检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：樊隆曾浩吴政宪 211100 江苏省南京市江宁科学园雍熙路28号

提供了一种哺乳动物表达系统使用的高表达载体，其包括1)hCMV增强子序列；2)hFerl启动子序列；3)chEF1a 5'非翻译区序列；以及4)SV40多聚腺苷酸化信号序列。还提供了筛选最佳表达调控元件组合的方法。

标准号: CN114901828A

关键词：多聚腺苷酸化信号序列哺乳动物表达系统表达调控元件非翻译区序列启动子序列增强子序列高表达筛选

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猫细小病毒嵌合抗体基因在CHO-K1细胞中的稳定表达及其特性分析

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中国预防兽医学报 2021年第12期43卷 1318-1323页

作者：王文静薛雨佳陈慧宇姚楠刘明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为降低鼠源单克隆抗体(MAb)在猫体内引起的免疫原性,本研究针对猫细小病毒(FPV)制备具有猫源抗体恒定区基因的鼠-猫嵌合抗体。本研究首先克隆具有FPV中和活性的MAb(4F6)的重、轻链可变区基因及猫天然抗体(NAb)重、轻链恒定区基因,通过融... 详细信息

为降低鼠源单克隆抗体(MAb)在猫体内引起的免疫原性,本研究针对猫细小病毒(FPV)制备具有猫源抗体恒定区基因的鼠-猫嵌合抗体。本研究首先克隆具有FPV中和活性的MAb(4F6)的重、轻链可变区基因及猫天然抗体(NAb)重、轻链恒定区基因,通过融合PCR获得鼠-猫重组重、轻链基因片段(C_(H)/C_(L)),构建嵌合抗体表达载体(pMC-C_(H)、pMC-C_(L)),并经菌落PCR鉴定正确后转染CHO-K1细胞,并使用100μg/mL博来霉素(Zeocin)筛选,经有限稀释法将其克隆纯化后经双抗体夹心ELISA与western blot筛选出同时表达鼠-猫重组重、轻链基因的细胞株并命名为CHO-MC,将CHO-MC上清中表达的嵌合抗体纯化后调整浓度为1 mg/mL,间接ELISA检测嵌合抗体的效价,并分析其对病毒感染细胞的中和活性。结果表明,经SDS-PAGE检测鼠-猫嵌合抗体重链和轻链大小分别为55 ku和25 ku,western blot显示鼠源恒定区替换为猫源NAb的恒定区,双抗夹心ELISA显示CHO-MC细胞系在传代至15代仍能够稳定表达嵌合抗体,间接免疫荧光试验显示该嵌合抗体能够与抗猫IgG和FPV特异性结合,ELISA及中和效价分别为1:1280(0.78μg/mL)和1:16(62.5μg/mL)。本研究首次通过哺乳动物细胞表达系统表达了FPV的嵌合抗体,对治疗FPV抗体类药物的研究具有重要指导意义。

关键词：基因工程嵌合抗体猫细小病毒哺乳动物表达系统

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SARS冠状病毒与H5N1型禽流感病毒致病机理的研究

SARS冠状病毒与H5N1型禽流感病毒致病机理的研究

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作者：王洪亮中国协和医科大学

学位级别：博士

近年来,由于哺乳动物细胞表达系统得到越来越广泛的应用,其优点是表达的蛋白质结构正确,且糖基化位点与天然蛋白相似。但哺乳动物细胞表达系统的一个最大瓶颈是产量较低。为了解决这一问题,本论文对几种重要蛋白质的编码序列进行了优化... 详细信息

