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5 篇 东北林业大学
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天女木兰A类PP2C基因克隆及其在种子休眠解除中的功能验证

天女木兰A类PP2C基因克隆及其在种子休眠解除中的功能验证

引用

作者：孙宏涛沈阳农业大学

学位级别：硕士

天女木兰(Magnolia sieboldini ***)是木兰科木兰属落叶小乔木,国家重点保护野生植物,具有极高的观赏和经济价值。目前,天女木兰主要靠播种繁殖,由于种子具有形态生理休眠特性限制了其繁殖和推广。A类PP2C是ABA信号转导途径中重要的负... 详细信息

天女木兰(Magnolia sieboldini ***)是木兰科木兰属落叶小乔木,国家重点保护野生植物,具有极高的观赏和经济价值。目前,天女木兰主要靠播种繁殖,由于种子具有形态生理休眠特性限制了其繁殖和推广。A类PP2C是ABA信号转导途径中重要的负调节因子,对于揭示种子休眠解除的作用机制具有重要意义。本研究基于课题组天女木兰种子转录组数据,通过基因克隆,获取了三个天女木兰A类PP2C基因(Ms AHG1、Ms AHG3、Ms HAB1)全长。通过实时荧光定量PCR技术,探究天女木兰Ms AHG1、Ms AHG3、Ms HAB1基因在不同组织中、种子吸胀过程中、种子休眠解除过程中的表达模式。利用单酶切同源融合的方法构建植物重组表达载体,通过亚细胞定位和拟南芥遗传转化对基因功能进行验证,为揭示天女木兰ABA信号传导在种子休眠解除过程中的分子作用机制提供科学依据。主要研究结果如下:1.成功克隆了天女木兰Ms AHG1、Ms AHG3、Ms HAB1基因,开放阅读框全长分别为1269 bp、1209 bp、1695 bp,编码422、402、564个氨基酸。Ms AHG1、Ms AHG3、Ms HAB1蛋白均为非跨膜的亲水蛋白,都具有PP2Cc结构域,属于PP2Cc家族。同源进化树显示,天女木兰的Ms AHG1、Ms AHG3、Ms HAB1分别与沉水樟的Cm AHG1、Cm AHG3、Cm HAB1亲缘关系比较近。*** AHG1、Ms AHG3、Ms HAB1基因的表达模式分析,发现Ms AHG3基因在干种子中表达量最高,极显著高于Ms HAB1和Ms AHG1基因。在天女木兰种子吸胀过程中,Ms AHG1和Ms AHG3基因响应吸胀过程。与干种子相比,Ms AHG1基因在吸胀6-48 h的相对表达量均高于Ms AHG3基因,表明其在吸胀过程中起主要调控作用。在天女木兰休眠解除过程中,Ms AHG1、Ms AHG3、Ms HAB1基因表达量总体呈“先下降再上升”趋势,均在16 d时最低。Ms AHG3基因在整个休眠解除过程中的表达量均高于Ms AHG1和Ms HAB1,表明其在种子休眠解除过程中起主要调控作用。3.成功构建了p RI101-Ms AHG1-GFP、p RI101-Ms AHG3-GFP、p RI101-Ms HAB1-GFP植物表达载体。烟草亚细胞定位发现Ms AHG1、Ms AHG3和Ms HAB1都定位在细胞核中,与亚细胞定位预测结果一致。4.通过Ms AHG1过表达、Ms AHG1功能恢复、ahg1突变体和Col-0萌发率的比较发现,Ms AHG1过表达转基因种子对ABA不敏感,ahg1突变体对ABA敏感,而Ms AHG1功能回补转基因种子能够降低ABA的敏感性。通过Ms AHG3过表达、ahg3突变体和Col-0萌发率的比较发现,Ms AHG3过表达转基因种子对ABA不敏感,而ahg3突变体对ABA敏感。通过Ms HAB1过表达、hab1突变体和Col-0萌发率的比较发现,Ms HAB1过表达转基因种子能够降低ABA的敏感性,而hab1突变体对ABA敏感。

关键词：天女木兰 A类PP2C 基因表达模式 ABA信号功能验证

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小麦粒重QTL侧翼标记开发和粒型同源基因GLW7的结构和表达分析

小麦粒重QTL侧翼标记开发和粒型同源基因GLW7的结构和表达分析

引用

作者：杨聪聪四川农业大学

学位级别：硕士

千粒重（Thousand Grain Weigh,TGW）是构成小麦产量的三因素之一。本课题组先前利用西藏半野生小麦Q1028（Q1028）和郑麦9023（ZM9023）构建的重组自交系（RIL）群体,鉴定出一个位于小麦2D染色体上控制千粒重的主效数量性状基因座（Qua... 详细信息

