检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：叶欣悦贵州大学

学位级别：硕士

番茄（Solanum lycopersicum L.）是世界第一大蔬菜作物,在生产上不良环境及营养限制加速植株衰老,引起产量和品质下降。褪黑素（melatonin,MT）是一种可在许多植物细胞内检测到的色胺类化合物,近年来越来越多的研究表明,MT的外源性应... 详细信息

番茄（Solanum lycopersicum L.）是世界第一大蔬菜作物,在生产上不良环境及营养限制加速植株衰老,引起产量和品质下降。褪黑素（melatonin,MT）是一种可在许多植物细胞内检测到的色胺类化合物,近年来越来越多的研究表明,MT的外源性应用以及内源MT含量水平的上升可以增强植物对各种逆境胁迫的抗性,但有关MT合成关键酶相关编码基因SlCoMT1在番茄衰老过程中的作用及其潜在的分子机制仍然鲜为人知,相关研究对作物品质改良和产量提高具有十分重要的意义。本论文以‘Micro-tom’番茄为实验材料,研究了外源MT对黑暗诱导番茄衰老的生理生化指标影响;克隆SlCoMT1基因并进行生物信息学分析和时空表达模式分析;利用CRISPR/Cas9技术构建了SlCoMT1基因缺失突变体comt1,研究了离体培养和限根栽培对番茄功能叶的衰老效应;并对comt1的花器官衰老效应以及果实成熟效应进行了分析评价。主要研究结果如下:1.外源MT预处理通过提高抗氧化酶活性、非酶类抗氧化物的积累、同时降低MDA、H2o2含量及·o2-产生速率,延缓了黑暗诱导的番茄功能叶片的衰老。***1在番茄叶片、花器官和果实发育和衰老进程中的表达模式,以及内源MT含量水平变化并不相同。3.番茄离体叶片的SlCoMT1表达受到黑暗条件的抑制,而茉莉酸处理则高度诱导SlCoMT1的表达。4.黑暗条件下离体培养comt1突变体的的叶片,其衰老相关基因（SAGs）和叶绿素降解相关基因显著高于WT,而限根栽培对comt1的叶片诱导衰老效应并不明显。***1突变体的发育表型与WT无显著差异,而comt1的花瓣闭合时间则显著低于WT,其花柄脱落率是WT的2.33倍。尽管comt1果实表型无显著变化,但离体培养的comt1果实表现出晚熟的特性,表明SlCoMT1基因也参与了花器官的发育以及果实的成熟衰老过程。

关键词：番茄衰老褪黑素咖啡酸-o-甲基转移酶 SlCoMT1 comt1突变体

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川芎咖啡酸-o-甲基转移酶基因密码子偏好性与进化分析

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应用与环境生物学报 2020年第4期26卷 894-901页

作者：严子成蒋瑞平梁浩伟陈渏周嘉裕廖海西南交通大学生命科学与工程学院成都610031

咖啡酸-o-甲基转移酶(CoMT)是苯丙烷类代谢途径中的一个关键酶,研究其密码子偏好性对开展该基因的异源表达与分子调控研究有重要指导意义.利用Codon W、EMBoSS、SPSS与origin等在线服务器及软件,首先分析川芎等不同植物来源CoMT基因的... 详细信息