近年来,由于哺乳动物细胞表达系统得到越来越广泛的应用,其优点是表达的蛋白质结构正确,且糖基化位点与天然蛋白相似。但哺乳动物细胞表达系统的一个最大瓶颈是产量较低。为了解决这一问题,本论文对几种重要蛋白质的编码序列进行了优化,并将编码序列连接到强表达载体上,转染哺乳动物细胞进行表达,发现所有蛋白质都能够正确表达,证实了序列优化方法的可行性。为了验证序列优化对蛋白表达水平的影响,我们比较了几种蛋白质的表达情况,发现经优化的序列蛋白质表达比未经优化的序列表达能力有明显的提高。而恒定表达细胞株的构建使持续获得高表达量的蛋白质成为可能。为了方便进行蛋白纯化,我们在载体上添加了CD5L引导肽序列,这可以增强蛋白的分泌能力,另外还添加了human Fc标签,可以方便的使用Protein A亲和层析柱进行蛋白富集与纯化。此外,为了能够得到不含标签的蛋白质,目的蛋白与Fc标签之间插入了TEV酶切位点。序列的优化、载体的改进及恒定表达细胞株的构建为获得高产量,高纯度的蛋白质奠定了基础。 SARS-CoV进入细胞机制的研究导致严重急性呼吸综合征(SARS)世界性爆发流行的病原体是一种新型的冠状病毒:SARS冠状病毒(SARS-CoV)。SARS是一种以呼吸系统症状为主要表现的全身性疾病,可引起全身多器官多组织损伤,导致患者死亡的主要病因为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。其宿主范围广,传播速度快,且可通过飞沫传播,危害极大。关于这种致命病毒进入宿主细胞的方式,最早有学者通过电镜观察提出病毒通过直接膜融合方式进入细胞。而后来有病毒进入细胞依赖pH的报道,提示病毒进入细胞的方式可能并不是单一的。现有研究证实,SARS-CoV的刺突蛋白(Spikeprotein,S蛋白)是病毒表面最重要的膜蛋白,能够与受体结合并促进病毒入胞。本论文研究发现SARS-CoV可以通过内吞方式进入宿主细胞。SARS-CoV进入宿主细胞的过程中并不依赖于clathrin及caveolin蛋白;而脂筏,这种细胞表面重要的脂质微区在病毒进入细胞的过程中起重要作用。上述结果的阐明为了解SARS-CoV致病机理及研发新型抗病毒药物提供了重要信息。 H5N1型禽流感病毒导致急性肺损伤机理的研究最近一段时间以来,不断发生H5N1型禽流感病毒感染禽类和人类的事件。由于这种病毒变异性极高,发生流行的危险较大。而且缺乏有效的预防与治疗方法,病人病死率非常高。因此,H5N1型禽流感病毒致病机理的研究显得尤为重要。病人主要的死亡原因为急性肺损伤,而关于急性肺损伤的分子机理,尚不清楚。本论文研究发现,H5N1型禽流感病毒可以通过以下两种方式导致急性肺损伤: 1.H5N1通过诱导肺部巨噬细胞产生ROS,氧化细胞表面磷脂,激活TLR4-TRIF-NFkB通路导致大量炎性因子(IL-6)的产生,导致急性肺损伤。ROS抑制剂及氧化磷脂的清除剂都可以缓解H5N1导致的急性肺损伤。 2.H5N1通过Akt-TSC2-mTOR通路诱导细胞产生自噬,并导致细胞死亡,进而导致急性肺损伤的发生。自噬的特异抑制剂及自噬特异分子的敲除可以缓解H5N1导致的急性肺损伤。上述结果的阐明为了解H5N1型禽流感病毒致病机理及研发新型抗病毒药物提供了重要信息。 H5N1型禽流感病毒进入宿主细胞机制的研究关于禽流感病毒进入细胞机制的研究主要来自H1N1型病毒,由于不同病毒株进入不同细胞时采取的方式可能有所不同,而H5N1型禽流感病毒近期较为流行,我们研究了H5N1型禽流感病毒进入宿主细胞的方式。本论文发现H5N1型病毒进入人肺上皮细胞A549细胞时,依赖于clathrin蛋白而并不依赖于caveolin蛋白,这一结果的阐明为了解H5N1型禽流感病毒致病机理及研发新型抗病毒药物提供了重要信息。

关键词：哺乳动物表达系统 SARS-CoV H5N1 急性肺损伤自噬 ROS clathrin

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人Kallistatin重组蛋白在CHO细胞中表达及其抗肝癌功能探索

人Kallistatin重组蛋白在CHO细胞中表达及其抗肝癌功能探索

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作者：高三星华侨大学

学位级别：硕士

Kallistatin(KAL)是一种多功能蛋白,具有抗氧化应激、抗血管生成、抗纤维化、抗肿瘤等多种活性。本实验室前期运用酵母工程菌发酵并制得其重组蛋白,用于制备其单克隆抗体时发现效价不高,分析可能由于酵母菌表达重组KAL蛋白的分子构象发... 详细信息