千粒重（Thousand Grain Weigh,TGW）是构成小麦产量的三因素之一。本课题组先前利用西藏半野生小麦Q1028（Q1028）和郑麦9023（ZM9023）构建的重组自交系（RIL）群体,鉴定出一个位于小麦2D染色体上控制千粒重的主效数量性状基因座（Quantitative Trait Locus,QTL）(***-2D),该QTL的加性效应来自郑麦9023。本研究利用比较基因组学对***-2DQTL进行分子标记的开发和验证以及遗传图谱的密化,为QTL的精细定位及其分子辅助育种奠定了基础。OsGLW7是在水稻中正向调节籽粒大小和粒重的重要基因。而我们对其在小麦中的同源基因TaGLW7知之甚少。本研究对TaGLW7基因进行了基因结构分析、蛋白结构分析、进化分析、启动子区域分析以及表达模式分析。此外,本研究对大麦（Hordeum vulgare,HvGLW7）、水稻（Oryza sativa,OsGLW7）、短柄草（Brachypodium distachyon,BdGLW7）、野生二粒小麦（Triticum turgidum,TtGLW7）、乌拉尔图小麦（Triticum urartu,TuGLW7）、节节麦（Aegilops tauschii,AtGLW7）也进行了比较分析。本研究结果如下:1.本研究基于先前构建的遗传图谱,运用比较基因组学在目标区间内分离出100个基因,并进一步鉴定出了32个单拷贝基因。在这些基因的启动子区域,基于SNP成功开发了高分辨率熔解曲线（High-Resolution Melting,HRM）共显性标记1个;在基因编码区内开发了序列特异性扩增区域（Sequence Characterized Amplified Regions,SCAR）显性标记2个。这三个标记均成功连锁到了遗传图谱上,并在三个遗传背景不同的验证群体中进行了验证。2.新开发的标记0C98-411和B0BB-10470在三个具有不同遗传背景验证群体中的分析发现,含有和不含有千粒重位点***-2D的株系之间,平均千粒重具有显著差异。进一步分析表明标记0C98-411可能是距离***-2D最近的侧翼标记。同时本研究将只含***-2D QTL的株系与四川地区小麦川农16杂交,筛选其F2:3群体,获得数份含有***-2D QTL背景的高千粒重的育种材料。***7、HvGLW7、TtGLW7和AtGLW7基因均被定位到相应物种中的第2组染色体上。多重比对表明GLW7基因在除乌拉尔图小麦以外的其他所有物种中均具有两个外显子和一个内含子。蛋白结构分析表明,GLW7包含SBP保守蛋白结构域和两个相邻的低复杂性区域。4.通过系统进化发育分析,我们将所有物种中的GLW7基因聚集成一个系统发育进化树。与水稻和短柄草相比,大麦中的HvGLW7基因与小麦中的TaGLW7基因有更密切的关系。5.表达模式分析表明,GLW7基因在穗器官中高度表达,包括小麦幼穗,大麦花序和水稻花药。此外,生物胁迫显著负调控小麦和大麦中GLW7基因的表达;预测的转录因子ABF2和TaGLW7基因的表达模式之间具有显著相关性。

关键词：小麦千粒重 QTL标记开发 GLW7 基因表达模式

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光敏色素B调控的锌指蛋白基因OsTZF1在水稻生长发育中作用的初探

光敏色素B调控的锌指蛋白基因OsTZF1在水稻生长发育中作用的初探

引用

作者：张程山东理工大学

学位级别：硕士

本课题利用基因芯片技术比较了野生型(Wild type, WT)和phyB突变体水稻受连续红光照射后的基因表达图谱,并且从中筛选到一个受phyB介导的红光抑制的CCCH型锌指蛋白基因,生物信息学分析表明,该基因编码植物特有的TZF蛋白家族的基因,命名... 详细信息

本课题利用基因芯片技术比较了野生型(Wild type, WT)和phyB突变体水稻受连续红光照射后的基因表达图谱,并且从中筛选到一个受phyB介导的红光抑制的CCCH型锌指蛋白基因,生物信息学分析表明,该基因编码植物特有的TZF蛋白家族的基因,命名为OsTZF1(Oryza sativa tandem zinc finger1)。为了揭示OsTZF1基因在水稻生长发育中的作用,本研究首先对该基因编码产物的亚细胞定位和基因表达模式进行了分析。利用水稻原生质体瞬时表达体系分析OsTZF1蛋白质定位结果显示,OsTZF1蛋白定位于细胞质中。通过比较不同光照条件下OsTZF1基因在野生型和光敏色素突变体中的表达水平,我们发现红光对OsTZF1基因的抑制是由PHYB调控的,与PHYA无关。通过OsTZF1基因的表达器官特异性分析,该基因在水稻的茎和叶中表达量最高,而在胚中表达量最低,据此推测OsTZF1基因在不同器官中作用可能不同。而通过对不同激素的应答反应进行分析,表明水稻OsTZF1基因的表达受外源脱落酸(ABA)的诱导,并受茉莉酸(JA)的抑制。为了进一步了解OsTZF1基因的功能,本文对该基因的过量表达株系的光形态建成特征及对非生物胁迫抗性进行了详细分析。结果表明在表型上OsTZF1蛋白可以影响水稻叶片与叶鞘之间的夹角。并且就抑制胚芽鞘生长而言,OsTZF1基因过表达水稻株系对红光更为敏感,表明OsTZFl基因参与水稻的光形态建成。进一步通过对ABA和JA处理后的WT和过量表达株系进行表型分析发现,OsTZF1基因可以影响水稻ABA代谢途径和应答途径,但可能不会参与JA相关的信号途径。此外OsTZF1基因在水稻耐盐反应中具有重要作用。另外,在本研究中我们还培育了OsTZF1基因的RNAi植株,为进一步分析OsTZF1基因在phyB介导的光反应和水稻生长发育中的作用奠定了基础。