咖啡酸-o-甲基转移酶(CoMT)是苯丙烷类代谢途径中的一个关键酶,研究其密码子偏好性对开展该基因的异源表达与分子调控研究有重要指导意义.利用Codon W、EMBoSS、SPSS与origin等在线服务器及软件,首先分析川芎等不同植物来源CoMT基因的密码子偏好性,随后以川芎CoMT为重点,比较其与大肠杆菌、酵母、拟南芥与烟草等模式生物的密码子使用频率.结果表明,单子叶植物CoMT基因的密码子偏好性较强,而低等植物与双子叶植物CoMT基因的密码子偏好性较弱.分析CoMT基因密码子偏好性与核酸序列,发现亲缘关系较近的物种不仅具有较高的核酸序列相似度,并且具有相似的密码子偏好性,推测这种现象是由于密码子偏好性的形成主要受到自然选择的影响.CoMT作为一个起源古老的基因,分析其密码子偏好性对了解植物进化关系有一定作用.川芎CoMT体现出与其他双子叶植物相近的密码子偏好性,其GC含量与GC3s均小于50%,偏好以A/T编码,偏好性极强(RSCU>2)的密码子有7个,ENc为51.38,整体密码子偏好性较弱.与大肠杆菌相比较,酵母可能是其更好的外源表达系统.较之拟南芥,烟草更合适作为川芎CoMT的遗传转化受体.本研究表明拟南芥、烟草都可作为Lc CoMT遗传转化受体系统的候选;并且烟草CoMT与Lc CoMT在进化树上显示出较近的亲源关系,所以烟草可能是LCCoMT相对更好的遗传转化受体;结果可为CoMT基因的遗传进化研究、川芎CoMT的功能验证及转基因植物培育等奠定理论基础.(图4表2参33)

关键词：川芎咖啡酸-o-甲基转移酶密码子偏好性进化分析外源宿主

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植物咖啡酸-o-甲基转移酶的研究进展

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生物工程学报 2022年第6期38卷 2187-2200页

作者：李元玉陈万生肖莹福建中医药大学药学院福建福州350122 上海中医药大学中药资源与生物技术中心上海201203 海军军医大学附属长征医院医学保障中心上海200003

单木质素醇(H型、G型和S型)是构成植物木质素和木脂素的基本单元,其组成的不同直接决定木质素和木脂素的化学多样性和生物活性差异。咖啡酸-o-甲基转移酶(caffeic acid o-methyltransferase, CoMT)可催化苯丙素类化合物羟基上氧原子的... 详细信息

单木质素醇(H型、G型和S型)是构成植物木质素和木脂素的基本单元,其组成的不同直接决定木质素和木脂素的化学多样性和生物活性差异。咖啡酸-o-甲基转移酶(caffeic acid o-methyltransferase, CoMT)可催化苯丙素类化合物羟基上氧原子的甲基化,在不同类型单木质素醇的构成中起决定作用,是木质素和木脂素生物合成途径的关键酶。2010年的相关综述主要对CoMT的基因特征和在木质素生物合成中的调控作用作了介绍,文中聚焦了近十多年来CoMT的最新研究进展,从基因特征、表达特征、结构特征和调控作用几个方面进行全面综述,并对CoMT的研究和应用前景进行展望。

关键词：咖啡酸-o-甲基转移酶木质素木脂素单木质素醇

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当归咖啡酸-o-甲基转移酶基因克隆和序列分析

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中草药 2016年第7期47卷 1180-1186页

作者：雒军王引权温随超夏琦荔淑楠王振恒甘肃中医药大学甘肃兰州730000

目的克隆当归Angelica sinensis咖啡酸-o-甲基转移酶(caffeic acid o-methyltransferases,CoMT)编码基因全长c DNA,并对序列进行生物信息学分析。方法提取当归叶片总RNA为c DNA合成模板,利用同源克隆结合c DNA末端快速扩增(RACE)技术克... 详细信息