Kallistatin(KAL)是一种多功能蛋白,具有抗氧化应激、抗血管生成、抗纤维化、抗肿瘤等多种活性。本实验室前期运用酵母工程菌发酵并制得其重组蛋白,用于制备其单克隆抗体时发现效价不高,分析可能由于酵母菌表达重组KAL蛋白的分子构象发生变化而致。于是本文主要构建CHO-K1细胞高表达载体,并筛选高表达KAL蛋白的稳定株,悬浮无血清驯化后,批量表达纯化得到KAL蛋白并探索其对肝癌的作用。本文主要的研究方法和研究结果如下:首先运用基因工程技术构建了含有Kozak序列,人白蛋白信号肽与人工设计的信号肽,穿膜肽TAT与pcDNA3.1、pTT5、pMH3、pMH3EN载体相连的18种载体。用PEI瞬时转染,双抗夹心ELISA检测,选取KAL表达量最高的载体,运用优化的转染条件转染CHO-K1细胞,转染后36 h,消化转移至培养皿中,用筛选浓度G418来筛选,挑取单菌落接种到96孔细胞培养板中,G418继续筛选。7天后ELISA检测细胞上清KAL含量,选取阳性值高(A≥1.0),有限稀释法克隆化。经三次克隆化后,逐渐扩大培养置100 mm细胞培养皿中,成功筛得表达KAL的稳定株。然后悬浮无血清驯化后,批量表达优化,Ni柱纯化得到KAL蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot鉴定之。最后用CCK-8和Hoechst 33342染色以及Transwell实验分别检测KAL对肝癌细胞的作用,并用Western blot初步验证KAL对肝癌的可能原因。本研究表明:(1)不同信号肽,穿膜肽对蛋白的分泌表达效果不尽相同,其中本研究使用的一种人工设计的信号肽对KAL的表达量在不同载体都有显著提高。本研究构建的最佳载体是未优化载体的KAL表达量的10倍。(2)运用G418筛选,三次克隆化后成功筛选出表达KAL的CHO-K1的4株稳定株——2F8、4B4、4E7和7D11。悬浮无血清驯化后,继续加维持剂量的G418和采用分次流加培养的方法,10天时培养基中KAL蛋白浓度最高为11mg/L。批量表达Ni柱纯化CHO细胞表达的KAL重组蛋白分子量为60 kD左右,比大肠杆菌(40 kD)和酵母(58 kD)表达的要略大。主要因为CHO细胞翻译后修饰以及有His标签。(3)研究发现KAL能抑制肝癌细胞的生长增殖,Tranwell实验表明KAL可抑制其迁移和侵袭。Hoechst33343染色发现其可诱导肝癌细胞凋亡,其诱导肝癌凋亡的具体机制有待进一步研究。

关键词： Kallistatin 哺乳动物表达系统肝癌凋亡

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PCV2 Cap蛋白串联多抗原表位与CD154/GM-CSF的融合表达及免疫效果

PCV2 Cap蛋白串联多抗原表位与CD154/GM-CSF的融合表达及免疫效果

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作者：毛茜华南农业大学

学位级别：硕士

猪圆环病毒相关疾病（Porcine circovirus associated disease,PCVAD）是由猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）感染猪引起的一种重要传染病。PCV2感染后可导致宿主免疫抑制从而并发或继发其他病原感染,对养猪业危害极大... 详细信息

