检索结果-内蒙古大学图书馆

生物技术通报 2025年第3期41卷 62-70页

作者：梁丽存王克芬宋祖洹刘梦婷李佳玉罗会颖姚斌杨浩萌中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193 山东隆科特酶制剂有限公司临沂276000

【目的】在CRISPR/Cas9基因编辑系统中,sgRNA是重要的基因编辑元件之一,它与Cas9蛋白结合并通过间隔区序列与基因组DNA互补,引导Cas9蛋白对基因组进行精准剪切。为了提高塔宾曲霉的基因编辑效率,对sgRNA进行优化是一项可行的策略。【方... 详细信息

【目的】在CRISPR/Cas9基因编辑系统中,sgRNA是重要的基因编辑元件之一,它与Cas9蛋白结合并通过间隔区序列与基因组DNA互补,引导Cas9蛋白对基因组进行精准剪切。为了提高塔宾曲霉的基因编辑效率,对sgRNA进行优化是一项可行的策略。【方法】对sgRNA的启动子和发夹结构进行了优化,并在塔宾曲霉中进行了基因编辑效率的验证。【结果】通过RNP法进行基因编辑时,带有“lock”结构的sgRNA的基因编辑效率比对照组提高了9.37%;sgRNA在进行体内表达时,使用tRNA^(Gly15)和tRNA^(Gly17)启动子的基因编辑效率分别高出5S rRNA启动子14%-16%;使用tRNA^(Gly15)启动子表达带有“lock”结构的sgRNA,能提高白孢率,并使塔宾曲霉的基因编辑效率提高到96%。【结论】“lock”结构和两种tRNA^(Gly15)和tRNA ^(Gly17)启动子能够提高塔宾曲霉的基因编辑效率。

关键词：塔宾曲霉基因编辑效率启动子 “lock”结构

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利用sgRNA优化提高AsCas12f1系统的基因编辑效率及其在小鼠疾病模型构建中的应用

利用sgRNA优化提高AsCas12f1系统的基因编辑效率及其在小鼠疾病模...

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作者：范鹏吉林大学

学位级别：博士

CRISPR-Cas系统由于简单且高效的特性已经成为基因编辑的主流技术,尤其是Cas9和Cas12a系统。但因传统核酸酶自身分子量过大,一般需要双AAV载体递送到体内,降低了基因编辑器的体内递送效率。为了解决这一问题,亟需小型Cas核酸酶的开发和... 详细信息