目的克隆当归Angelica sinensis咖啡酸-o-甲基转移酶(caffeic acid o-methyltransferases,CoMT)编码基因全长c DNA,并对序列进行生物信息学分析。方法提取当归叶片总RNA为c DNA合成模板,利用同源克隆结合c DNA末端快速扩增(RACE)技术克隆当归CoMT全长c DNA,并利用NCBI、Ex PASy网站上的Blast N、Blast P、oRF Finder、Compute PI/Mw、Prot Scale、PRoSITE、SWISS-MoDEL等序列在线分析工具和MEGA、DNAMAN生物信息学软件对序列进行分析。结果获得CoMT全长c DNA序列,并在Gen Bank注册(登录号KP188587)。序列分析表明,克隆的c DNA全长为1 436 bp,其中包括5’-UTR(76 bp)和3’-UTR(362 bp),含有1个1 098 bp的完整开放阅读框(opening reading frame,oRF),编码365个氨基酸的多肽链;预测蛋白质相对分子质量为40 230,理论等电点(p I)为5.43;无信号肽,具有典型的II型氧甲基转移酶结构域SAM_oMT_II。结论首次克隆当归CoMT基因全长c DNA,为当归CoMT基因功能研究和当归阿魏酸生物合成与调控的机制研究奠定基础。

关键词：当归咖啡酸-o-甲基转移酶基因克隆生物信息学分析信号肽

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丹参咖啡酸-o-甲基转移酶基因(SmCoMT1)的克隆及其分析

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植物研究 2012年第4期32卷 437-443页

作者：宋银王东浩吴锦斌周露王国栋王喆之药用资源与天然药物化学教育部重点实验室西北濒危药材资源开发国家工程实验室陕西师范大学生命科学学院西安710062

依据丹参转录组数据库得到的咖啡酸-o-甲基转移酶基因序列设计特异性引物,采用RT-PCR方法从丹参分离得到一个新的CoMT基因,命名为SmCoMT1(GenBank注册号为JF693491)。该基因cDNA全长1 158 bp,包含一个长为1 095 bp的开放阅读框,编码364... 详细信息

依据丹参转录组数据库得到的咖啡酸-o-甲基转移酶基因序列设计特异性引物,采用RT-PCR方法从丹参分离得到一个新的CoMT基因,命名为SmCoMT1(GenBank注册号为JF693491)。该基因cDNA全长1 158 bp,包含一个长为1 095 bp的开放阅读框,编码364个氨基酸。SmCoMT1 gDNA序列长2 275 bp,包含4个外显子和3个内含子。序列分析结果表明,SmCoMT1编码的多肽具有CoMT的序列保守元件,与同科植物罗勒CoMT编码的多肽高度同源,同源性达到89%。系统进化树分析表明,SmCoMT1与双子叶植物的CoMT亲缘关系较近。qRT-PCR结果表明,SmCoMT1基因在丹参不同组织器官中差异表达,其中茎中的表达量最高,并且其表达受茉莉酸甲酯和病原菌的诱导,显示SmCoMT1基因可能在植物防御反应中发挥作用。

关键词：丹参咖啡酸-o-甲基转移酶基因克隆 qRT—PCR

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川芎咖啡酸-o-甲基转移酶基因的克隆及序列分析

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天然产物研究与开发 2016年第10期28卷 1505-1509页

作者：朱建全向缅李洋洋俞继华张赶王万军廖海周嘉裕西南交通大学生命科学与工程学院成都610031

克隆川芎(Ligusticum chuanxiong Hort)咖啡酸-o-甲基转移酶(CoMT)基因并做序列分析。采用RT-PCR方法,以新鲜的川芎嫩叶c DNA为模板,克隆出川芎CoMT基因的c DNA序列。此基因全长1328 bp,编码360个氨基酸。将得到的序列提交Gen Bank,序... 详细信息

克隆川芎(Ligusticum chuanxiong Hort)咖啡酸-o-甲基转移酶(CoMT)基因并做序列分析。采用RT-PCR方法,以新鲜的川芎嫩叶c DNA为模板,克隆出川芎CoMT基因的c DNA序列。此基因全长1328 bp,编码360个氨基酸。将得到的序列提交Gen Bank,序列号为KU942388。此川芎CoMT具有植物o-甲基转移酶家族特征性的功能结构域,与中粒咖啡、牵牛花CoMT的氨基酸序列同源性分别为70%、69%,推测其能够催化咖啡酸的氧甲基化反应。该川芎CoMT基因的成功克隆为下一步活性验证及利用生物技术来生产阿魏酸奠定坚实基础。

