菰黑粉菌侵染茭白植株后能够诱导植株茎部膨大形成肉质茎,茭白植株茎部膨大发育期间,茎部顶端生长、花器官发育及茎部木质化分化被显著抑制,可能与IAA(Indole-3-aceticacid)极性运输调节相关的茎部IAA含量变化相关。PIN(Pin Formed)是植物IAA极性运输重要输出载体,其介导的IAA极性运输参与植物生长发育的多个进程调控,包括植物顶端优势、维管发育模式、向性生长、形态建成及器官发育。本研究克隆获得茭白IAA极性运输相关Zl-PINs家族基因,并对其在茭白植株不同组织部位表达进行分析,阐明了菰黑粉菌侵染对茭白茎部Zl-PINs基因的抑制调节作用,明确了其在茎部发育进程中的表达模式,筛选获得在茭白茎部膨大发育中具有重要调节作用的Zl-PIN1c基因。采用PIN1抗体进行免疫荧光杂交,明确了Zl-PIN1蛋白在茭白茎部及须根细胞膜底的定位表达。构建了Zl-PIN1c的过表达遗传转化载体,烟草瞬时表达的亚细胞定位进一步明确了Zl-PIN1c在叶肉细胞中细胞膜及内质网的表达定位;构建并筛选获得了Zl-PIN1s过表达的拟南芥转基因株系,结合外源IAA处理,明确了Zl-PIN1c过表达对拟南芥须根及茎部生长发育的促进作用,比较分析了3个ZlPIN1s基因在拟南芥中的生物学功能表型差异,为后续菰黑粉菌侵染诱导茭白茎部膨大发育期间的IAA极性运输调节模式分析提供技术支撑及理论依据。主要结果如下:一、茭白Zl-PINs基因全长克隆克隆获得茭白Zl-PIN2、Zl-PIN3a,Zl-PIN4及Zl-PIN9基因全长序列,均具有生长素膜转运蛋白特有的Mem_trans结构域。Zl-PIN2 c DNA全长为1554 bp,编码517个氨基酸,与短花药野生稻关系较近,氨基酸序列相似性为90.52%;Zl-PIN3a c DNA全长为1743 bp,编码580个氨基酸,与短花药野生稻关系较近,氨基酸序列相似性为82.42%;Zl-PIN4 c DNA全长为1149 bp,编码382个氨基酸,与乌拉尔图小麦关系较近,氨基酸序列相似性为70.50%;Zl-PIN9 c DNA全长为1287 bp,编码428个氨基酸,与狗尾草关系较近,氨基酸序列相似性为为72.39%。二、Zl-PINs基因在茭白植株中的表达模式分析菰植株组织部位表达分析发现,克隆的Zl-PINs基因中,茎部表达的主要基因是Zl-PIN1a,Zl-PIN1b和Zl-PIN1c,Zl-PIN1c基因在茎部的表达量最高,ZlPIN1c表达量显著高于其他Zl-PIN基因(P<0.05),Zl-PINs主要在茎部和根部表达,在叶片和叶鞘中的表达量较低,初步筛选Zl-PIN1c是茭白茎部生长发育相关的重要基因。菰黑粉菌侵染菰植株后,菰茎部的Zl-PINs基因响应菌丝侵染,Zl-PIN1s基因的表达受到菌丝的显著抑制,可能与后续发育期间茭白植株茎部顶端生长发育抑制相关。两种孕茭表型间的表达模式分析发现,Zl-PIN1c是茭白茎部膨大发育的主要基因,正常茭白茎部膨大发育期间的茎部伸长可能与Zl-PIN1c的恢复表达相关。三、Zl-PIN1s在茭白植株不同组织细胞中的定位分析采用拟南芥PIN1抗体对茎部及须根的组织切片进行免疫荧光杂交检测分析,显微观察发现:茭白植株茎部PIN1s蛋白定位于维管束周围细胞的细胞膜基部,须根分生区细胞中的PIN1s蛋白定位于细胞膜基底部,内质网中也观察到PIN1s蛋白表达。烟草瞬时表达的亚细胞定位分析发现,Zl-PIN1c主要在叶肉细胞的细胞膜及内质网中表达,进一步验证了Zl-PIN1s的免疫荧光定位分析结果,与已报道的At PIN1的定位研究基本一致。四、Zl-PIN1s过表达拟南芥转基因株系筛选及生物学功能分析构建pFGC-Egfp-Zl-PIN1s过表达遗传转化载体,构建并筛选获得过表达ZlPIN1c的拟南芥转基因阳性株系,并对其进行了表达验证分析;通过外源IAA处理,结合转基因拟南芥幼苗根系的生长发育观察,明确了3个Zl-PIN1s基因对拟南芥根长及须根数量的显著促进作用,其中Zl-PIN1c的促进效果最佳;通过地上部分生物学表型观察,分析了Zl-PIN1c过表达对拟南芥植株茎部发育的促进作用,Zl-PIN1c过表达转基因株系的花枝发育优于对照株系,初步阐明了Zl-PIN1c的生物学功能,为其在茭白茎部发育中的调节机制研究奠定了基础。
蓖麻(Ricinus communis L.)属大戟科,蓖麻油是四大不可食用油之一,是重要的工业用油。蓖麻在各种恶劣的土壤环境中都能顽强生长,具有耐旱、耐贫瘠、耐盐碱诸多优点。由于蓖麻基因组信息不完善,其分子机理方面的研究鲜有报道。miR396是...
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蓖麻(Ricinus communis L.)属大戟科,蓖麻油是四大不可食用油之一,是重要的工业用油。蓖麻在各种恶劣的土壤环境中都能顽强生长,具有耐旱、耐贫瘠、耐盐碱诸多优点。由于蓖麻基因组信息不完善,其分子机理方面的研究鲜有报道。miR396是一类保守的内源非编码miRNAs,生长调节因子GRF和GRF互作因子GIF是较为保守的转录因子家族,在调节植物的生长发育和响应生物及非生物胁迫中发挥着至关重要的作用。蓖麻全基因组测序的完成为从分子层面揭开蓖麻miR396-GRF/GIF调控机制奠定了基础。本研究首次在蓖麻全基因组数据中挖掘miR396-GRF/GIF调控网络,并对其进行了系统地分析,得出以下结论:1、根据蓖麻全基因组测序信息,从蓖麻基因组中鉴定得到4个蓖麻miR396家族成员和11个GRF及2个GIF转录因子家族成员。2、RcmiR396可靶向所有的RcGRF成员,其中RcmiR396a和RcmiR396b的靶基因相同。3、10个蓖麻GRF家族成员在不同的组织中均有表达,RcGRF3、RcGRF6和RcGRF10在种子中表达量较高,可能暗示了它们在籽粒发育中发挥作用。4、针对预测到的蓖麻miR396a,构建CRISPR-Cas9敲除载体,尝试对miR396a进行基因编辑。
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