关键词：水稻光敏色素锌指蛋白 OsTZF1 基因基因表达模式功能分析

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甜菜BvSnRK2家族全基因组鉴定及其功能研究

甜菜BvSnRK2家族全基因组鉴定及其功能研究

引用

作者：刘子茜兰州理工大学

学位级别：硕士

甜菜(Beta vulgaris L.)属藜科二年生草本植物,是世界上第二大制糖来源,作为制糖作物具有重要的商业价值。由于气候变化,甜菜受到不利的环境影响,导致减产和质量不高,利用转基因技术对植物进行遗传改良,成为当下快速及有效的方法之一。... 详细信息

甜菜(Beta vulgaris L.)属藜科二年生草本植物,是世界上第二大制糖来源,作为制糖作物具有重要的商业价值。由于气候变化,甜菜受到不利的环境影响,导致减产和质量不高,利用转基因技术对植物进行遗传改良,成为当下快速及有效的方法之一。蔗糖非发酵相关蛋白激酶2(Sucrose non-fermenting-1-related protein kinase 2,SnRK2)是植物特有的,在植物生长发育、抵抗生物和非生物胁迫方面发挥着重要作用。先前已有大量报道记载了对不同作物SnRK2相关功能的研究进展,而对甜菜SnRK2的研究尚未见报道。鉴于此,为探究甜菜SnRK2s家族成员特性及响应非生物胁迫的功能,本论文研究使用生物信息学技术分析了甜菜SnRK2s家族;采用实时定量PCR(qRT-PCR)技术分析不同处理下甜菜不同组织中BvSnRK2s家族成员的表达水平。其次,根据已知序列克隆BvSnRK2s全长cDNA序列,构建超表达载体pEG100-BvSnRK2s,采用农杆菌介导法,将pEG100-BvSnRK2.1导入烟草植株中,以实现所克隆BvSnRK2.1基因的超表达。最后,对转基因植株进行功能分析。主要取得了如下结果:(1)通过对拟南芥模式植物的SnRK2进行同源比对以及保守结构域筛选等方式,在甜菜中共计获得6个SnRK2s基因,且BvSnRK2s的CDS(coding sequence)长度在1008 bp(BvSnRK2.1)至1095 bp(BvSnRK2.6);等电点(Isoelectric point,p I)从4.85～5.73,表明BvSnRK2为酸性;总平均亲水性(Grand average of hydropathicity,GRAVY)均为负值,表明BvSnRK2s蛋白是亲水蛋白。系统发育分析表明,根据是否受ABA诱导,将SnRK2分为组Ⅰ(BvSnRK2.2和-3)、组Ⅱ(BvSnRK2.1和-4)和组Ⅲ(BvSnRK2.5和-6),并且除BvSnRK2.4含8个外显子以外,其余均含有9个外显子,表明BvSnRK2s外显子/内含子结构是相对保守的。启动子顺式作用元件分析,其含有激素相关元件、光响应元件和胁迫响应元件,表明BvSnRK2s可能受不同胁迫的诱导。(2)通过qRT-PCR技术分析了6个BvSnRK2s基因在干旱和盐处理下的表达情况,发现BvSnRK2s在甜菜叶和根中均有所表达。在盐处理下,100 mmol/L NaCl诱导了叶和根中大多数BvSnRK2s基因的上调表达;在干旱处理下,6个基因叶中的表达量相对较高。表明BvSnRK2s在不同处理下的表达在不同的浓度下呈现多种模式。(3)依据甜菜已知序列设计BvSnRK2s不同基因引物,从甜菜中克隆了6个BvSnRK2s基因的CDS序列,并成功构建了6个过表达载体并命名为pEG100-BvSnRK2.1至pEG100-BvSnRK2.6。(4)通过农杆菌介导法获得了T1代过表达BvSnRK2.1的转基因烟草。表型统计表明,在干旱和NaCl处理下,转基因烟草的根系比野生型烟草长。生理实验结果表明,转基因烟草其叶片相对含水量增加、丙二醛含量降低以及叶绿素含量升高等,从而提高转基因烟草的抗逆性。综上所述,本论文研究通过对甜菜SnRK2s基因家族进行生物信息学分析、表达模式分析,通过克隆甜菜6个BvSnRK2s的全长CDS序列以及对转基因烟草进行功能分析,验证了甜菜BvSnRK2.1基因的功能,为培育其他抗逆性更强的作物品种提供一定理论依据。

关键词：甜菜 SnRK2 生物信息学分析基因表达模式基因克隆功能分析

来源：评论

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林烟草CBL基因家族成员NsylCBL10的功能分析

林烟草CBL基因家族成员NsylCBL10的功能分析

引用

作者：董连红中国农业科学院

学位级别：硕士

类钙调神经素B亚基CBL(calcineurin B-like protein)是近年来报道的一类植物所独有的钙感受器蛋白,在植物响应高盐、低钾和干旱等非生物胁迫过程中发挥了重要作用。CBL基因家族在拟南芥、杨树和水稻等植物中已有较广泛的研究,但在烟草... 详细信息