关键词：川芎咖啡酸-o-甲基转移酶克隆序列分析

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咖啡酸-o-甲基转移酶在砂糖橘与黄龙病菌互作中的功能研究

咖啡酸-O-甲基转移酶在砂糖橘与黄龙病菌互作中的功能研究

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中国植物病理学会2024年学术年会

作者：郭斌崔一平黄峰宋晓兵广东省农业科学院植物保护研究所农业农村部华南果蔬绿色防控重点实验室广东省植物保护新技术重点实验室

砂糖橘是一种重要的柑橘类水果,在我国水果生产中占据重要地位。然而黄龙病作为柑橘的毁灭性病害,严重影响砂糖橘的产量和品质。解析砂糖橘与黄龙病菌的互作机理,对防控黄龙病具有重要意义。咖啡酸-o-甲基转移酶(caffeic acid o-methylt... 详细信息

砂糖橘是一种重要的柑橘类水果,在我国水果生产中占据重要地位。然而黄龙病作为柑橘的毁灭性病害,严重影响砂糖橘的产量和品质。解析砂糖橘与黄龙病菌的互作机理,对防控黄龙病具有重要意义。咖啡酸-o-甲基转移酶(caffeic acid o-methyltransferase,CoMT)是木质素合成途径的关键基因,有研究显示部分植物CoMT还可催化褪黑素的形成。本研究对健康和染病砂糖橘的基因表达分析发现,感染黄龙病后砂糖橘咖啡酸-o-甲基转移酶(CrCoMT)表达量升高。通过转基因技术获得稳定表达CrCoMT的转基因烟草株系,激素分析显示过表达CrCoMT可以增加烟草内源褪黑素含量。同时经flg22处理后,过表达CrCoMT烟草的活性氧水平显著高于野生型烟草,说明CrCoMT可能通过催化褪黑素的合成,调控植物防卫反应。为明确CrCoMT基因对黄龙病菌侵染的响应机制,笔者从砂糖橘基因组中克隆获得CrCoMT基因启动子序列,经酵母单杂交和凝胶迁移实验(EMSA)确定CrCoMT基因启动子区域与砂糖橘转录因子CrBPC2直接结合。在砂糖橘叶片内瞬时过表达CrBPC2,可以提高CrCoMT基因转录水平。因此,笔者推测CrCoMT表达受转录因子CrBPC2调控,在此基础上拟进一步探索CrBPC2对CrCoMT表达的调控机制,为解析砂糖橘与黄龙病菌互作机理提供新的理论基础。

关键词：咖啡酸-o-甲基转移酶柑橘与黄龙病菌互作防卫反应表达调控

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川芎咖啡酸-o-甲基转移酶的结构与功能研究

川芎咖啡酸-O-甲基转移酶的结构与功能研究

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作者：严子成西南交通大学

学位级别：硕士

咖啡酸-o-甲基转移酶(Caffeicacid-o-methyltransferase，CoMT)是植物苯丙烷代谢途径的一个关键酶，参与了植物木质素的合成。在实验室的前期研究中，已经成功克隆获得川芎咖啡酸-o-甲基转移酶(Ligusticum chuanxiong caffeic acid-o-me... 详细信息