猪圆环病毒相关疾病（Porcine circovirus associated disease,PCVAD）是由猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）感染猪引起的一种重要传染病。PCV2感染后可导致宿主免疫抑制从而并发或继发其他病原感染,对养猪业危害极大。目前,使用灭活苗免疫是防控PCVAD的主要手段,但该疫苗存在保护周期短等缺陷,导致我国PCVAD疫情时有暴发。因此,PCVAD的防控任务仍旧艰巨,亟需研制安全、高效、低廉的新型基因工程疫苗。 ORF2基因编码的Cap蛋白是PCV2唯一的结构蛋白,也是研制PCV2亚单位疫苗的理想抗原。研究表明,CD154和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子可作为分子佐剂显著提高疫苗的免疫保护力。此外,保护性抗原基因与表位基因串联具有协同作用,能更好的诱导机体产生体液免疫和细胞免疫应答,本实验室吴云燕等人的前期实验已经证实了将Cap和Rep蛋白上的T细胞和B细胞优势表位与免疫原性蛋白串联能更好地产生免疫保护抗体。因此,本研究将PCV2 Cap蛋白串联多抗原表位与CD154/GM-CSF融合表达,获得TB-Cap、TB-Cap-CD154和TB-Cap-GM-CSF三种融合蛋白并评价其免疫原性,以期为PCV2新型亚单位疫苗的研制提供新策略。将优势T、B细胞线性抗原表位基因串联在PCV2 Cap基因序列上并融合CD154/GM-CSF,于5’端和3’端分别插入Gaussia Luciferase信号肽和6个组氨酸序列,根据中国仓鼠卵巢细胞（CHO-K1）密码子偏好性进行优化,人工合成获得TB-Cap、TB-Cap-CD154和TB-Cap-GM-CSF基因。将重组基因分别克隆至p CDH-CMV-HCS-EF1-puro慢病毒载体,经PCR、双酶切鉴定及基因测序后,获得重组成功的慢病毒质粒p CDH-TB-Cap、p CDH-TB-Cap-CD154和p CDH-TB-Cap-GM-CSF。将上述重组慢病毒质粒分别与三个病毒包装质粒PLP、PLP1、PLP2共转染HEK-293T细胞,收获包装成功的重组慢病毒HIV-1-TB-Cap、HIV-1-TB-Cap-CD154和HIV-1-TB-Cap-GM-CSF。用上述重组慢病毒分别感染CHO-K1细胞,通过外源添加最适浓度嘌呤霉素筛选出成功表达TB-Cap、TB-Cap-CD154和TB-Cap-GM-CSF目的基因的CHO-K1细胞,采用Western blot检测目的基因表达情况。结果显示,重组细胞CHO-K1-TB-Cap、CHO-K1-TB-Cap-CD154和CHO-K1-TB-Cap-GM-CSF的蛋白样品分别在43 k Da、75k Da和59 k Da左右检测到特异性条带,与预期条带大小一致。对重组细胞进行有限稀释,进一步筛选TB-Cap、TB-Cap-CD154和TB-Cap-GM-CSF表达量最高的重组单克隆细胞株,将其悬浮驯化并进行半定量。结果显示,重组悬浮细胞CHO-K1-TB-Cap、CHO-K1-TB-Cap-CD154和CHO-K1-TB-Cap-GM-CSF的表达量约为112μg/m L、107μg/m L和38μg/m L。将获得的TB-Cap、TB-Cap-CD154、TB-Cap-GM-CSF融合蛋白分别与Montanide TMGEL 01和ISA 201VG佐剂按5:1和1:1的体积比制备成PCV2亚单位疫苗。疫苗经质量检测后免疫5周龄BALB/c小鼠,于首次免疫后第14 d和28 d以相同剂量加强免疫,采用间接ELISA试剂盒检测首免后第7、14、21、28、35和42 d的血清特异性抗体水平以评价其免疫原性。结果显示,TB-Cap、TB-Cap-CD154和TB-Cap-GM-CSF免疫组在21 d后均能刺激小鼠产生针对PCV2的特异性抗体。于首免后第42 d,每组随机剖杀3只小鼠进行淋巴细胞增殖实验,同时采用流式细胞术分析T细胞亚群分布,淋巴细胞增殖结果显示,各疫苗免疫组的细胞免疫应答水平均显著增强（P<0.0001）;T细胞亚群分布结果显示各免疫组均能有效增强机体免疫机能。所有小鼠在首次免疫后第42 d用200μL PCV2(105.5TCID50/m L)攻毒,攻毒后第14 d和28 d采用PCR检测血清病毒DNA发现各免疫组病毒血症均为阴性。攻毒后28 d采用q RT-PCR检测小鼠血清、肺和肾组织的PCV2病毒载量,结果显示,各免疫组PCV2病毒载量均显著低于PBS组（P<0.0001）。攻毒后28 d采用q RT-PCR检测血清细胞因子IL-2和IL-10的表达水平,TB-Cap-CD154和TB-Cap-GM-CSF免疫组IL-2和IL-10细

关键词： PCV2 哺乳动物表达系统免疫效果 CD154 GM-CSF

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CSFV E2蛋白与CD154/GM-CSF在CHO-K1细胞的融合表达与免疫效果研究

CSFV E2蛋白与CD154/GM-CSF在CHO-K1细胞的融合表达与免疫效果研究

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作者：秦宇伟华南农业大学

学位级别：硕士

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)感染猪引起的急性、接触性传染病。该病由于高发病率和高死亡率,给全球养猪行业带来巨大的经济损失。CSF的主要防控手段是疫苗接种,目前普遍使用的CSF... 详细信息

