTRAQ技术对1/2MIC抗生素处理组和对照组的嗜根考克氏菌蛋白质组进行分析。结果发现了1780个蛋白中有149个差异表达蛋白,包括表达上调蛋白106个(上调倍数≥1.20,P≤0.05),表达下调蛋白43个(下调倍数≤0.833,P≤0.05)。在抗生素的胁迫下,肽聚糖合成相关酶Mur G表达上调,蛋白质合成延伸因子EF-P表达下调。本文研究为揭示炭样小单孢菌JXNU-1抗生素的抗菌作用机理提供了基础数据。

关键词：炭样小单孢菌嗜根考克氏菌定量蛋白质组学同位素标记相对和绝对定量技术

来源：评论

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果蝇限食与非限食的蛋白质组学比较研究

果蝇限食与非限食的蛋白质组学比较研究

引用

作者：朱晨星四川农业大学

学位级别：硕士

限制食物(DR),广泛定义为在不会导致生物营养不良的条件下,减少20%-40%的食物摄取。目前已在多种模式生物如线虫、果蝇、鱼、啮齿类动物上进行了实验,证明限食可以有效延缓衰老以及老年疾病,提高老年健康水平。限食延缓衰老的机制非常复... 详细信息

限制食物(DR),广泛定义为在不会导致生物营养不良的条件下,减少20%-40%的食物摄取。目前已在多种模式生物如线虫、果蝇、鱼、啮齿类动物上进行了实验,证明限食可以有效延缓衰老以及老年疾病,提高老年健康水平。限食延缓衰老的机制非常复杂,涉及许多分子信号通路,其中机制之一是限食可以有效的抗氧化并拮抗氧化诱导发生的衰老性疾病。限食通过拮抗氧化应激,维持细胞保持在合适的氧化还原状态,减缓炎症水平,从而延长寿命。虽然目前有众多理论假设解释限食延长寿命的机理,但仍需证实和完善。本研究采用经典模式生物黑腹果蝇进行蛋白质组学测序,拟从蛋白质层面探索限食延长寿命的机制。实验组分为限食和对照组两组,在第7天和第42天采集样品,进行两次生物学重复实验。样品利用同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)进行蛋白质组学测序,采用Uniprot黑腹果蝇数据库,最终共鉴定出19730个唯一肽段,对应3662个蛋白。其中第7d限食组/对照组差异表达蛋白质共383个,上调蛋白156个,下调蛋白227个;42d限食组/对照组差异表达蛋白质共409个,上调蛋白206个,下调蛋白203个。利用生物信息学研究方法中GO、KEGG、PPI进一步对测序结果进行分析。实验结论如下:1.生物信息学分析发现,与限食作用密切相关的通路如MAPK、mTOR、IRS等通路均在本次差异蛋白分析数据中出现,在一定程度上说明测序结果可靠。2.已知限食与sirtuin调控的组蛋白乙酰化有关。限食情况下,DNA甲基化水平总体下降。在本实验GO分析结果中显示,限食除了与甲基化、乙酰化有关,还可能调控了泛素化。特别在7d的限食组与对照组比较中,泛素化并未达到显著差异程度。但在42d的限食组与对照组比较中,无论是GO分析结果还是KEGG通路富集结果都显示蛋白参与泛素化水平较高。这为限食的表观修饰作用增加了新的证据。3.实验结果表明,限食可能通过调控剪接体的活动或功能抑制疾病发生,达到提高机体健康水平的目的。差异表达蛋白质参与剪接体相关通路的水平在7d和42d显著提高,这与限食能提高每个年龄段健康水平的研究结果相符。4.在42d的限食组与对照组的KEGG富集结果中发现核黄素代谢水平显著高于对照组。在机体衰老后,核黄素在机体内的储存能力大幅下降。通过限食提高核黄素的代谢过程,从而提高年老果蝇机体内参与氧化还原反应的核黄素数量。***通路的分类研究中发现,多个差异表达蛋白质参与阿兹海默症、帕金森综合症以及慢性进行性舞蹈病三种经典老龄的神经退行性疾病的信号通路。其中差异表达蛋白质P92208在多个疾病相关通路中亦有出现。这表明P92208可能是一个限食调控疾病相关通路的关键位点。6.已有研究发现限食的效果与节律钟有关。当在果蝇身上敲除了tim和per两个生物钟关键基因以后,限食也不再有任何效果。本次试验中鉴定出两个节律钟相关蛋白M9PC85、076879。但定量结果显示,两个蛋白均未出现显著的上调或下调。这表明节律钟对限食没有直接作用。7.果蝇mTOR受体能通过HIPPO通路调节机体免疫功能。试验表明,在7d和42d的实验组与对照组比较中有十多条特异性免疫相关差异通路。限食能够提高机体免疫水平,改善机体健康水平。8.通过生物信息学研究,注意到差异通路富集与细胞骨架、微管蛋白有关的通路及差异蛋白显著。表明限食对机体健康和寿命的影响可能与细胞骨架的变化有关。