咖啡酸-o-甲基转移酶(Caffeicacid-o-methyltransferase，CoMT)是植物苯丙烷代谢途径的一个关键酶，参与了植物木质素的合成。在实验室的前期研究中，已经成功克隆获得川芎咖啡酸-o-甲基转移酶(Ligusticum chuanxiong caffeic acid-o-methyltransferase ， LcCoMT )基因并进行了功能鉴定。近期，实验室还分别解析了LcCoMT-S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)和LcCoMT-S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)的晶体结构。本论文以LcCoMT-SAM和LcCoMT-SAH晶体结构为基础，对LcCoMT开展结构分析与功能研究，为认识LcCoMT的酶促反应机制及理性改造奠定基础。研究结果报道如下：　　LcCoMT在水溶液中以同源二聚体的形式存在，其中二聚化区域主要是由每个亚基中靠近N末端的148个氨基酸残基组成的α1-α8以及β1相互缠绕在一起形成的。二聚化区域存在大量的氢键和疏水作用，这些分子间作用力维持了二聚体的稳定性。LcCoMT的SAM/SAH结合口袋主要由Ser13、Thr213、Asp205、Asp230、Gly249、Leu231、Asp250、Met251、Ile266、Trp265与Lys264等氨基酸残基构成。这些氨基酸处于β3-α12-β4-α13-β5中，呈现出罗斯曼折叠。通过分子对接的方法，得到了LcCoMT-SAM-Caffeicacid三元复合结构，发现咖啡酸结合口袋由Asn323、Phe162、His322、His268、Met319、Ile315、Ile318、Met129、His314、Leu126、Met179、Phe175、Asp269、Asn130以及来自相邻单体的Ser27组成。通过对酶活性位点的分析，推测其催化机制为：SAM先进入底物口袋，由于诱导契合作用，导致了咖啡酸结合口袋的形成，之后咖啡酸进入底物口袋与酶结合。His268引起咖啡酸3-oH去质子化，形成阴离子中间体。SAM上不稳定的甲基转移到3号位氧负离子上，形成阿魏酸。　　根据LcCoMT的苯丙烷衍生类底物口袋的分析，发现该口袋的疏水性较强，推测LcCoMT对非极性分子的亲和力更高，并且该酶的底物选择性主要由结合丙烯基部分的疏水腔决定。在该疏水腔的作用下，底物丙烯基上所接基团的极性越弱，LcCoMT对其催化活性越强。推测LcCoMT对咖啡酸甲酯应该有较高的催化活性。随后，论文测定了LcCoMT催化咖啡酸和咖啡酸甲酯的动力学参数，其Km值分别为9.893×10-5M和2.643×10-5M，Kcat值分别为0.093s-1和0.113s-1，从而验证了最初的推测，这部分结果为阿魏酸甲酯的合成提供了一条可行性方法。　　论文进一步发现Ile318残基在底物结合中发挥了重要作用，并可能对酶的底物选择性有很大影响。由此，分别构建了pET28a(+)-LcCoMT-I318N和pET28a(+)-LcCoMT-I318T两种载体，并通过大肠杆菌Rosetta成功表达获得LcCoMT-I318T和LcCoMT-I318N两种蛋白质。通过酶活检测，发现LcCoMT-I318N失去对咖啡酸和咖啡酸甲酯的催化活性，可能原因是Asn有较强的亲水性，引起水分子大量进入疏水腔，破坏了疏水腔的结构，导致底物分子不能结合到正确的反应位点。相比于野生型LcCoMT，LcCoMT-I318T对咖啡酸甲酯的催化效率显著提高，两者Kcat/Km值分别为4287.270M-1·s-1和9940.000M-1·s-1，活性变为野生型LcCoMT的2.32倍。而LcCoMT-I318T对咖啡酸的催化活性则变弱了，两者Kcat/Km值分别为943.223M-1·s-1和393.710M-1·s-1，活性变为野生型LcCoMT的0.42倍。该现象的原因可能是：Thr的羟基与咖啡酸的羧基之间形成氢键，阻碍了咖啡酸结合到适宜的位点，使得LcCoMT-I318T对咖啡酸的催化活性减弱。而咖啡酸甲酯的酯基极性很弱，不易与Thr318形成氢键;另外，Thr侧链比Ile侧链小，减小了咖啡酸甲酯进入疏水腔的空间位阻。这些因素使得LcCoMT-I318T对咖啡酸甲酯的催化活性增强。这部分结果为LcCoMT的理性改造提供了一个重要的候选位点。

关键词：咖啡酸-o-甲基转移酶结构生物学阿魏酸甲酯底物选择性酶改造

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岷江百合灰霉菌诱导咖啡酸-o-甲基转移酶（LrCoMT）基因克隆与功能分析

岷江百合灰霉菌诱导咖啡酸-O-甲基转移酶（LrCOMT）基因克隆与功...