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)感染猪引起的急性、接触性传染病。该病由于高发病率和高死亡率,给全球养猪行业带来巨大的经济损失。CSF的主要防控手段是疫苗接种,目前普遍使用的CSF疫苗是由CSFV强毒株经过人工驯化得到的弱毒疫苗。由于使用弱毒疫苗无法在血清学上区分野毒感染和免疫动物,给我国CSF的净化带来巨大的困难。因此,研发安全高效的可以区分野毒感染和免疫接种动物的新型亚单位疫苗对我国CSF的防控意义重大。 CSFV E2蛋白能够刺激机体产生良好的免疫保护。CD40/CD154相互作用介导了B细胞的增殖、Ig的产生和类转换、存活以及生发中心的形成和记忆B细胞的产生,还参与细胞免疫和炎症反应。GM-CSF能促进多种细胞因子的分泌,从而促进T、B淋巴细胞的分化及自然杀伤细胞的激活。本研究以CSFV C株的E2序列为参考序列,设计CSFV抗原表位和E2融合基因序列。在此基础上,引入猪源CD154或GM-CSF,获得E2-CD154和E2-GM-CSF的基因序列。根据中国仓鼠细胞的密码子偏好性对E2、E2-CD154、E2-GM-CSF基因序列进行优化并人工合成。将合成的序列分别克隆至慢病毒载体p CDH-CMV-MCS-EFI-puro后,与辅助质粒PLP、PLP1、PLP2共转染HEK-293T细胞,获得3种重组慢病毒。将获得的重组慢病毒分别感染CHO-K1细胞,添加嘌呤霉素筛选,7 d后获得成功表达重组蛋白的阳性细胞株。为得到能稳定表达重组蛋白的阳性单克隆细胞株,对阳性细胞株进行有限稀释培养,经Western Blot和q RT-PCR检测重组蛋白并挑选出相对表达量最高的细胞株悬浮驯化,通过Image J软件对目的蛋白进行半定量分析。Western Blot结果显示E2、E2-GM-CSF、E2-CD154在50 k Da、64 k Da和77 k Da处有特异性条带,说明重组基因在CHO-K1细胞中成功表达,E2、E2-GM-CSF、E2-CD154的蛋白表达量分别为348.1μg/2×109 cells、67μg/2×109 cells、72μg/2×109 cells。为评估重组蛋白的免疫原性,将E2、E2-CD154、E2-GM-CSF重组蛋白分别与水乳佐剂Montanide TM GEL 01按照5:1混合制备成亚单位疫苗,以每只50μg抗原免疫14周龄实验兔,并在首次免疫后第21 d以相同剂量加强免疫。ELISA检测血清特异性抗体结果显示,E2、E2-CD154和E2-GM-CSF组均能诱导产生CSFV E2特异性抗体,其中E2-CD154与E2-GM-CSF特异性抗体水平均高于E2组,且E2-CD154特异性抗体水平最高。用灭活的CSFV石门株刺激免疫组的PBMC均能诱导淋巴细胞增殖。ELISA检测兔血清细胞因子结果显示,免疫组均能刺激实验兔IFN-γ和IL-4的分泌。血清中和抗体试验结果显示,E2、E2-GM-CSF、E2-CD154组的中和抗体滴度高于C株组。首免后第35 d用100RID50(半数兔体感染量)CSFV C株对所有实验组进行攻毒保护试验。结果显示,E2、E2-GM-CSF、E2-CD154和C株组实验兔体温均正常,未发现明显临床症状,而PBS组出现定型热。免疫后第49 d采集兔淋巴结、脾脏和PBMC检测病毒载量,结果显示,仅PBS组检测到CSFV核酸,而E2、E2-GM-CSF、E2-CD154和C株组均未检出。综上,本研究制备的E2、E2-GM-CSF、E2-CD154重组蛋白免疫原性和保护性良好,且均能诱导细胞免疫和体液免疫反应,有望成为CSF亚单位疫苗的优良候选蛋白。E2-CD154和E2-GM-CSF能刺激实验兔产生更高的CSFV特异性抗体,GM-CSF或CD154与E2的融合表达能够为CSF亚单位疫苗的研制提供新思路。

关键词： CSFV 慢病毒载体哺乳动物表达系统亚单位疫苗免疫原性

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人源抗HBsAg dsFv抗体靶向干扰素复合基因的克隆和表达

人源抗HBsAg dsFv抗体靶向干扰素复合基因的克隆和表达

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作者：江乐曲阜师范大学

学位级别：硕士

抗体技术经历血清多克隆抗体、单克隆抗体阶段后发展到了第三代抗体-基因工程抗体。我们在前期研究中通过噬菌体抗体库筛选到人源抗HBsAg基因工程抗体,利用PCR定点突变获得二硫键稳定的dsFv(disufide-stabilized Fv fragments)抗体,但... 详细信息

抗体技术经历血清多克隆抗体、单克隆抗体阶段后发展到了第三代抗体-基因工程抗体。我们在前期研究中通过噬菌体抗体库筛选到人源抗HBsAg基因工程抗体,利用PCR定点突变获得二硫键稳定的dsFv(disufide-stabilized Fv fragments)抗体,但抗体的轻链与干扰素α的融合基因和重链基因分别克隆于pCI-neo和pCdhfrl两个质粒中,需要共转染细胞才能获得表达。本研究拟在此基础上进一步探索改进,整体思路是将人源抗HBsAg dsFv抗体的轻链-干扰素α融合基因和重链基因通过自身切割肽F2A连接置于同一开放读码框,实现抗体的轻链和重链在同一质粒中的串联表达。首先在过渡载体pCI-GPI中构建抗体靶向干扰素复合基因：即通过重叠延伸PCR法将dsFv抗体重链基因VH的3′端融入一段带正电荷的DNA负载区基因,使目的蛋白带正电荷,以结合带负电的质粒DNA；并在抗体轻链-干扰素α融合基因3′端连入6×His标签,以方便表达蛋白的检测和纯化。通过自身切割肽F2A将人源抗HBsAg dsFv抗体的轻链复合基因和重链复合基因连接置于同一开放读码框,并在过渡载体pCI-GPI中实现轻、重链复合基因的连接即得到重组质粒pCIGPI-dsFvαpr+。其次,选择哺乳动物表达系统和昆虫细胞／杆状病毒表达系统分别表达抗体靶向干扰素重组复合基因。即在构建好pCIGPI-dsFvαpr+|的基础上,把抗体靶向干扰素复合基因通过酶切和PCR等方法克隆入真核表达载体pEE14.1及杆状病毒表达系统转移载体pAcGP67A,从而获得含抗体靶向干扰素复合基因的重组表达质粒pEE14.1-dsFvαpr+和pAcGP67A-dsFvαpr+,并分别在哺乳动物细胞CHO-K1和昆虫细胞Sf9中验证其表达。此外,我们还把哺乳动物表达系统和昆虫细胞／杆状病毒表达系统表达的上清中的目的蛋白分别进行了纯化,并对其进行了初步验证。总之,含抗体靶向干扰素重组基因的重组质粒的构建及其在哺乳动物表达系统和昆虫细胞／杆状病毒表达系统中表达的尝试,为后续抗体靶向干扰素蛋白结合HBV治疗性DNA疫苗的抗乙肝靶向纳米粒药物的研制奠定了基础,也为HBV的免疫基因治疗提供了新的技术策略。