关键词：差异表达蛋白质差异蛋白同位素标记相对和绝对定量技术比较研究

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拟南芥线粒体HSP60/HSP10分子伴侣的组成与功能的初步分析

拟南芥线粒体HSP60/HSP10分子伴侣的组成与功能的初步分析

引用

作者：宋海峰西北大学

学位级别：硕士

植物作为固着的有机体,会受到各种生物与非生物的胁迫,这些胁迫会造成蛋白质稳态的破坏,从而对植株的生长和繁殖造成影响。伴侣蛋白可以帮助多种底物蛋白进行折叠与组装,使蛋白质形成正确的空间结构来行使功能,它有I型伴侣蛋白和II型伴... 详细信息

植物作为固着的有机体,会受到各种生物与非生物的胁迫,这些胁迫会造成蛋白质稳态的破坏,从而对植株的生长和繁殖造成影响。伴侣蛋白可以帮助多种底物蛋白进行折叠与组装,使蛋白质形成正确的空间结构来行使功能,它有I型伴侣蛋白和II型伴侣蛋白两种类型,线粒体分子伴侣HSP60/HSP10属于I型伴侣蛋白。在拟南芥中HSP60有三种蛋白亚基,分别为HSP60-2、HSP60-3A和HSP60-3B;以及存在两个辅助伴侣蛋白HSP10-1和HSP10-2。目前对于HSP60/HSP10功能的研究在哺乳动物体内相对较多,它们在机体参与免疫反应这一方面发挥着非常重要的作用,但是在植物体内的研究还相对较少,其作用的底物和工作机制还不清楚。因此,为了探究植物线粒体HSP60/HSP10的组成和功能,本课题鉴定了HSP60/HSP10各亚基蛋白相应的突变体,并对它们产生的表型进行初步的观察分析。主要研究结果如下:(1)本研究从ABRC突变体库获得了hsp10-1、hsp10-2、hsp60-2、hsp60-3a和hsp60-3b五种纯合突变体,与野生型相比,hsp10-1纯合突变体表现生长缓慢,莲座叶数目减少,根短,晚抽薹以及在生殖方面缺陷的表型;hsp10-2、hsp60-2、hsp60-3a和hsp60-3b纯合突变体没有明显的表型变化。(2)通过杂交实验获得了hsp60-2hsp60-3a和hsp60-3ahsp60-3b的纯合双重突变体,与野生型相比,hsp60-2hsp60-3a没有明显的表型变化,hsp60-3ahsp60-3b表现生长缓慢,根短以及晚抽薹的表型变化,hsp60-2hsp60-3b表现致死的表型变化,结合进化树及相对表达量结果表明在拟南芥中HSP60-3B在基因功能上处于主导地位,其次是HSP60-2,最后是HSP60-3A。在hsp10-1与hsp10-2杂交实验中只找到了基因型为AAbb、Aa Bb和aa BB的植株,正反交实验表明杂合Aa Bb的植株只产生Ab和a B两种非交叉型配子,不产生AB和ab交换型配子,很可能是配子发生过程中交叉互换被阻止了,从而得不到其余的基因型植株。(3)通过转基因互补实验使hsp10-1纯合突变体表型恢复至野生型水平,表明hsp10-1纯合突变体产生的表型确实是由HSP10-1这个基因造成的;并且通过亚细胞定位和GUS染色,发现HSP10-1、HSP10-2都定位于线粒体,并且在植物体的根、茎、叶、花以及幼苗中都有表达;hsp10-1、hsp10-2、hsp60-2、hsp60-3a、hsp60-3b、hsp60-2hsp60-3a、hsp60-3ahsp60-3b纯合突变体相对于野生型超氧阴离子的含量分别增加了6、1.1、1.1、1.3、2、2、3.5倍。(4)对hsp10-1纯合突变体进行RNA-seq分析,共得到1079个差异基因,与野生型植株相比,上调的有786个,下调的有293个,这些基因主要参与转录调控,蛋白折叠,氧化磷酸化,对外界刺激的响应(缺氧、缺水、氧化、盐、伤害)和激素信号传导(乙烯、脱落酸、生长素、水杨酸、油菜素类固醇、赤霉素、茉莉素)途径;在i TRAQ数据分析中,共得到1459个差异蛋白,与野生型植株相比,上调的有688个,下调的有771个,这些蛋白主要富集在RNA代谢过程,蛋白折叠,蛋白磷酸化,氧化磷酸化,对外界刺激的响应(伤害、缺氧、缺水、氧化、盐、热)和激素信号传导(脱落酸、分裂素、油菜素类固醇、水杨酸)。综上所述,共伴侣蛋白HSP10-1在这些途径中具有非常重要的作用。