CRISPR-Cas系统由于简单且高效的特性已经成为基因编辑的主流技术,尤其是Cas9和Cas12a系统。但因传统核酸酶自身分子量过大,一般需要双AAV载体递送到体内,降低了基因编辑器的体内递送效率。为了解决这一问题,亟需小型Cas核酸酶的开发和探索。隶属于2类CRISPR-Cas系统中V-F亚型效应蛋白的Cas12f核酸酶,是目前研究发现最紧凑的CRISPR效应核酸酶。其尺寸仅有Sp Cas9核酸酶的三分之一大小,因此在临床治疗应用中具有巨大潜力。其中,来自硫酸氧化酸杆菌(Acidibacillus sulfurooxidans)的紧凑型AsCas12f1蛋白仅由422个氨基酸组成,其可以在RNA引导下通过识别NTTR(其中R代表A或G)的PAM切割双链DNA。但因其在哺乳动物细胞中编辑效率较低,难以广泛应用于基因编辑领域。作为AsCas12f1同家族的Un1Cas12f1和Spa Cas12f1基因编辑系统,均已成功通过sg RNA(tracr RNA-cr RNA)优化显著提升了其在细胞中的编辑效率。在Un1Cas12f1系统中,基于sg RNA结构共设计了五种不同的工程化g RNA策略,成功使Un1Cas12f1系统在哺乳动物细胞中的编辑效率可以媲美Sp Cas9系统。因此,本研究旨在对紧凑型AsCas12f1基因编辑系统的sg RNA进行系统优化,以提高其在细胞及动物胚胎中的编辑效率,并利用AsCas12f1系统构建模拟人类遗传疾病的动物模型。首先,为了验证AsCas12f1系统在细胞上的基因编辑效率,本研究选择符合NTTR PAM(TTTG/TTTA/CTTG/ATTG)要求的15个基因靶位点,并在HEK293T细胞中进行了效率验证。测序结果显示,AsCas12f1系统在上述15个靶位点中,编辑效率均未超过10%,其中插入或删除(Indel)最高的靶位点为PDCD1位点,突变效率为9.31%。这说明AsCas12f1系统的基因编辑效率整体偏低,需进一步优化提升。为了有效提升AsCas12f1系统的编辑效率,本研究对其sg RNA骨架进行如下优化:修饰sg RNA骨架(T4AT6/GGG);调整cr RNA与tracr RNA结合长度(MS);删减g RNA茎环处无序区域(DS)。然后,将上述效率提升方案进行组合,得到T4AT6和MS组合的sg RNA版本(As-v1),并将其与AsCas12f1蛋白结合的新系统命名为AsCas12f1-v1。最后,在HEK293T细胞中,比较了AsCas12f1-v1系统与AsCas12f1系统和Un1Cas12f1系统的基因编辑效率。结果显示,优化后的AsCas12f1-v1系统在HEK293T细胞中的编辑效率显著提升,优于AsCas12f1系统和Un1Cas12f1系统。其次,为了进一步验证AsCas12f1-v1系统的基因编辑能力,本研究对小鼠和家兔胚胎进行了基因编辑。首先,我们在小鼠胚胎上选取了Dctn6、Komp、Tyr、Dmd、Polg 5个靶位点。然后,通过显微注射方式将AsCas12f1的m RNA与相应的sg RNA混合体系注入小鼠胚胎细胞内。最后,待胚胎发育到囊胚期后,收集胚胎细胞并鉴定AsCas12f1系统和AsCas12f1-v1系统的基因编辑效率。小鼠胚胎的结果显示,与AsCas12f1系统相比,AsCas12f1-v1系统成功在小鼠胚胎五个位点上实现了基因编辑,编辑效率为15.62%-62.47%。此外,我们也在家兔胚胎上选取了Hbb、Fgf5、Wrn、Otc、Mstn 5个基因位点进行验证。家兔胚胎的结果显示,与AsCas12f1系统相比,AsCas12f1-v1系统也成功在家兔胚胎上实现了基因编辑,编辑效率为4.75%-16.82%。最后,为了证明AsCas12f1-v1系统也具备在哺乳动物体内实现基因编辑的能力。我们将含有m RNA与Tyr、Dmd、Foxp1位点As-v1 sg RNA的受精卵转移到代孕母鼠中,获得F0代基因编辑小鼠。待小鼠出生7–10天后,对小鼠进行标记并提取基因组进行鉴定。深度测序结果显示,AsCas12f1-v1系统在小鼠体内成功实现了基因编辑,编辑效率分别为:Tyr(38.87%-49.66%),Dmd(33.47%-47.16%),Foxp1(23.41%-37.42%)。此外,我们还分别对Tyr突变,Dmd突变和Foxp1突变小鼠进行了初步的鉴定。结果显示,三个小鼠突变模型均准确模拟出了人类相应疾病的典型症状。综上所述,本研究通过对AsCas12f1系统的sg RNA优化,有效提升了其在细胞及动物胚胎中的编辑效率。并利用优化后的AsCas12f1-v1系统实现了小鼠体内编辑并构建了模拟人类疾病的动物模型。该研

关键词： AsCas12f1 sgRNA优化基因编辑效率胚胎编辑小鼠疾病模型

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基于提高CRISPR/Cas基因编辑效率的研究进展

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热带作物学报 2019年第10期40卷 2006-2015页