关键词：乙肝病毒表面抗原二硫键稳定性Fv抗体干扰素α 哺乳动物表达系统昆虫细胞/杆状病毒系统质粒构建基因表达

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猫促红细胞生成素制备及其应用效果初步评价

猫促红细胞生成素制备及其应用效果初步评价

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作者：韦秀颖广西大学

学位级别：硕士

促红细胞生成素（Erythropoietin,EPO）是一种含唾液酸的酸性糖蛋白激素,是发现最早的造血因子,可通过促进骨髓中红系祖细胞增殖和分化来促进红细胞形成,临床上常用于非再生性贫血疾病的治疗。本研究利用基因工程方法以猫EPO蛋白基因序... 详细信息

促红细胞生成素（Erythropoietin,EPO）是一种含唾液酸的酸性糖蛋白激素,是发现最早的造血因子,可通过促进骨髓中红系祖细胞增殖和分化来促进红细胞形成,临床上常用于非再生性贫血疾病的治疗。本研究利用基因工程方法以猫EPO蛋白基因序列为对象,将其与猫Ig G的Fc片段连接,结合中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary cells,CHO）密码子偏好性优化设计,用脂质体转染法获得动物细胞生产的猫重组促红细胞生成素（rFe-EPO）,通过建立小鼠缺血模型,并评估其在缺血条件下的疗效。首先,采用脂质体转染技术将重组质粒p CDNA3.1（+）-rFe-EPO转染至CHO-K1（Chinese Hamster Ovary cells K1,CHO-K1）细胞,通过极限稀释法与抗生素G418筛选rFe-EPO的亚克隆细胞株。随后提取细胞RNA,用RT-PCR鉴定转染细胞株,并用IFA及Western blot对细胞表达产物进行鉴定,结果显示制备的rFe-EPO能稳定表达,表达的rFe-EPO蛋白能够与HRP标记猫EPO抗体发生特异性反应,获得的rFe-EPO蛋白活性为46IU/L。鲎试剂法检测细菌内毒素结果为0.12 EU/m L。根据《中国兽药典》的规定,每头份注射重组蛋白药物标准中内毒素含量应不高于20 EU,该蛋白符合《中国兽药典》内毒素含量的规定。用CCK-8法测定不同浓度的rFe-EPO在FK81上的细胞毒性情况,结果表明rFe-EPO蛋白在100μg/m L浓度下对FK81无细胞毒性。采用眼眶后静脉丛放血法,并结合五分类血常规检测观察小白鼠缺血后各血项指标变化情况建立小鼠缺血模型。6周龄体重30 g左右昆明小白鼠在采用隔天放血,累计放血3次,共计1.5 m L。结果显示小鼠的网织红细胞百分比（RETIC%）,网织红细胞计数（RETIC）显著下降到仪器检测限以下;红细胞计数,红细胞压积、血红蛋白及血小板等均有显著下降,结果显示小鼠缺血模型构建成功,可以用于后续治疗效果评估实验。随后,进行rFe-EPO对缺血模型小鼠的疗效评估:设不同浓度（高、中、低）的给药组、对照组及缺血模型对照组,给药组隔天皮下给药,并于给药的7、14天采集小鼠眼眶血进行五分类血常规,结果表明:rFe-EPO对失血小鼠治疗效果显著,给药7天后,给药组小鼠精神、食欲恢复正常;给药14天后,治疗组小鼠的RBC、RETIC和RETIC%均有显著升高（P<0.01）,且与给药剂量呈正相关。其中高剂量组的RBC为10.94±0.07×1012 L,为失血模型组6.79±1.45×1012 L的2倍左右;RETIC高达900.43±91.39（10～9/L）,远高于模型组1.70±1.19（10～9/L）,除此之外RETIC%、HGB、HCT等多项指标均有显著提升,这表明这外源性给予的rFe-EPO对红细胞的生成具有较好的促进作用。脏器指数分析表明失血模型组的肺脏和肾脏出现代偿性增大,而高、中。低给药组的小鼠脏器指数与对照组无显著差异,推测rFe-EPO有效缓解小鼠失血带来的脏器变化,对失血小鼠脏器具有一定保护作用,降低了缺血失血对肺脏和肾脏的长期负担。在进行的小鼠急性毒性试验中,小鼠的活动水平、食欲和体重在实验期间与对照组无明显差异,2组小鼠存活率均为100%,根据这些结果,初步判定在所测试的剂量范围内,rFe-EPO蛋白没有引起明显的不良反应或毒性效应。针对目前市场上缺乏商业化猫EPO的问题,本研究通过开发猫源EPO,为临床治疗猫非再生性贫血提供技术支持,本研究的成果有望为猫类贫血治疗提供更为安全有效的替代方案。