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作者：刘萱重庆三峡学院

学位级别：硕士

百合是集药赏食作用于一体的重要花卉植物,作为目前销量最高的五大鲜切花之一,具有较高的经济价值。由于灰霉病的严重侵染,严重影响百合生产销售,造成巨大的经济损失。岷江百合作为一种野生百合资源,因其对干旱、真菌和病毒的良好抗性... 详细信息

百合是集药赏食作用于一体的重要花卉植物,作为目前销量最高的五大鲜切花之一,具有较高的经济价值。由于灰霉病的严重侵染,严重影响百合生产销售,造成巨大的经济损失。岷江百合作为一种野生百合资源,因其对干旱、真菌和病毒的良好抗性而闻名,它的抗逆基因也继而被关注并运用到培育抗病新品种的研究中。目前,关于岷江百合抗病基因的克隆与功能表达分析的研究报道相对较少,特别是在木质素生物合成途径中涉及的抗灰霉病相关基因。本研究利用灰霉菌孢子侵染岷江百合叶片并进行转录组测序,筛选克隆获得差异表达的LrCoMT1和LrCoMT2基因,通过生物信息学分析、亚细胞定位、q RT-PCR、RT-PCR、构建过表达载体和反义表达载体、拟南芥遗传转化、百合叶片瞬时转化以及木质素含量测定等方式对其表达和功能进行初步分析,通过定量分析LrCoMT1和LrCoMT2过表达对木质素生物合成途径及SA/Me JA抗病信号通路标志基因的表达情况,从而阐明岷江百合LrCoMT1和LrCoMT2基因在灰霉菌应答过程中的生物学功能并初步探究其作用机制。主要研究结果如下: ***1和LrCoMT2蛋白结构均以无规则卷曲为主,占比分别为67.64%和63.23%。三级结构分析中,LrCoMT1蛋白以序列同一性为38.17%的（S）-去甲乌药碱6-o-甲基转移酶为模板进行同源建模,LrCoMT2蛋白以序列同一性为54.44%的o-甲基转移酶为模板,并均以2聚体结构形式发挥蛋白功能。保守结构域预测显示LrCoMT1蛋白含保守结构域dimerization2 super family和Ado Met＿MTases super family,LrCoMT2蛋白于含保守结构域dimerization和Ado Met＿MTases super family。 2.通过多序列比对和进化树分析发现,LrCoMT1基因不仅与CoMT家族相关,还与At ASMT1基因的进化过程相近,而LrCoMT2基因与CoMT家族以及At CoMT1的进化关系相近;同时通过荧光定量分析发现岷江百合LrCoMT1和LrCoMT2基因在灰霉菌孢子处理4 h后的表达水平显著上升;由此推测LrCoMT1基因和LrCoMT2基因均可能通过木质素生物合成途径抵御灰霉菌的侵染,而LrCoMT1基因可能还参与其他途径。 3.通过对岷江百合叶片进行外源激素SA和Me JA胁迫处理,分析LrCoMT1和LrCoMT2基因在岷江百合上的诱导表达情况。结果表明,LrCoMT1基因对外源激素Me JA的响应相对于SA处理更加明显,在Me JA处理24 h后,LrCoMT1基因表达水平显著上调并升至峰值;而LrCoMT2基因对外源激素SA处理相较于Me JA处理的表达量上调更加明显,在SA处理12 h后达到峰值。LrCoMT1和LrCoMT2基因在岷江百合不同组织中的表达情况显示,两个基因均在老茎中的表达量最高,其次为外鳞茎,在根部中的表达量最低。LrCoMT2基因在亚细胞定位结果表明,LrCoMT2-GFP融合蛋白的荧光信号仅在细胞核和细胞膜中进行表达。 4.通过构建LrCoMT1和LrCoMT2基因的过表达载体,并利用蘸花法获得异源过表达的转基因拟南芥,筛选至T3代纯和的转基因植株经GUS染色鉴定后均呈蓝色,RT-PCR扩增显示出明亮的条带。通过木质素组织化学染色以及含量测定结果显示LrCoMT1和LrCoMT2的过表达转基因拟南芥的木质素沉积均明显高于野生型拟南芥,通过表型观察发现转LrCoMT1基因拟南芥出现叶片卷曲的情况,而转LrCoMT2基因拟南芥叶片无明显表型。 5.经灰霉菌侵染后,过表达LrCoMT1和LrCoMT2基因的转基因拟南芥叶片和瞬时过表达的百合叶片的侵染面积均明显小于对照组,而瞬时反义表达后的百合叶片对灰霉菌的抗性能力显著降低。以上结果表明,过表达LrCoMT1和LrCoMT2基因可增强植株抵御灰霉菌侵染的能力。 6.通过荧光定量分析LrCoMT1和LrCoMT2基因在木质素生物合成途径中的表达情况,结果显示,转LrCoMT1基因拟南芥株系对木质素生物合成途径中多个相关基因明显上调,其中At4CL1和At CCR1基因上调最为显著,而转LrCoMT2基因拟南芥株系对木质素生物合成途径中At PAL1和At C4H基因上调最为明显,其次为At4CL1、At C3H、At CCR1基因。 7.转LrCoMT1和LrCoMT2基因拟南芥在SA/Me JA激素抗病途径中的表达情况显示,转LrCoMT1基因拟南芥株系对SA和Me JA途径基因均无明显影响,转LrCoMT2基因拟南芥对Me JA途径中的At VSP1和At PDF1.2基因显著上调,而对SA途径基因的影响不明显。本研究筛选出对灰霉菌侵