类钙调神经素B亚基CBL(calcineurin B-like protein)是近年来报道的一类植物所独有的钙感受器蛋白,在植物响应高盐、低钾和干旱等非生物胁迫过程中发挥了重要作用。CBL基因家族在拟南芥、杨树和水稻等植物中已有较广泛的研究,但在烟草中至今未见报道。本研究采用同源克隆的方法从林烟草(Nicotiana sylvestris)中获得CBL家族基因Nsyl CBL10,并对该基因的氨基酸序列、基因组序列以及表达特性进行了研究,并通过进一步试验验证Nsyl CBL10参与盐胁迫信号转导过程中的作用。主要内容有以下几个方面:(1)利用同源克隆的策略,从林烟草中获得基因Nsyl CBL10(Genbank number:KF667488.1),该基因CDS序列全长为783 bp,编码一个由260个氨基酸组成的蛋白质,并且该基因的氨基酸序列与拟南芥At CBL10和杨树Pt CBL10相似性很高,共同位于系统发育树的Ⅰ组中。Nsyl CBL10基因组序列全长为3857 bp,含有8个内含子、9个外显子。(2)将Nsyl CBL10蛋白的N端与GFP或Ds Red2蛋白进行融合,构建瞬时表达载体p GDG-Nsyl CBL10和p GDR-Nsyl CBL10,并注射本生烟,通过激光共聚焦显微镜对注射部位的下表皮进行观察,结果表明Nsyl CBL10分布于质膜、细胞质和细胞核中,在细胞中分布广泛。(3)利用实时荧光定量PCR技术,对Nsyl CBL10的组织表达情况进行了分析。发现Nsyl CBL10在盛花期林烟草各组织器官中均有表达,其在腋芽中的表达量最高,其次为茎、花瓣、主根、叶和萼片,在侧根中的表达量相对较低。(4)Na Cl处理时,Nsyl CBL10表达量在短时间内上调,表明Nsyl CBL10可能参与植物响应盐胁迫的信号转导过程。低钾胁迫下,Nsyl CBL10的表达受抑制,表达量下调,该结果与At CBL10在低钾胁迫下的表达情况一致。高温和干旱胁迫下,Nsyl CBL10的表达量呈现波动变化趋势。表明Nsyl CBL10可能参与高盐、低钾、高温和干旱四种胁迫的信号转导过程。(5)表型观察和离子含量测定实验表明在拟南芥中过表达Nsyl CBL10不仅能够恢复拟南芥cbl10盐敏感表型,并且通过调节体内根部和地上部的Na+与K+的分布及均衡来提高转基因拟南芥对高盐胁迫的耐受能力。(6)获得Nsyl CBL10的启动子序列并对其进行了预测分析,发现其含有多种逆境相关转录因子。构建Nsyl CBL10启动子与GUS基因融合的表达载体p BI101-CBL10pro,并将其转化进入烟草,获得转基因烟草植株。

关键词： CBL10 亚细胞定位基因表达模式盐 Na+/K+

来源：评论

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植物激素ABA/GA代谢与响应通路基因表达在秋茄（Kandelia obovata）显胎生过程中的调控作用

植物激素ABA/GA代谢与响应通路基因表达在秋茄（Kandelia obovata...

引用

作者：傅梅萍厦门大学

学位级别：硕士

为深入了解红树植物胎生的分子机制,本研究以显胎生红树植物秋茄(Kandelia obovata)作为研究材料,选取了四个关键时期:S1-胚珠期、S2-线形胚期、S3-种皮打开前和S4-种皮打开后,并将果实分为胚、种皮、果皮三大类组织,进行时间—空间基... 详细信息

为深入了解红树植物胎生的分子机制,本研究以显胎生红树植物秋茄(Kandelia obovata)作为研究材料,选取了四个关键时期:S1-胚珠期、S2-线形胚期、S3-种皮打开前和S4-种皮打开后,并将果实分为胚、种皮、果皮三大类组织,进行时间—空间基因表达差异性研究。对S2-线形胚时期和S3-种皮打开前共五个组织的转录组测序数据进行分析,设置六组比较,其中差异表达基因的KEGG通路富集结果表明:类黄酮等抗逆性物质在胚和种皮内逐渐积累赋予秋茄种子抵抗环境胁迫的能力;光合作用在线形胚内的出现说明胚虽仍为种皮所包被,但仍能进行一定程度的光合作用,进行自主能量积累,促进自身生长;差异基因富集最主要的通路是植物激素信号转导,其中包括ABA和GA激素响应,此外在秋茄胚发育过程中具ABA合成通路基因表达下调现象。ABA/GA比值在种子休眠向萌发状态转变中起重要作用,加上大部分胎生突变体表现为ABA不敏感或ABA合成缺陷的证据,我们认为秋茄的胎生过程受到这一对拮抗激素的共同调控。因此本研究选取ABA/GA代谢通路相关基因共十四个。与ABA相关的是,ABA 合成:KoABA1、KoNCED、KoABA2、KoAA03;ABA 降解:KoCYP707A;ABA 响应:KoPYL9、KoSnRK2.2、KoABI3、KoABI5、KoCHO1;与 GA 相关的是GA合成:KoKS、KoKAO;GA降解:KoGA2ox;GA响应:KoGID1。通过荧光定量PCR方法,获取这些基因的表达模式,并关联其在各个通路中的作用,得到以下结论:(1)非胎生和胎生种子的ABA合成的时期和组织相似。ABA合成的初始阶段仅发生在胚内,但最终合成位点包括胚和种皮,而且ABA的合成随种子的吸胀和萌发呈下降趋势;(2)胎生种子ABA降解发生的时期不同于非胎生的种子。非胎生的种子中ABA的降解被抑制,而胎生种子中ABA的降解基因CYP707A迅速代谢则在胚,特别是种皮中有很高的表达量,维持胎生种子内ABA含量处于低水平状态;(3)GA的活跃位点包括胚轴、种皮和果皮,从促进胚轴生长势和疏松皮类组织两方面协同调控秋茄胚轴的持续生长;(4)低含量的ABA导致ABA/GA比值降低,两类激素的动态平衡构成共同调控网络,可能是导致秋茄胎生现象发生的主要原因。本研究通过对秋茄种子不同发育阶段、不同组织的转录组数据分析,得到ABA/GA是秋茄胎生过程中重要的调控因子的结论。并以此为基础研究ABA/GA合成、降解和响应基因的表达模式,进而构建ABA/GA基因表达时间—空间调控网络,从发育阶段特异性和组织特异性上阐明ABA/GA如何调控秋茄胚胎发育,有利于进一步加深对红树植物胎生分子机制的了解。