关键词：哺乳动物表达系统稳定表达 CHO-K1细胞

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抗猫细小病毒基因工程嵌合抗体的表达与初步鉴定

抗猫细小病毒基因工程嵌合抗体的表达与初步鉴定

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作者：王文静中国农业科学院

学位级别：硕士

猫细小病毒（Feline parvovirus,FPV）又名猫泛白细胞减少症病毒,病猫临床表现以高热、呕吐、腹泻、脱水以及循环血流中白细胞减少为特点。FPV的宿主包括家养和野生猫科动物（Feliformia亚目）和一些野生犬科动物（Caniformia亚目）,如... 详细信息

猫细小病毒（Feline parvovirus,FPV）又名猫泛白细胞减少症病毒,病猫临床表现以高热、呕吐、腹泻、脱水以及循环血流中白细胞减少为特点。FPV的宿主包括家养和野生猫科动物（Feliformia亚目）和一些野生犬科动物（Caniformia亚目）,如浣熊和狐狸。因其感染性强致死率高被人们逐渐重视。目前临床针对FPV抗体治疗主要依赖于抗血清,市售的血清多是鼠源单克隆抗体（Monoclonal antibody,MAb）,虽有一定疗效但由于是异源性蛋白应用于体内易产生过敏反应,无法连续注射,治疗效果不佳。近年来,因其基因工程嵌合抗体可以在保留原鼠源抗体的亲和力和特异性基础上降低鼠源性单克隆抗体的免疫原性,并通过连接不同的恒定区基因从而改变抗体的效应功能等优势已发展为目前研究最多的基因工程抗体之一。本实验旨在通过哺乳动物细胞表达具有中和FPV活性的鼠-猫嵌合抗体,降低鼠源单克隆抗体在猫体内引起的免疫副反应。通过克隆具有FPV中和活性的MAb（4F6）的重轻链可变区基因及猫天然抗体（NAb）重轻链恒定区基因,通过重叠延伸PCR获得鼠-猫重组重轻链基因片段（CH/CL）,分别克隆至p FUSE-m Ig G1-Fc载体上,构建嵌合抗体表达载体（p MC-CH、p MC-CL）,菌落PCR鉴定正确后转染CHO-K1细胞,使用100μg/m L博来霉素（Zeocin）筛选,有限稀释法将其单克隆纯化后经双抗体夹心ELISA与Western-blot筛选出同时表达鼠-猫重组重轻链基因的细胞株（CHO-MC）,构建CHO-MC细胞系传代至15代,双抗体夹心ELISA测定不同代次细胞培养上清中的抗体效价,将纯化鉴定正确的鼠-猫嵌合抗体调整浓度为1mg/m L,间接ELISA检测嵌合抗体的效价,中和活性试验测定其对病毒感染细胞的中和活性。结果显示,鼠-猫嵌合抗体重轻链经SDS-PAGE分离大小分别为55 ku、25 ku,Western blot显示鼠源恒定区替换为猫源NAb的恒定区,双抗体夹心ELISA显示CHO-MC细胞系在传代至15代仍能稳定表达嵌合抗体,间接免疫荧光试验显示该嵌合抗体能够与抗猫Ig G和FPV特异性结合,ELISA及中和效价分别为1:1280（0.78μg/m L）和1:16（62.5μg/m L）。上述结果表明,本研究在保留了原猫细小病毒MAb 4F6中和活性的基础上,通过哺乳动物细胞表达出抗FPV的鼠-猫嵌合抗体,达到了减少抗体用于异种动物免疫源性的目的。