作者：张玉苗李蓉鲁瑶林玉玲赖钟雄徐涵滨州学院生物与环境工程学院/山东省黄河三角洲生态环境重点实验室山东滨州256600 福建农林大学园艺植物生物工程研究所福州350002 法国图卢兹综合科学研究所图卢兹31300

CRISPR 基因编辑技术发展迅速,为功能基因的研究及遗传改良提供了技术支持。提高基因组编辑效率成为使用基因编辑技术的基本点,目前已取得了重要进展。本文结合 CRISPR/Cas 系统的作用原理、晶体结构,着重介绍目前提高编辑效率的最新研... 详细信息

CRISPR 基因编辑技术发展迅速,为功能基因的研究及遗传改良提供了技术支持。提高基因组编辑效率成为使用基因编辑技术的基本点,目前已取得了重要进展。本文结合 CRISPR/Cas 系统的作用原理、晶体结构,着重介绍目前提高编辑效率的最新研究进展,对 CRISPR/Cas 基因编辑效率的提高进行分析并提出改进策略。

关键词： CRISPR/Cas 基因组编辑基因编辑效率

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基于CRISPR/Cas系统的基因编辑工具及其改进策略

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中国生物工程杂志 2023年第8期43卷 72-85页

作者：辛圆田开仁乔建军财音青格乐天津大学化工学院天津300072 系统生物工程教育部重点实验室天津300072 天津大学浙江研究院(绍兴) 绍兴312300

CRISPR/Cas系统自发现以来持续推动着生命科学领域的进步。与此同时,CRISPR/Cas介导的基因编辑技术也在不断发展壮大。基于DSBs修复的CRISPR/Cas基因编辑技术、碱基编辑器和先导编辑器等新型基因编辑工具的开发为生物学基础研究铺平了... 详细信息

CRISPR/Cas系统自发现以来持续推动着生命科学领域的进步。与此同时,CRISPR/Cas介导的基因编辑技术也在不断发展壮大。基于DSBs修复的CRISPR/Cas基因编辑技术、碱基编辑器和先导编辑器等新型基因编辑工具的开发为生物学基础研究铺平了道路。虽然这些工具为生物技术带来了革命性变化,但基因编辑效率偏低、产物纯度不高、脱靶效应频繁等问题也随之而来。不断开发精确、高效和安全的CRISPR/Cas基因编辑工具仍是当前和未来的生命科学研究热点。概述了CRISPR/Cas基因编辑工具的发展、构成及原理,总结了CRISPR/Cas基因编辑系统提升编辑效率、扩展编辑范围和降低脱靶效应的通用策略及不同CRISPR/Cas基因编辑工具的改进方法,并就CRISPR/Cas基因编辑工具未来的研究方向进行展望。

关键词： CRISPR/Cas 基因编辑效率 DSBs 碱基编辑器先导编辑器

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CRISPR基因编辑技术加速蔬菜作物遗传改良

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中国农学通报 2024年第24期40卷 107-115页

作者：任文静司劲超陈立杨丽梅庄木吕红豪王勇季家磊张扬勇中国农业科学院蔬菜花卉研究所蔬菜生物育种全国重点实验室北京100081

现代生物技术,特别是基于CRISPR/Cas系统的基因编辑技术,对作物遗传改良产生了深远影响。本文综合分析了CRISPR/Cas基因编辑系统的组成、机制,综述了基因编辑技术在蔬菜作物基因功能验证和作物遗传改良方面取得的突破性进展,及其在蔬菜... 详细信息

现代生物技术,特别是基于CRISPR/Cas系统的基因编辑技术,对作物遗传改良产生了深远影响。本文综合分析了CRISPR/Cas基因编辑系统的组成、机制,综述了基因编辑技术在蔬菜作物基因功能验证和作物遗传改良方面取得的突破性进展,及其在蔬菜作物如番茄、西瓜、甘蓝、胡萝卜和黄瓜等中的应用。CRISPR/Cas基因编辑系统是目前应用最广泛的基因编辑系统,为了加深对CRISPR/Cas基因编辑系统的了解、促进其在蔬菜作物改良中的重要作用,本研究探讨了影响遗传转化效率的因素,提出了提高转化效率的策略,讨论了当前技术的局限性,如作物转化再生难度和基因型的依赖性。本文强调,筛选易于遗传转化的品种、开发高效的植物转化和再生系统,以及创造更高效、精确和多功能的基因编辑工具是未来研究的关键方向。

