检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：李俊浙江理工大学

学位级别：硕士

多角体基因是家蚕杆状病毒(BmNPV)极晚期表达基因,因其启动子的超高效的启动功能,常被当作昆虫杆状病毒表达系统中启动外源基因表达的启动子,但其高效启动机制还鲜见报道。因此,在前期研究中,我们将多角体启动子序列作为诱饵,利用酵母... 详细信息

多角体基因是家蚕杆状病毒(BmNPV)极晚期表达基因,因其启动子的超高效的启动功能,常被当作昆虫杆状病毒表达系统中启动外源基因表达的启动子,但其高效启动机制还鲜见报道。因此,在前期研究中,我们将多角体启动子序列作为诱饵,利用酵母单杂交筛选出了多种能与多角体启动子相互作用的蛋白因子,包括38K、39K、LEF5、P6.9、ORF60、ORF61、FP25、GP64、V-CATH。为进一步检测上述蛋白因子对BmNPV多角体启动子的调控作用,构建了由BmNPV多角体启动子驱动的萤火虫萤光素酶和家蚕胞质肌动蛋白A3启动子驱动海肾萤光素酶的双萤光素酶检测系统,通过定量检测萤光素酶活性的变化筛选出多角体启动子正调控因子LEF5,负调控因子39K和ORF61,其他因子调控作用不明显。39k同源基因存在于所有鳞翅目昆虫的杆状病毒基因组中,其编码产物为一种磷蛋白。迄今的研究表明,39k基因与病毒基因表达调控有关,但家蚕核型多角体病毒(BmNPV)39k基因对病毒复制和转录的具体调控作用尚不清楚,为了深入了解该基因的功能,我们检测发现39k基因为早期转录基因,利用Red重组技术和Bac-to-Bac系统分别敲除和补回39k基因,构建了39k缺失型病毒39k-ko-Bacmid和修复型病毒39k-re-Bacmid,并分别转染BmN细胞,病毒滴度检测结果显示二者均能产生具有感染活力的病毒粒子,表明39k基因是BmNPV复制的非必需基因,但是该基因的缺失可显著降低病毒滴度。进一步利用荧光定量qPCR技术进行检测,发现39k基因缺失对病毒基因组早期基因组的复制没有显著影响,但在后期会降低病毒基因组的复制水平,并导致病毒各时期基因转录水平的极显著下降(p<0.01)。综上所述,利用双萤光素酶报告基因检测出多角体启动子正调控因子为LEF5,负调控因子为39K和ORF61,进一步研究可知39k基因是BmNPV复制的非必需基因,但该基因的缺失可显著降低病毒各时期基因的转录水平,本研究将为深入了解BmNPV 39k基因对病毒基因组复制、转录的影响奠定基础,同时也将为家蚕杆状病毒表达系统高效转录机制的研究提供新基础。

关键词：家蚕杆状病毒多角体基因启动子结合蛋白 39k基因基因敲除双萤光素酶报告系统

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39K基因对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)复制和转录的影响

引用

农业生物技术学报 2016年第3期24卷 416-425页

作者：李俊张婷张媛媛全滟平舒特俊聂作明于威浙江理工大学生命科学学院浙江省家蚕生物反应器和生物医药重点实验室

39K同源基因存在于所有鳞翅目昆虫杆状病毒基因组中,其编码产物为一种磷蛋白。迄今的研究表明,39K基因与病毒基因表达调控有关,但家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)39K基因对病毒复制和转录的具体调控作用... 详细信息

39K同源基因存在于所有鳞翅目昆虫杆状病毒基因组中,其编码产物为一种磷蛋白。迄今的研究表明,39K基因与病毒基因表达调控有关,但家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)39K基因对病毒复制和转录的具体调控作用尚不清楚。本研究利用Red重组技术和Bac-to-Bac系统分别敲除和回补39K基因,构建了39K缺失型病毒39K-ko-Bacmid和修复型病毒39K-re-Bacmid,并分别转染家蚕(Bombyx mori)细胞系Bm N细胞,发现二者均能产生具有感染活力的病毒粒子,表明39K基因不是Bm NPV复制的必需基因,但是该基因的缺失可显著降低病毒滴度。进一步利用q PCR发现,39K基因缺失对病毒基因组早期基因组的复制没有显著影响,但在后期会降低病毒基因组的复制水平,并导致病毒各时期基因转录水平的极显著下降(P<0.01)。为了进一步了解39K基因对Bm NPV极晚期基因多角体启动子的表达调控作用,本研究构建了由Bm NPV多角体启动子驱动的萤火虫萤光素酶和家蚕胞质肌动蛋白A3启动子驱动海肾萤光素酶的双萤光素酶报告系统,通过定量检测荧光素酶活性的变化情况,证明了39K基因对多角体启动子具有显著的负调控作用。综上所述,可知39K基因不是Bm NPV复制的必需基因,但该基因的缺失可显著降低病毒各时期基因的表达水平,并导致多角体基因启动子的启动活性增强。本研究结果将为深入了解Bm NPV 39K基因对病毒基因组复制、转录的影响奠定基础,同时也将为家蚕杆状病毒(Bombyx mori baculovirus)表达系统高效转录机制的研究提供资料。

关键词：家蚕核型多角体病毒(BmNPV) 39K基因基因敲除双萤光素酶报告系统多角体基因启动子

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