关键词：红树植物显胎生现象 ABA GA 基因表达模式

来源：评论

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水稻GASRs的表达模式和功能研究

水稻GASRs的表达模式和功能研究

引用

作者：罗曼华南师范大学

学位级别：硕士

水稻(Oryza sativa)是世界上最重要的粮食作物之一,同时已成为单子叶植物基因组学遗传和功能研究的模式植物。GAST(Gibberellic Acid-stimulated transcript)家族基因是一类受赤霉素(GA)诱导表达基因,在许多植物中被发现报道。水稻GAST-... 详细信息

水稻(Oryza sativa)是世界上最重要的粮食作物之一,同时已成为单子叶植物基因组学遗传和功能研究的模式植物。GAST(Gibberellic Acid-stimulated transcript)家族基因是一类受赤霉素(GA)诱导表达基因,在许多植物中被发现报道。水稻GAST-like同源基因有9个,有关其家族基因成员的功能报道甚少。因此,开展水稻GAST-like家族同源基因成员的功能研究,为阐明水稻在生长、发育过程中的作用机制有重要意义。\n 本论文重点研究水稻4个GAST-like同源基因,分别命名为OsGASR1(GibberellicAcid Stimulated in Rice)、OsGASR2、OsGASR3和OsGASR4。通过半定量RT-PCR研究它们的时空表达模式和激素处理对表达的影响,并通过农杆菌介导法获得相关的水稻RNAi转化株系,初步完成了4个OsGASRs基因的功能分析,得到以下结果:\n 1、初步测定了OsGASR1、OsGASR2、OsGASR3、OsGASR4在不同组织器官的时空表达模式。OsGASR1和OsGASR2在幼苗期的根、茎节和叶中均有表达,进入生殖生长期后主要在孕穗期的幼穗(颖花和花梗)和成熟的颖花中表达。OsGASR3在幼苗期主要在不定根、叶芽和茎节中表达,而孕穗期和抽穗期主要在颖花中表达。OsGASR4在3d-6d幼苗的叶芽、茎节和幼根以及14d的茎节中表达,同时也在孕穗期和抽穗期的颖花中大量表达。OsGASR1和OsGASR4在成熟的叶鞘中有微量表达。4个OsGASRs基因都不在成熟的旗叶中表达。4个OsGASRs在孕穗期至完熟期的茎节间中表达有一定特异性:OsGASR1、OsGASR2和OsGASR3主要在孕穗期的第Ⅰ节间(穗颈节间)和第Ⅱ节间表达；OsGASR4在孕穗期至完熟期的第Ⅰ节间(穗颈节间)和第Ⅱ节间中都有表达。\n 2、OsGASR1对外源赤霉素(GA3)不敏感,OsGASR2和OsGASR4在野生型和d-18幼苗中受GA抑制,但OsGASR3受外源GA3的促进表达。在野生型幼苗中OsGASR1、OsGASR2和OsGASR4受表油菜素内酯(eBL)的抑制,而OsGASR3对eBL不敏感；在d-18突变体幼苗中OsGASR3的表达水平显著低于野生型,外加eBL后表达量上调。OsGASR1、OsGASR2和OsGASR4在d-18突变体颖花中的表达受到GA3促进,但在野生型水稻颖花中受到GA3显著抑制。OsGASR3在野生型颖花中对外源GA3不敏感；但OsGASR3在d-18突变体颖花中表达受到GA3抑制。\n 3、构建RNA干涉表达载体OsGASRs-pRNAi。农杆菌介导水稻遗传转化得到OsGASR3-RNAi转基因植株50株,转化率为6.4％,得到OsGASR4-RNAi转基因植株32株,转化率为4.4％。通过Southern Blot鉴定了T0转基因植株的基因拷贝数。\n 4、RT-PCR检测结果表明,T1代转基因干涉株系3-2、3-4、3-7的目的基因OsGASR3表达量有所降低,同时抑制了同源基因OsGASR2、OsGASR4的表达量；T1代转基因干涉株系4-1、4-4、4-25敲除了目的基因OsGASR4的表达,同时也使OsGASR1表达量下调,对OsGASR2的表达基本没有影响,而对OsGASR3的表达则有轻微上调作用。\n 5、对T1代转基因水稻进行了初步的表型分析。OsGASR3-RNAi和OsGASR4-RNAi植株T1代种子的萌发率都比野生型降低。野生型种子萌发率接近100％,而株系3-4、3-15、3-25、4-1、4-29的萌发率在50％-65％之间,株系3-2、3-7、4-25的萌发率低于50％。OsGASR3-RNAi和OsGASR4-RNAi植株幼苗(10d龄)与野生型相比表现出矮化,平均苗长比野生型缩短约54％；转基因幼苗(10d龄)不定根的数量和长度也比野生型水稻明显减少,6个OsGASR3-RNAi株系不定根平均根长比野生型减少26.7％,平均根数减少32.9％；4个OsGASR4-RNAi株系不定根平均根长比野生型减少41.2％,平均根数减少36.5％。