关键词：现代育种技术 CRISPR/Cas系统 CRISPR基因编辑基因编辑效率基因功能验证作物遗传改良蔬菜作物改良遗传转化效率生物技术

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植物基因编辑相关的遗传转化方法研究

植物基因编辑相关的遗传转化方法研究

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作者：刘晶慧中国农业科学院

学位级别：硕士

植物基因工程已经被广泛应用到作物遗传改良中,为农作物品种改良提供了重要支撑。其中,CRISPR/Cas9基因编辑技术具有特异性高、编辑效率高、操作简单等优点而被广泛应用到植物基因工程中。但在植物遗传转化过程中,植物细胞壁会限制外源... 详细信息

植物基因工程已经被广泛应用到作物遗传改良中,为农作物品种改良提供了重要支撑。其中,CRISPR/Cas9基因编辑技术具有特异性高、编辑效率高、操作简单等优点而被广泛应用到植物基因工程中。但在植物遗传转化过程中,植物细胞壁会限制外源分子进入细胞,基因编辑元件的大小也会影响外源基因传递效率,导致基因编辑效率降低。另外,传统遗传转化方法具有宿主限制性,限制了基因编辑技术的应用范围。因此,打破物种限制性,高效地将外源分子传递到受体细胞中是植物基因编辑技术待突破的一个重要瓶颈。基于此,研究与完善具有高传递效率的外源基因递送系统,构建一种直接穿壁的、无外源基因整合的新型植物遗传转化平台,变得十分重要。本研究首先筛选出高效的瞬时转化方法,鉴定出高效基因编辑体系,探索了单壁碳纳米管(single-walled carbon nanotubes,SWNT)介导的遗传转化方法在植物中的可行性,以期利用瞬时转化的短时效性优势,将SWNT介导的遗传转化方法与基因编辑技术结合,获得一种新型稳定的遗传转化体系。主要研究内容及结果如下: (1)瞬时遗传转化方法筛选。为筛选出高效传递外源基因的瞬时遗传转化方法,以油菜原生质体为受体细胞,比较PEG、CPP、脂质体介导的瞬时遗传转化效率,结果表明PEG转化法的转化效率高,可以应用到基因编辑元件筛选以及基因编辑效率检测的实验当中。 (2)高效基因编辑体系筛选。为提高基因编辑效率,筛选出高效的基因编辑体系,使用PEG介导的遗传转化方法,将不同类型的基因编辑元件导入野生型或稳定表达Cas9蛋白的油菜原生质体中,分析基因编辑效率。结果表明:不同启动子驱动的g RNA基因编辑效率不同,与U6-26启动子相比,UBQ10启动子驱动的g RNA质粒的基因编辑效率高,说明优化基因编辑元件的启动子,可提高g RNA在受体细胞内的表达水平,进而提高基因编辑效率;编辑元件的大小影响基因编辑效率,与表达Cas9蛋白及sg RNA的基因编辑质粒相比,体外转录获得sg RNA作用于稳定表达Cas9蛋白植株时,基因编辑效率高,说明减小基因编辑元件的大小能够提高外源基因传递效率,进而提高基因编辑的效率。 (3)SWNT介导的瞬时遗传转化体系。为验证SWNT介导的瞬时遗传转化方法在植物细胞中的可行性,首先构建了聚乙烯亚胺单壁碳纳米管复合物(PEI-SWNT),探索PEI-SWNT复合物与外源基因的最佳结合比例,然后使用PEI-SWNT复合物将报告基因转化到油菜原生质体和烟草叶片中,在荧光显微镜下可以成功观察到荧光蛋白的表达。说明PEI-SWNT复合物无需借助外力,可以携带并保护目的基因穿过植物的细胞壁进行基因传递,使其成功在受体细胞内进行无基因整合的瞬时表达,验证了该转化平台的可行性。在后续的实验中,可将SWNT介导的瞬时转化方法与基因编辑技术相结合,对受体植株的分生组织或花粉细胞进行基因编辑,可以获得稳定遗传的基因编辑植株。将本研究建立的瞬时转化体系与基因编辑技术结合,为生物育种产业的快速发展提供有力的技术支持。