关键词：基因工程嵌合抗体猫细小病毒哺乳动物表达系统

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猪干扰素α在CHO-K1细胞中稳定表达及抗伪狂犬病毒活性研究

猪干扰素α在CHO-K1细胞中稳定表达及抗伪狂犬病毒活性研究

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作者：宋博文华南农业大学

学位级别：硕士

干扰素（Interferon,IFN）是由细胞分泌产生的具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等多种生物学活性的细胞因子。干扰素α（Interferon alpha,IFN-α）主要来源于浆细胞样树突状细胞,能激活自然杀伤性细胞并促进其增殖,调节机体免疫反应。IFN... 详细信息

干扰素（Interferon,IFN）是由细胞分泌产生的具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等多种生物学活性的细胞因子。干扰素α（Interferon alpha,IFN-α）主要来源于浆细胞样树突状细胞,能激活自然杀伤性细胞并促进其增殖,调节机体免疫反应。IFN-α既可单独使用,也可作为佐剂与疫苗联合使用以增强免疫效果。IFN-α应答是天然免疫系统中最主要的抗病毒机制,可有效治疗急性传染病。伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的一种急性传染病,临床症状表现为怀孕母猪繁殖障碍,仔猪死亡率高。隐性感染的种猪和育成猪是主要的传染源,该病给猪场造成严重的危害。相关研究表明,IFN-α对病毒性疾病的防治有广阔的应用前景。因此,本研究建立了PRV人工感染小鼠模型,旨在探究IFN-α对PRV的致病影响。本研究根据Genbank公布的猪IFN-α序列（M28623）,于N端和C端分别引入Serumalbumin preproprotein信号肽和6×His标签获得重组基因序列PoIFN-α,将其克隆至p CDH-CMV-MCS-EF1-Puro慢病毒表达载体,经PCR、双酶切和基因测序鉴定获得重组质粒p CDH-PoIFN-α。将重组质粒与辅助质粒PLP1、PLP2和PLP3共转染于HEK-293T细胞包装成重组慢病毒。用重组慢病毒感染仓鼠卵巢细胞亚株（CHO-K1）细胞,经嘌呤霉素筛选、q RT-PCR和间接免疫荧光检测,获得成功表达目的蛋白的CHO-K1阳性细胞。通过有限稀释获得多个单克隆细胞株,经Western blot和q RT-PCR对单克隆细胞株检测,分析PoIFN-α在CHO-K1的表达情况,获得了能稳定表达重组蛋白PoIFN-α的单克隆细胞株。选取一株蛋白表达量最高的重组CHO-K1细胞悬浮培养,使用ELISA试剂盒测定细胞中PoIFN-α的含量,当细胞数达1×10～6cells/m L时,PoIFN-α的含量为1105 pg。采用细胞病变抑制法在BHK-21细胞上测定PoIFN-α抗PRV效价为5.41×10～6U/L,即当PoIFN-α蛋白浓度为1105 pg时,PoIFN-α抗PRV比活为1.96×10～7U/mg。将42只BALB/c小鼠随机分为7组,探究PoIFN-α蛋白对PR的防治效果。每只小鼠肌注TCID50为10-2.5/0.1 m L的PRV病毒液,设置IFN预防组、IFN治疗组、感染和空白对照组,预防组分别于感染前第5 d、3 d和1 d开始注射重组蛋白PoIFN-α。治疗组分为感染当天和感染后1 d开始注射重组蛋白PoIFN-α。观察感染后小鼠存活状态及病理变化。结果显示,预防组均未死亡且无临床症状,剖解后无异样,石蜡切片观察有轻度的肺出血、肺充血;治疗组均未死亡,各组有1只小鼠出现呼吸症状,剖解后肺部有淤血、水肿,肝表面有明显的出血点,石蜡切片观察有局灶性肺气肿、肺泡充血、血管壁增厚,肝细胞间隙变宽;感染对照组死亡3只,肺脏、肝脏出血,石蜡切片观察,肺腔内外充满大量红细胞,肝细胞水泡变性,脑部有炎性细胞浸润;空白对照组小鼠状态正常。通过q PCR检测小鼠组织中PRV载量,所有注射重组蛋白PoIFN-α组的病毒载量明显低于感染对照组,表明重组蛋白PoIFN-α可在体内抑制PRV复制。综上,本研究成功构建了可稳定表达重组蛋白PoIFN-α的CHO-K1细胞,临床研究显示重组蛋白PoIFN-α对PR有一定的预防及治疗效果,且预防优于治疗。本实验表达的重组蛋白PoIFN-α经临床实践,表现了防治病毒性疾病的潜力,并可稳定表达,为今后开发有效的猪IFN-α抗病毒药物奠定基础。

关键词： IFN-α PRV 哺乳动物表达系统生物学活性

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