关键词：水稻基因表达模式 GAST基因生长发育

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巨大侧耳耐高温相关基因的挖掘及单核体杂交育种

巨大侧耳耐高温相关基因的挖掘及单核体杂交育种

引用

作者：骈永茹华中农业大学

学位级别：硕士

巨大侧耳(Pleurotus giganteus)作为典型的耐高温型食用菌,在热区食用菌产业发展和调节食用菌市场供应中具有重要地位。近年来,年平均气温升高和极端高温天气频发,高温已成为限制热区巨大侧耳产业快速发展的首要因素,巨大侧耳的耐高温... 详细信息

巨大侧耳(Pleurotus giganteus)作为典型的耐高温型食用菌,在热区食用菌产业发展和调节食用菌市场供应中具有重要地位。近年来,年平均气温升高和极端高温天气频发,高温已成为限制热区巨大侧耳产业快速发展的首要因素,巨大侧耳的耐高温分子机制解析和优良菌株的选育变得尤为重要。本课题组通过连续五年的规模化栽培,筛选到2株不同温型的巨大侧耳菌株PG46(高温型)和PG79(中温型),构建了巨大侧耳的高温胁迫体系,并在此基础上开展了菌丝体响应高温胁迫的表型变化研究、转录组测序和比较转录组分析,以挖掘与巨大侧耳耐高温差异相关的功能基因,初步解析巨大侧耳的耐高温机制;同时以这2个不同温型的高产优质菌株为亲本,通过单核体杂交育种和分子标记辅助育种技术,创制巨大侧耳新菌株,以期为热区巨大侧耳产业提供耐高温优质新种质。主要实验结果如下: (1)以2个不同温型的巨大侧耳菌株高温胁迫后,菌丝体的恢复生长能力为指标,构建了巨大侧耳的高温胁迫体系:4 d菌龄,40℃胁迫0、4、8、12、18和24 h。基于构建的高温胁迫体系,从宏观及微观形态变化、恢复生长速度、细胞膜受损伤程度、木质纤维素酶活性变化几个层面,全方位探究巨大侧耳菌丝体响应高温胁迫的表型变化。研究发现,高温胁迫后菌落形成明显的高温胁迫后生长圈;菌丝表面变得粗糙皱缩,菌丝尖端膨大变粗,微观形态严重受损;菌丝恢复生长速度逐渐下降,最终PG46在胁迫24 h时不再恢复生长,PG79在胁迫18 h时不再恢复生长;MDA含量和相对电导率均逐渐升高,细胞膜的受损伤程度增加,且PG79的值整体高于PG46,说明PG79的细胞膜受损伤程度更严重;3种木质纤维素降解酶的活性整体呈现下降趋势,说明高温胁迫会导致巨大侧耳对木质纤维素的降解能力减弱。 (2)基于巨大侧耳菌丝体高温胁迫体系和表型变化,对2个菌株40℃胁迫18h的菌丝体进行比较转录组分析。结果表明,高温胁迫后,PG46有2,614个基因发生差异表达,PG79有3,264个基因发生差异表达,说明PG79对高温胁迫的响应更强烈,可能受到更严重的热损伤。对2个菌株的差异表达基因(DEGs)进行表达模式分析,发现与碳水化合物合成和代谢、淀粉和蔗糖代谢、糖酵解、MAPK信号通路、热激蛋白(Hsp)、Dna J、泛素蛋白酶等相关的基因,在2个巨大侧耳菌株中发生共上调/下调表达,可能在巨大侧耳响应高温胁迫中发挥了重要作用;与转录调节、核苷酸结合、金属阳离子结合、跨膜转运、氨基酸代谢、细胞色素P450、C3HC4型锌指蛋白等相关的DEGs,在2个菌株中呈现不同的表达模式,这些基因可能是导致巨大侧耳菌株间耐高温性状出现差异的关键,后续可通过基因功能验证进行深入分析。 (3)为创制巨大侧耳耐高温优质新种质,本研究开展了巨大侧耳的单核体杂交育种和SSR分子标记开发。通过原生质体单核化和单孢分离的手段制备巨大侧耳单核体,共获得26个PG46菌株的单核体,其中7个为A1B1交配型,7个为A2B2交配型;共获得10个PG79菌株的单核体,其中2个为A1B1交配型,6个为A2B2型交配型。基于巨大侧耳的全基因组序列开发了100对SSR分子标记,多态性比例为45%,筛选到能用于PG46和PG79单核体鉴定的SSR引物分别有9对和10对,其中有5对能用于区分PG79单核体的不同交配型,有7对可用于巨大侧耳的杂交子鉴定。多态性引物的开发,大大提高了巨大侧耳遗传育种的效率,对后续巨大侧耳品种鉴别、分子育种等方面具有重要的应用价值;通过单核体杂交育种,成功获得15个巨大侧耳的杂交新种质,结合菌丝体耐高温评价与子实体农艺性状评价等指标,筛选到1株菌丝体耐高温、生育期短、商品性状好的杂交新菌株PGH6。