关键词：岷江百合咖啡酸-o-甲基转移酶灰霉菌木质素生物合成

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川芎咖啡酸-o-甲基转移酶（LcCoMT）的功能鉴定与应用研究

川芎咖啡酸-O-甲基转移酶（LcCOMT）的功能鉴定与应用研究

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作者：陈安琪西南交通大学

学位级别：硕士

苯丙烷代谢途径是植物次生代谢的重要途径,其产物包括木质素,类黄酮和其他次生代谢产物。木质素和类黄酮等化合物作为植物细胞壁的重要组成成分,广泛参与植物耐受胁迫的生理过程。因此开展苯丙烷代谢途径中相关酶及其编码基因的功能与... 详细信息

苯丙烷代谢途径是植物次生代谢的重要途径,其产物包括木质素,类黄酮和其他次生代谢产物。木质素和类黄酮等化合物作为植物细胞壁的重要组成成分,广泛参与植物耐受胁迫的生理过程。因此开展苯丙烷代谢途径中相关酶及其编码基因的功能与应用研究,不仅能够更清晰地认识到相关产物的合成路线,还能够为酶的合理改造、基因表达调控与转基因植物的培育奠定理论基础。川芎(Ligusticum chuanxiong Hort)作为我国中医传统药物中的常用药物和四川省的道地药材,有活血行气、祛风止痛的功效。其中木质素前体物:阿魏酸是其指标成分和主要活性成分。在阿魏酸的生物合成中必须进行两个甲基化步骤,其中咖啡酸-o-甲基转移酶(caffcie acid o-methyltransferase,CoMT)作为此途径中重要的甲基化酶,负责丁香基木质素单元的前体芥子醇生物合成中的催化咖啡酸合成阿魏酸的过程。实验室前期还发现CoMT不仅可以对苯丙烷底物咖啡酸产生催化作用,还可以对其衍生物咖啡酸甲酯产生催化作用。在实验室前期的研究中已成功解析了川芎咖啡酸-o-甲基转移酶(Ligusticum chuanxiong caffcie acid o-methyltransferase,LcCoMT)的三维晶体结构(LcCoMT/SAM晶体结构与LcCoMT/SAH晶体结构)。本论文以此为基础,对LcCoMT开展理论与应用性研究,为系统认识LcCoMT的功能及酶促反应机制有更深刻的认识。研究成果如下:(1)对拟南芥与川芎等17个不同物种的CoMT成员开展基因组学分析,旨在认识CoMT的基本结构、系统发育模式与可能的调控机制。结果显示:拟南芥中有17个CoMT家族成员,其基因编码300～400个氨基酸,其中甘氨酸和缬氨酸含量偏高;分子量约20 k D,理论等电点均小于7;二级结构中多为α-螺旋和无规则卷曲;系统进化树显示,CoMT基因家族基本特征形成于单双子叶植物分离前。