关键词：基因编辑效率瞬时转化单壁碳纳米管 PEG转化法新型植物遗传转化平台

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基于CRISPR/Cas9技术的HCT-8细胞基因编辑系统构建

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河南农业大学学报 2023年第4期57卷 632-638页

作者：李娜王悦欣李孝法王璐阳梁冠达李俊强张龙现李晓迎河南农业大学动物医学院农业农村部禽类产品质量安全控制重点实验室河南郑州450046 河南三高农牧股份有限公司河南固始465200

【目的】构建人回盲肠癌(human ileocecal adenocarcinoma,HCT-8)细胞系的CRISPR/Cas9基因编辑系统,实现对目的基因的高效编辑。【方法】采用慢病毒感染的方式,将慢病毒载体质粒LentiCas9-Blast与包装质粒pSPAX2和pMD2.G共转染至人胚胎... 详细信息

【目的】构建人回盲肠癌(human ileocecal adenocarcinoma,HCT-8)细胞系的CRISPR/Cas9基因编辑系统,实现对目的基因的高效编辑。【方法】采用慢病毒感染的方式,将慢病毒载体质粒LentiCas9-Blast与包装质粒pSPAX2和pMD2.G共转染至人胚胎肾(human embryonic kidney 293T,HEK293T)细胞系获得高滴度的重组慢病毒液,并感染HCT-8细胞系,以未感染组为阴性对照,用杀稻瘟菌素进行抗性筛选,直至阴性对照组全部死亡;采用有限稀释法对阳性细胞进行单克隆筛选,对筛选得到的单克隆细胞系进行扩大培养,并采用PCR及Western Blot试验验证Cas9基因及其蛋白表达情况,而后对阳性单克隆细胞系进行基因编辑效率及细胞系活性验证。【结果】得到能成功表达Cas9蛋白的6株HCT-8-Cas9单克隆细胞系。其中HCT-8-Cas9_2和HCT-8-Cas9_4细胞系蛋白量表达较高;对所筛选单克隆细胞系进行基因编辑效率检测,pXPR_011慢病毒表达报告基因载体系统检测结果表明,HCT-8-Cas9_4单克隆细胞系Cas9基因编辑效率为48.82%,显著高于其他HCT-8-Cas9单克隆细胞系;单克隆细胞系活性检测结果表明,HCT-8-Cas9_2和HCT-8-Cas9_4单克隆细胞系细胞活性与HCT-8细胞系相比均无显著差异。【结论】HCT-8-Cas9_4细胞系能够稳定表达Cas9蛋白,具有良好的编辑效率,可用于后续靶标基因的高效编辑。

关键词：基因编辑慢病毒人回盲肠癌(HCT-8)细胞 CRISPR/Cas9 基因编辑效率

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CRISPR/Cas9基因编辑技术在水生甲壳动物中的应用进展

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中国海洋大学学报（自然科学版） 2020年第9期50卷 105-112,119页