关键词：伴侣蛋白HSP60 共伴侣蛋白HSP10 表型观察转录组测序技术同位素标记相对和绝对定量技术

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基于iTRAQ技术研究猪细小病毒感染ST细胞后的蛋白变化

基于iTRAQ技术研究猪细小病毒感染ST细胞后的蛋白变化

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作者：冯静湖南农业大学

学位级别：硕士

研究目的：本研究主要运用同位素标记相对和绝对定量技术(isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation, iTRAQ)和相关分子生物学方法,以期筛选并获得PPV感染后引起细胞病变和功能变化的关键蛋白,同时也为研究PPV引起母猪繁... 详细信息

研究目的：本研究主要运用同位素标记相对和绝对定量技术(isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation, iTRAQ)和相关分子生物学方法,以期筛选并获得PPV感染后引起细胞病变和功能变化的关键蛋白,同时也为研究PPV引起母猪繁殖障碍的致病机制奠定基础,并为研究病毒性疾病引起的家畜繁殖障碍研究提供新的思路。材料与方法：本实验采用PCR技术和间接免疫荧光检测PPV感染猪睾丸细胞(ST)后12 h,24 h,36 h,48 h和60 h时间段PPV VP2的表达量,确定病毒在感染细胞后病毒最佳表达时间点。在这个时间点收集感染和未感染细胞的蛋白,采用iTRAQ技术结合LC-ESI-MS/MS分析技术检测感染组与未感染组之间蛋白表达差异。进一步运用生物信息学分析,从相关差异蛋白参与的生物学过程、其细胞结构成分和分子功能分析差异蛋白的功能,并构建差异蛋白间相互作用网,获得参与PPV感染的重要蛋白。另外,分别采用实时荧光定量技术和免疫印迹验证了部分差异蛋白对应的基因水平和蛋白水,其中包括5个上调蛋白和4个下调蛋白。研究结果：PPV在感染ST细胞后在60 h检测到其VP2核酸有较高表达量；通过iTRAQ结合LC-ESI-MS/MS技术共获得27608个肽段,共计5002个蛋白；依据蛋白质丰度水平变化(定义差异倍数达到1.2倍以上为差异蛋白)共获得218个差异蛋白,其中130个为感染后下调的蛋白,88个为感染后上调的蛋白；这些差异蛋白主要与细胞的周期、生长、运动和能量代谢、细胞的骨架、胞内的内分泌以及转录翻译等密切相关；荧光定量和免疫印迹对差异蛋白的验证结果基本与iTRAQ的变化趋势一致。结论：通过本研究得到了PPV感染ST细胞的蛋白图谱及其差异表达蛋白,构建了蛋白作用网络,并获取了PPV感染ST细胞后的一些关键蛋白,但对于这些蛋白在PPV感染中的作用还需进一步的研究。

关键词：猪细小病毒同位素标记相对和绝对定量技术差异蛋白猪睾丸细胞

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基于定量蛋白质组学技术的肥胖多囊卵巢综合征患者血清差异蛋白生物信息学分析

基于定量蛋白质组学技术的肥胖多囊卵巢综合征患者血清差异蛋白生...