17种物种CoMT氨基酸的保守基序分析得出10种不同的保守基序,其中motif1,motif2的保守性较高。这将为LcCoMT后续的相关研究奠定理论与技术基础。(2)采用分子模拟方法获得LcCoMT/SAM/caffeic acid与LcCoMT/SAH/ferulic acid的三维结构,并筛选和验证关键氨基酸残基。结果显示:Ser183可能是其关键氨基酸残基,LcCoMT-S183A突变体对咖啡酸的催化活性低于LcCoMT-WT野生型,进而推测Ser与SAH的结合会影响其催化活性。抑制活性实验表明:SAH的逐渐增加会影响突变体蛋白的活性,却不会影响野生型蛋白的活性,表明183位的Ser可能有防止逆反应发生且保护底物正向催化的功能。这部分内容可以帮助我们更清晰地认识到LcCoMT的催化机制。(3)成功设计并优化了含LcCoMT的重组大肠杆菌的全细胞催化合成阿魏酸的摇瓶发酵参数,通过正交实验探究出苯丙烷底物(咖啡酸/咖啡酸甲酯)最佳的参数条件。结果表明,催化咖啡酸合成阿魏酸的最佳参数条件为:诱导时间18 h、IPTG浓度95.32mg/L、诱导温度20℃。催化咖啡酸甲酯合成阿魏酸甲酯的最佳参数条件为:诱导时间16h、IPTG浓度95.32 mg/L、诱导温度30℃。这部分的研究可以为以后LcCoMT重组大肠杆菌的发酵生产提供必要的技数参数,为以后阿魏酸的生产和应用提供一定的研究基础,也为阿魏酸的大规模应用提供了可能性。(4)通过转LcCoMT基因拟南芥的培育,旨在认识LcCoMT基因在植物体内的功能。结果如下:成功构建了p Cambia2301-LcCoMT重组质粒,利用农杆菌介导法转化拟南芥,并获得转基因拟南芥阳性植株。为下一步研究植物抗逆性能和优良育种准备了植物材料并奠定了基础。(5)C3H(对香豆酸酯-3-羟化酶)和CoMT作为苯丙酸代谢途径中的关键限速酶,通过C3H,CoMT两个基因的融合,得到C3H-CoMT的融合蛋白,可大幅度缩短对香豆酸合成阿魏酸的进程,从而提高此途径合成阿魏酸的反应效率。本研究成功构建p ET28a-C3H-CoMT融合基因重组表达载体,并对C3H-CoMT融合蛋白的表达进行条件探索及优化。此技术可以缩短该反应的进程,从而提高CoMT催化合成阿魏酸的效率。

关键词：苯丙氨酸代谢途径咖啡酸-o-甲基转移酶阿魏酸基因功能应用研究

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