作者：郭华荣陶奕文中国海洋大学海洋生命学院海洋生物遗传与育种教育部重点实验室山东青岛266003 中国海洋大学海洋生物进化与多样性研究所山东青岛266003

CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated nuclease 9)技术是一种由gRNA(guide RNA)引导的Cas9核酸内切酶靶向编辑技术,已广泛用于基因的敲除、敲入和敲降,其操作简便快速,成本低,已成为人们探究基因功能、修复受损基因、沉默有害基因以及改良经济物种种质性状的重要工具。目前,该技术已经在少数几种水生甲壳动物中得到成功应用,但是由于显微注射技术在应用上的局限性,该技术在许多重要海水养殖经济物种如对虾中的应用受到限制,导致其基因编辑效率低下,难以广泛开展。本文对CRISPR/Cas9基因编辑技术在水生甲壳动物中的应用进行了综述和展望,为今后海水养殖虾蟹类的基因功能研究以及遗传育种研究提供参考。

关键词： CRISPR/Cas9基因编辑技术水生甲壳动物应用显微注射基因编辑效率

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CRISPR-Cas9融合连接酶Ⅳ BRCT结构域提高同源直接修复效率的研究

CRISPR-Cas9融合连接酶Ⅳ BRCT结构域提高同源直接修复效率的研究

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作者：刘劲松吉林大学

学位级别：硕士

基因编辑技术CRISPR/Cas9系统的出现从一开始便引来众多科学家的目光与研究。CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Associated Proteins9),是细菌及古细菌为抵御外来基因进化出来的获得性免疫防御机制。在利用该系统进行基因编辑时,其作用机制为Cas9蛋白在g RNA的指导下靶向切割特定目的序列引起目的序列发生双链断裂,双链断裂的DNA在细胞自身损伤修复机制的作用下对损伤DNA进行修复。基因发生损伤时,一般有两种较为普遍的修复方式:NHEJ(Non-homologous end joining,非同源末端重组)和HDR(Homologous directed repair,同源直接修复)。当基因发生损伤时,两种修复机制呈互相竞争的关系,且大部分情况下NHEJ修复通路占优。已知在NHEJ修复通路中,起重要作用的蛋白有Ku70/Ku80、PKcs、XLF、XRCC4、ligase IV、Td T、Polymeraseμ、Polymeraseλ、Polynucleotide kinase。其中XRCC4(X-Ray Repair Cross Complementing 4,X射线修复交叉补体4)与XLF(XRCC4-like factor,XRCC4样因子)、ligase IV形成复合体,XRCC4与ligase IV通过ligase IV C端BRCT(Breast cancer 1C terminus like,乳腺癌相关基因1碳末端样)结构域结合。在这个复合体中ligase IV起连接的作用,XLF与XRCC4的存在能显著增强ligase IV在NHEJ通路中的连接活性,但若没有XLF与XRCC4或其中之一的存在,ligase IV活性显著减低。在本实验中,我们将Cas9蛋白通过柔性linker与NHEJ修复通路的必需的ligase IV BRCT domain结合起来,依靠竞争性结合XRCC4来抑制正常的ligase IV行使功能,从而抑制NHEJ的发生,提高HDR的效率。为评价这一体系对HDR效率提高程度高低以及在降低NHEJ方面的影响,我们构建了基于EGFP到BFP转换报告HDR效率、基因插入或缺失导致绿色荧光猝灭报告NHEJ效率的HEK293T-AAVS1-EGFP单克隆细胞系。基于上述理论构建的px330-Cas9-32aa-p BRCT质粒在猪成纤维细胞Rosa26位点knock in EGFP序列的实验中,用流式细胞分析结果证明了其效率在px330的基础上提高了80%。随后我们利用报告细胞系,通过改变BRCT domain与Cas9蛋白串联的位置,串联所用linker的长短等对Cas9-BRCT体系进行优化。在自构建的HEK293T-AAVS1-EGFP单克隆细胞系上与原初的Cas9蛋白相比,其HDR效率提高了4.5倍。随后通过P2A‘自切割’linker对BRCT结构域的作用机制进行进一步的探索。综上所述,我们成功获得了一株能稳定报告HDR及NHEJ发生概率的HEK293T-AAVS1-EGFP细胞系,构建并优化了Cas9-BRCT串联体系,于原代细胞上证实了该体系的可行性。该体系的建立有助于我们加快各种基于精确基因编辑基础上的研究,为基因治疗,疾病模型动物的构建,各种分子机制的探索拓宽了道路。