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作者：谢丽珍广州医科大学

学位级别：硕士

目的:多囊卵巢综合征(Polycystic Ovary Syndrome,PCOS)是青春期及育龄期女性中常见的一种内分泌异常疾病,其病理生理变化非常复杂,发病机制至今还未十分明确。肥胖是PCOS的主要临床体征之一,约30%-75%的PCOS患者存在超重或肥胖,脂肪细... 详细信息

目的:多囊卵巢综合征(Polycystic Ovary Syndrome,PCOS)是青春期及育龄期女性中常见的一种内分泌异常疾病,其病理生理变化非常复杂,发病机制至今还未十分明确。肥胖是PCOS的主要临床体征之一,约30%-75%的PCOS患者存在超重或肥胖,脂肪细胞在内分泌系统调节功能中扮演着重要角色,推测肥胖PCOS患者与正常体重的PCOS患者的发病机制可能有差异。同位素相对标记与绝对定量技术(Isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)是一项新兴的定量蛋白质组学技术,本研究旨在利用iTRAQ技术对肥胖型与非肥胖型PCOS患者进行血清蛋白质组学研究,探讨PCOS相关差异表达蛋白与发病机制的关系,为PCOS的病因学研究和寻找诊断标志物等提供更多的线索。方法:选取来自广州医科大学附属第三医院2017年01月至2017年05月的妇科门诊患者和正常体检的健康女性,共64例,包括肥胖PCOS患者16例,非肥胖PCOS患者16例;正常对照女性16例,肥胖正常对照女性16例。收集各组血清,血清去除高丰度蛋白,对其滤出液进行蛋白还原烷基化及胰蛋白酶酶解,之后进行iTRAQ试剂标记,结合色谱分离技术体系进行蛋白鉴定和定量分析,最后对获得的差异蛋白进行生物信息学分析。结果:经过筛选鉴定发现,非肥胖PCOS组和正常对照组相比有93个差异表达蛋白,差异倍数排名前两位分别是人非红细胞血影蛋白-β4(SPTBN4)、钙蛋白酶-2(CAPN2);肥胖PCOS组和正常对照组相比有179个差异表达蛋白,差异倍数排名前两位分别是驱动蛋白家族成员-15(KIF15)、钙蛋白酶-2(CAPN2);与非肥胖PCOS组相比,肥胖PCOS组有67个差异表达蛋白质,差异倍数最大的是KIF15;与肥胖正常组相比,肥胖PCOS组共鉴定得到10个差异蛋白,差异倍数最大的是KIF15。细胞组分分析显示:肥胖PCOS与非肥胖PCOS的差异蛋白主要存在于细胞外间隙;分子功能分析显示:肥胖PCOS与非肥胖PCOS的差异蛋白主要参与蛋白结合;生物学过程分析显示:肥胖PCOS与非肥胖PCOS的差异蛋白主要参与创伤反应、防御反应等应激反应过程。KEGG信号通路分析显示:非肥胖PCOS组参与的信号通路有70种,肥胖PCOS组参与的信号通路有158种。其中两组共同参与的显著性信号通路(P<0.05)是补体和凝血级联信号通路。肥胖PCOS组分别与非肥胖PCOS组和肥胖正常对照组比较,其差异蛋白参与的信号通路涉及多个糖代谢通路的异常。结论:1.本研究采用iTRAQ定量蛋白质组学技术对PCOS患者进行血清蛋白质轮廓扫描,成功建立了肥胖PCOS与非肥胖PCOS的血清差异表达蛋白谱。***患者的血清差异蛋白主要涉及蛋白水解、防御反应、创伤反应、蛋白激活级联、急性炎症反应、补体和凝血级联信号通路途径,提示慢性低度炎症参与了PCOS的发生与发展。肥胖PCOS组参与的通路途径有158种,而非肥胖PCOS组参与的通路途径只有70种,提示肥胖PCOS与非肥胖PCOS具有不同的调控机制。其中,KIF15是与肥胖型PCOS相关的血清差异蛋白;CAPN2是潜在的PCOS候选标记物。

关键词：多囊卵巢综合征蛋白质组学同位素标记相对和绝对定量技术

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