关键词：巨大侧耳高温胁迫基因表达模式杂交育种 SSR分子标记

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光敏色素调控的一个B-BOX型锌指蛋白基因在水稻生长发育中的作用

光敏色素调控的一个B-BOX型锌指蛋白基因在水稻生长发育中的作用

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作者：赵杰山东师范大学

学位级别：硕士

在比较野生型日本晴水稻（Wide type，WT）和phyB缺陷型突变体水稻的基因表达谱时，我们筛选到一个受光敏色素B（phyB）所介导的红光抑制的B-box型锌指蛋白基因，进化树分析表明，该基因与拟南芥的BBX22基因属于同一个分支，故将其命名... 详细信息

在比较野生型日本晴水稻（Wide type，WT）和phyB缺陷型突变体水稻的基因表达谱时，我们筛选到一个受光敏色素B（phyB）所介导的红光抑制的B-box型锌指蛋白基因，进化树分析表明，该基因与拟南芥的BBX22基因属于同一个分支，故将其命名为OsBBX22b。为了揭示OsBBX22b基因在水稻生长发育中的作用，在本研究中，我们分析了该基因的表达模式、OsBBX22b蛋白质的亚细胞定位、潜在的转录激活活性和可能的相互作用蛋白。同时培育了该基因的过表达水稻株系，并分析了转基因水稻株系的生长发育特征。具体结果如下：（1）对OsBBX22b基因的表达模式分析结果表明，OsBBX22b基因在叶片，特别是旗叶中表达水平非常高，而且OsBBX22b基因的表达受光周期和生物钟调节。据此推测OsBBX22b基因可能参与水稻的光周期反应。通过分析外源激素JA和ABA以及干旱和盐胁迫对OsBBX22b基因表达水平的影响，结果表明JA抑制OsBBX22b基因的表达；ABA瞬时诱导OsBBX22b基因的表达；干旱和盐胁迫均能瞬时抑制OsBBX22b基因的表达。（2）OsBBX22b蛋白的亚细胞定位显示，OsBBX22b定位于细胞核。修饰的酵母单杂实验表明，OsBBX22b（至少在酵母中）具有潜在的转录激活活性（B-box功能域起主要作用）。（3）酵母双杂实验的初步结果表明，OsBBX22b可能与拟南芥的7个转录因子相互作用。（4）红光和远红光脉冲实验表明，与WT相比OsBBX22b-OX株系的胚芽鞘对红光和远红光不敏感，据此推测OsBBX22b可能负调控光敏色素介导的光信号途径。（5）OsBBX22b-OX植株对外源ABA反应结果表明，OsBBX22b-OX株系对外源ABA超敏感，进一步的RT-PCR分析结果表明OsBBX22b可能影响ABA的应答途径。（6）通过比较OsBBX22b-OX株系和WT的表型，我们发现从种子萌发到种子成熟的整个生命周期中，OsBBX22b-OX株系的株高均低于野生型。统计成熟期水稻地上各部分的长度，结果显示转基因水稻的第一节间、第二节间和第四节间长度均小于非转基因水稻，而第三节间和第五节间差异不明显。说明OsBBX22b基因过量表达能够抑制第一节间、第二节间和第四节间延伸。（7）我们发现OsBBX22b基因过表达延迟水稻开花时间。在自然长日条件和温室短日条件下，OsBBX22b-OX株系均比WT的开花时间延迟。QRT-PCR分析OsBBX22b过量表达不影响生物钟核心组分基因的表达，据此推测OsBBX22b基因可能是在生物钟的输出途径上发挥作用。通过比较水稻两种成花素Hd3a和RFT1及其上游基因（Hd1和Ehd1）在转基因株系和WT中的转录水平，我们发现OsBBX22b过量表达抑制开花素Hd3a和RFT1的表达而对开花素上游基因Hd1和Ehd1的表达无影响。据此推测，OsBBX22b通过不同于Hd1和RFT1的途径调控水稻的光周期开花。（8）我们分析了OsBBX22b-OX株系在水稻生长发育不同时期的特征，结果显示，OsBBX22b过量表达导致水稻叶长和穗长抑制、叶面积减少、单株粒数和小花数减少、穗重降低、种子千粒重增加，而OsBBX22b过量表达对幼苗期的叶角大小和叶绿素的积累无影响。（9）通过比较野生型和OsBBX22b过表达转基因（OsBBX22b-OX）株系的基因表达图谱，我们发现OsBBX22b上调185个基因的表达，下调116个基因的表达，其中在OsBBX22b上调的基因，至少有22个具有转录激活活性。QRT-PCR结果证明，OsBBX22b基因过表达能够上调OsbHLH148和OsJAZ1、OsJAZ3、OsJAZ7、OsJAZ11、OsJAZ13基因的表达，据此推测OsBBX22b基因可能参与水稻的JA信号途径。通过上述分析我们初步揭示了OsBBX22b基因在水稻生长发育中的作用。