关键词： CRISPR/Cas9 非同源末端重组乳腺癌相关基因1碳末端样结构域同源直接修复基因编辑效率

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猕猴桃表皮毛发育基因的筛选及其在海沃德猕猴桃中的基因编辑研究

猕猴桃表皮毛发育基因的筛选及其在海沃德猕猴桃中的基因编辑研究

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作者：李创西北农林科技大学

学位级别：硕士

猕猴桃果实维生素C含量高,具有均衡的矿物质营养、膳食纤维和利于人体健康的代谢物组分,被誉为“水果之王”。果皮毛是影响猕猴桃外观品质和消费的因素之一,果实少毛或无毛是猕猴桃育种的主要目标之一。本论文以‘红阳’猕猴桃(Actinidi... 详细信息

猕猴桃果实维生素C含量高,具有均衡的矿物质营养、膳食纤维和利于人体健康的代谢物组分,被誉为“水果之王”。果皮毛是影响猕猴桃外观品质和消费的因素之一,果实少毛或无毛是猕猴桃育种的主要目标之一。本论文以‘红阳’猕猴桃(Actinidia chinensis cv.‘Hongyang’)、毛花猕猴桃(Actinidia eriantha)、和山梨猕猴桃(Actinidia rufa)为材料,基于猕猴桃二代和三代转录组数据,筛选出2个调控猕猴桃表皮毛发育的候选基因并在六倍体美味猕猴桃‘海沃德’(Actinidia deliciosa‘Hayward’)中进行基因编辑研究,以筛选出调控猕猴桃表皮毛发育的基因,为基因编辑育种奠定基础。本试验主要结果如下:1.以AtGL1、AtGL2、AtGL3、AtTTG1和AtSAD2等5个调控拟南芥表皮毛起始和发育的基因为模板,基于猕猴桃基因组数据库,通过比对获得了相应的同源基因,通过蛋白质序列比对和进化树的构建和分析,分别获得了AtGL1的候选基因Achn116791,AtGL2的候选基因Achn198951,AtGL3的候选基因Achn244201、Achn302211和Achn071731,AtTTG1的候选基因Achn045741,AtSAD2的候选基因Achn379131和Achn379141。分析了上述候选基因在红阳猕猴桃、毛花猕猴桃和山梨猕猴桃的幼果、成熟叶和茎尖的表达水平以及在红阳猕猴桃果实不同发育阶段的表达水平。最后筛选出了2个调控猕猴桃表皮毛发育的候选基因:AtGL1的候选基因Achn116791和AtGL3的候选基因Achn302211,而基因AtSAD2的候选基因Achn379131可能不是调控猕猴桃表皮毛发育的关键基因。2.选取候选基因Achn116791,Achn302211和Achn379131为目标基因,利用软件CRISPRdirect,根据sgRNA设计的原则,对目标基因进行sgRNA设计,成功构建了目标基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体,利用农杆菌介导法转化海沃德猕猴桃叶盘。经抗性筛选和PCR鉴定,我们获得了16个猕猴桃Achn116791转基因株系,经测序分析有9个株系发生了碱基的插入、缺失或替换。通过叶片表皮毛的观察,4号、5号和6号株系的叶片表皮毛密度降低、长度变短;我们获得了4个猕猴桃Achn302211转基因株系,其中1个株系发生了碱基的插入,引起了叶片表皮毛密度降低、长度变短;我们获得了4个猕猴桃Achn379131转基因株系,但均未检测到靶位点被编辑。这些结果不仅说明Achn116791基因和Achn302211基因调控着猕猴桃叶片表皮毛的发育,也证实了在六倍体海沃德猕猴桃中可以利用CRISPR/Cas9技术进行基因编辑,且在本试验转基因株系中基因编辑效率为41.7%。

关键词：猕猴桃表皮毛 sgRNA CRISPR/Cas9 基因编辑效率

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