关键词：水稻光敏色素 B-box锌指蛋白基因表达模式水稻生长发育

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西花蓟马温度耐受性研究及其热激蛋白70基因的克隆与表达

西花蓟马温度耐受性研究及其热激蛋白70基因的克隆与表达

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作者：秦晶扬州大学

学位级别：硕士

西花蓟马Frankliniella occidentalis(Pergande),隶属缨翅目Thysanoptera,蓟马科Thripidae,花蓟马属Frankliniella,是世界性的观赏植物和经济作物上的重要害虫。在全球气候变暖的大背景下,西花蓟马在全球范围内迅速入侵和扩散。为研究... 详细信息

西花蓟马Frankliniella occidentalis(Pergande),隶属缨翅目Thysanoptera,蓟马科Thripidae,花蓟马属Frankliniella,是世界性的观赏植物和经济作物上的重要害虫。在全球气候变暖的大背景下,西花蓟马在全球范围内迅速入侵和扩散。为研究温度对西花蓟马的入侵、分布及种群动态的影响,本研究在实验室条件下对恒温饲养条件的西花蓟马进行高低温胁迫处理,比较分析西花蓟马长期饲养前后的温度耐受性变化;对受温度胁迫后的西花蓟马进行转录组测序,从转录组中获取HSP70(Heat Shock Protein 70,HSP70)基因,对其进行克隆并分析表达模式。本研究从生态和分子水平上分析西花蓟马对温度的耐受性,这为理解其扩散及适应机制提供理论依据,为今后的预测分布及综合治理提供指导。论文主要研究结果如下:1.通过比较西花蓟马不同性别和不同虫态在高低温下暴露1个小时后的成活率,分析长期恒温(26±1℃)饲养后的种群温度耐受性变化。结果表明,在经历长期的恒温饲养后,西花蓟马的雌虫、雄虫和二龄若虫对温度耐受性在一定程度上都有所提高。低温胁迫下,成虫和若虫种群的初始致死低温由-8℃降低到了-11 ℃,雌虫、雄虫和若虫的半致死低温由-12.5、-11.5和-12.8℃分别降低到-13.2、-13.8和-13.3℃;高温胁迫下,成虫和若虫的初始致死高温由33℃上升到37℃,雌虫、雄虫和若虫的半致高温分别上升了 1.1、2.8和3.3℃。2.通过Illumina测序平台对低温(-13℃)、高温(40℃)和常温对照(26℃)处理下的西花蓟马进行转录组测序,组装拼接共获得了 79,516个基因,与Nr(Non-redundant,非冗余)数据库比对,共成功注释28,765个基因。对三个转录组样本进行两两差异基因比较后发现,-13℃CVS26℃转录组中差异表达的基因共有134个,其中上调60个,下调74个;40℃VS26℃转录组中差异表达的基因共有333个,其中上调153个,下调180个;40℃ VS-13℃转录组中差异表达的基因共有230个,上调162个,下调68个。3.基于转录组数据库HSP70s unigene片段信息,采用RT-PCR(Real-time PCR)和RACE(Rapid-amplification of cDNAends)技术,克隆获得3个包含完整开放阅读框(Opening Reading Frame,ORF)的西花蓟马HSP70s基因cDNA序列,分别命名为Fohsp703(KY914546),Fohsc704(KY914547)和Fohsc705(MF377626)。这三条序列全长分别为2,106、3,048 和1,917bp,开放阅读框分别为2,040、2,073 和 1,476 bp,编码679、690和491个氨基酸。不同于已经报道的HSP70s,这三个蛋白分别以APAA、EKKN和GIFL结尾。多序列比对分析发现,FoHSP704和FoHSP705与其它物种HSP70相似性高,FoHSP703与其它物种HSP70相似性偏低。系统进化树分析表明,这三个蛋白与先前研究过的FoHSP70分布在不同的四个支上。通过比对基因组序列和cDNA序列发现,Fohsp703无内含子,Fohsc704和Fohsc705分别含有4个和6个内含子。4.采用qRT-PCR技术研究了西花蓟马Fohsp703和Fohsc704在高低温胁迫和不同性别及发育阶段条件下的表达情况,结果表明高低温胁迫都能诱导这两个基因表达,但表达情况各不相同。低温胁迫条件下,相对于雄虫、蛹和若虫,Fohsp703和Fohsc704在雌虫中的表达水平最高,尤其是在-10、-12和-14 ℃。在高温胁迫条件下,Fohsp703在二龄若虫处于37和39℃时表达水平最高;Fohsc704在成虫中差异不显著,但当蛹处于35℃及二龄若虫处于37 ℃时表达量较高。

关键词：西花蓟马温度耐受性转录组热激蛋白70 基因表达模式

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